Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Høy gjennomstrømming-måling av Dictyostelium discoideum Macropinocytosis av Flow cytometri

Published: September 10, 2018 doi: 10.3791/58434
Automatic Translation
1, 1
1MRC-Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK

Summary

Macropinocytosis, store uspesifisert væske opptak, er viktig i mange områder av klinisk biologi inkludert immunologi, infeksjon, kreft og nevrodegenerative sykdommer. Her, er eksisterende teknikkene tilpasset tillate høy gjennomstrømning og encellede oppløsning måling av macropinocytosis i macropinocytosis modell organisme Dictyostelium discoideum hjelp flow cytometri.

Abstract

Store uspesifisert væske opptak av macropinocytosis er viktig for spredning av enkelte kreftceller, antigen prøvetaking, verten celle invasjon og spredning av nevrodegenerative sykdommer. De brukte Laboratorium stammene av amoeba Dictyostelium discoideum har ekstremt høy væske opptak priser når dyrket i nærings medium, over 90% som skyldes macropinocytosis. I tillegg finnes mange av de kjente komponentene av pattedyr macropinocytosis også, gjør det en utmerket modellsystem for å studere macropinocytosis. Her er standard teknikken å måle internalisert væske med fluorescerende dekstran som en etikett tilpasset en 96-brønns plate format, med eksemplene analysert av flowcytometri med en høy gjennomstrømming prøvetaking (HTS) vedlegg.

Celler fôres ikke-quenchable fluorescerende dekstran med en forhåndsbestemt tid, vasket av nedsenking i iskalde buffer og frittliggende bruker 5 mM Natriumazid, som også stopper exocytosis. Celler i hver brønn er deretter analysert av flowcytometri. Metoden kan også tilpasses til å måle membran opptak og fagocytose fluorescerende perler eller bakterier.

Denne metoden ble utviklet for å tillate måling av væske opptak av Dictyostelium på en høy gjennomstrømming, arbeid og ressurs effektiv måte. Det tillater samtidig sammenligning av flere stammer (f.eks knockout mutanter med et) (f.eks celler i ulike medier eller behandlet med ulike konsentrasjoner av hemmer) parallelt og forenkler tid-kurs.

Introduction

Store uspesifisert væske opptak av macropinocytosis er viktig i flere biologiske sammenhenger1, inkludert antigen prøvetaking av immunsystemet cellene2, patogen inn i verten cellene3, kreft celle spredning4 og spredning av prion sykdommer5. I pattedyr og Dictyostelium celler, begrepsordbok6,7, PI (3,4,5) P38,9,10 (selv om lipid nøyaktig hva er forskjellig mellom de to11), aktivert RAS12,13og aktivert Rac14,15 er viktige for effektiv væske opptak av macropinocytosis, selv om det fortsatt er mange ubesvarte spørsmål om hvordan macropinocytic oppdateringen er dannet, organisert og til slutt internalisert. Oppdage flere proteiner viktig for macropinocytosis og påfølgende fastsetting av hvordan de er viktige i ulike biologiske sammenhenger, vil gi en mer omfattende forståelse av macropinocytosis og tillate utviklingen av målrettet behandling for en rekke forhold.

Dictyostelium er en ideell modellsystem for å studere macropinocytosis. Det høye nivået av grunnleggende macropinocytosis i standard laboratorium stammer betyr at væske opptak er over 90% på grunn av macropinocytosis6. Dette gjør at macropinocytosis skal måles av bestemme væske opptak, i motsetning til pattedyrceller der væske opptak på grunn av macropinocytosis er mye lavere. Som macropinocytosis er så godt definert og lett visualisert12 i dette systemet tilbyr klare fordeler for å undersøke kjernen bevarte komponenter i macropinosome over andre systemer der det kan være flere regulatoriske signaler 16 , 17.

Standard teknikken brukes til å måle macropinocytosis av pattedyrceller innebærer feste cellene etter pulserende med dekstran for en kort periode etterfulgt av mikroskopi å avgjøre området for en celle som er okkupert av dekstran-positive blemmer18. Denne teknikken høyde ikke men for at macropinosomes reduseres ved å skrive inn cellen, som har blitt rapportert i Dictyostelium19, og bare tar hensyn enkelt fly i cellen, betyr volumet internalisert er uklart. En alternativ teknikk, av opptellingen antallet av macropinosomes internalisert i en gitt tid, har de samme downsides20. Bruke Dictyostelium unngår disse spørsmålene; men er eksisterende teknikker for måling av væske opptak av Dictyostelium relativt arbeidsintensiv, bruker en stor mengde både celler og dekstran21. Celler er rystet på høy tetthet i fluorescerende dekstran og prøver fjernet på ulike tidspunkt for fastsettelse av internalisert fluorescens ved hjelp av en fluorimeter. Celler som er forberedt på denne måten kan analyseres av flowcytometri å få enkelt celle, i stedet for populasjon-nivå, oppløsning22, selv om dette fortsatt lav gjennomstrømming.

Her er standard teknikken å måle internalisert væske med fluorescerende dekstran som en etikett tilpasset en 96-brønns plate format, med eksemplene analysert av flowcytometri med en høy gjennomstrømming prøvetaking (HTS) vedlegg. Celler fôres ikke-quenchable fluorescerende dekstran med en forhåndsbestemt tid, vasket av nedsenking i iskalde buffer og frittliggende bruker 5 mM Natriumazid, som også stopper exocytosis. Celler i hver brønn er deretter analysert av flowcytometri. Denne metoden ble utviklet for å overvinne begrensningene til metodene ovenfor og tillate samtidig sammenligning av væske opptaket av store antall stammer/forhold mens bruker færre ressurser og redusere arbeidskraft involvert.

Protocol

1. forberedelse av celler og materialer

  1. Dyrke celler på SM agar plater i forbindelse med bakterier som Klebsiella aerogeneseller næringsstoffer medium som HL5 som beskrevet23.
    Merk: Voksende knockout mutanter som er defekt i macropinocytosis på bakterier forhindrer akkumulering av sekundær mutasjoner som kan øke hastigheten på macropinocytosis. Holde passasje nummeret under 4 etter plating celler fra aksjer for optimale resultater. Mutanter bør lagres som frosne aksjer så snart som mulig etter isolasjon.
  2. For å dyrke celler på SM agar plater, vokse K. aerogenes til samløpet i SM medium. Tilsett 200-300 μL av bakterier på en SM agar plate og spredt. Ta en steril løkke av celler (ved overføring fra en annen bakteriell plate) og spredt på en kanten av tallerkenen. Ruge på 22 ° C i opptil en uke.
  3. Oppløse Tetra-metyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC-) dekstran til 50 mg/mL i vann, filtrere bruke 0.22 μm filtre i 1 mL dele og lagre på 20 ° C. Dele kan holdes på ubestemt tid.
    Merk: 155 kDa er vanlig størrelse brukes med denne metoden, som det kan kjøpes billig i bulk, men mindre dextrans måle macropinocytosis like effektivt i Dictyostelium24. Ulike ikke-quenchable dextrans, som gjennomgripende blå eller Alexa-647, er alternativer hvis forskjellige fluorophores.

2. konvertere kvalitative mål i kvantitative (valgfritt)

  1. Utføre en væske opptaksanalyse bruke celler i suspensjon.
    1. Pellets axenically voksende cellene på 300 x g for 3 min, forkaste nedbryting og resuspend i nærings medium til 1 x 107 celler/mL. Legge til TRITC-dekstran 0,5 mg/mL og riste på 180 rpm, 22 ° C.
    2. Fortynne 0,8 mL prøver til 0,7 mL av iskalde KK2 på 0, 30, 60, 90, 120 min. vask en gang i 1,5 mL iskald KK2 buffer23 i en Borstemmaskin sentrifuge, resuspend til 1 mL i samme bufferen og lagre på is.
      Merk: vask umiddelbart eller når alle prøver er samlet gir tilsvarende resultater.
  2. Bestem volumet av væske internalisert av cellene.
    1. Angi fluorimeter å måle fluorescens bruker en eksitasjon bølgelengden til 544 nm og utslipp Bølgelengden av 574 nm med et 10 nm slit. Definere en fortynning rekke TRITC-dekstran og bruke den til å måle fluorescensen for gitt av dekstran. Opprette en kalibreringskurven.
    2. Måle fluorescens internalisert cellene i Seksjon 2.1 bruker 0.9 mL av cellen suspensjon. Beregne volumet av væske internalisert per celle med kalibrering kurve24.
  3. Tynn ut resten av cellene fra hvert punkt separat i 0,5 mL isen kalde KK2. Filtrere gjennom en 70 µm celle sil i 5 mL polystyren flyt cytometri rør. Angi flyten cytometer slik at celler fra hvert punkt er atskilt fra hverandre og registrere sine fluorescens (se avsnitt 3.4 og 3,5).
  4. Måle fluorescens av kalibrering perlene i flyt cytometer med innstillingene ovenfor og spille den.
    Merk: Dette er referansen for alle fremtidige fluorescens målene på flyt-cytometer: før du bruker igjen kjøre perler og justere innstillingene slik at de har den samme fluorescensen. Dette vil gi en svært smale definerte topp. Putting en port rundt fluorescens toppen kan gjøre dette enklere.
  5. Repeter tre ganger og tegne cellen fluorescens dataene innhentet i 2.2 og 2.3 mot hverandre. Tegne en linje for beste tilpasning og bruke ligningen konvertere kvalitative data fra flowcytometri i kvantitative enheter.

3. måle væske opptak

Figure 1
Figur 1: skjematisk av høy gjennomstrømming-måling av macropinocytosis. (A) vokse Dictyostelium på en SM plate seeded med K. aerogenes bakterier (gul). Høste celler fra fôring foran (oransje), unngå celler som allerede er utviklet (grønn), i 25 mL KK2 bufferen. Vortex å oppheve tilknytningen, pellets med 3 min sentrifugering på 300 x g, deretter vaske 3 ganger i 50 mL av KK2 buffer, forkaster nedbryting hver gang. Resuspend til 1 x 105 celler/mL i HL5 vekst medium og Legg 50 µL i tre brønner per prøve av en flat bunn 96-brønns plate. Ruge på 22 ° C for 24 h. (B) fortynnet TRITC-dekstran til 1 mg/mL i HL5 vekst medium fra en lager løsning av 50 mg/mL. Legge til 50 µL hvert utvalg (unntatt 0 min opptak kontroll brønnene) og ruge på 22 ° C for 1 h, etter som legge til dekstran til 0 min opptak kontrollen. (C) umiddelbart Dekanter media, klappe plate på en vev å fjerne overflødig medium og dukke i et badekar med iskald KK2 buffer, fylle brønnene å vaske. Dekanter bufferen og tørk igjen. Legg 100 µL av 5 mM Natriumazid oppløst i KK2MC koble cellene. Ta for å strømme cytometer for måling av internalisert fluorescens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Definere en flat bunn 96-brønns vev-kultur plate (figur 1A). Celler vokst bakterier og overføre dem til HL5 medium (som inneholder 100 µg/mL dihydrostreptomycin, 100 µg/mL ampicillin og 50 µg/mL kanamycin) 24 timer før analysen; Dette kan macropinocytosis være upregulated fra de lave nivåene sett i celler dyrket på bakterier24. Alternativt fortynne celler direkte fra axenic kultur, rugende for 24 timer før analysen, å redusere feil skyldes at cellene blir fortynnet fra forskjellige tettheter.
    1. Høste celler fra fôring foran i 25 mL av KK2 i en 50 mL sentrifuge rør. Distansere celler av vortexing og pellet på 300 x g for 3 min. Forkast nedbryting, resuspend pellet og vask 3 ganger på 300 x g for 3 min i 50 mL av KK2, forkaster nedbryting hver gang du fjerner bakterier.
    2. Bestemme cellen tetthet (benytter en hemacytometer eller annen celle teller system) og fortynne i HL5 som inneholder antibiotika til 1 x 105 celler/mL. Pipetter 50 μL i hver brønn, med tre brønner for hver tilstand. Ruge på 22 ° C for 24 h. Husk å sette opp en 0 min opptak kontroll.
      Merk: En alternativ middels, f.eks SIH, VL6 kan brukes i stedet.
  2. Veieceller med TRITC-dekstran (figur 1B).
    1. Fortynn dekstran til 1 mg/mL i mediet som brukes (dette kan økes til 2,5-5 mg/mL ved fastsetting celler med svært lav opptak). Tilsett 50 μL hver brønn (gi en endelig konsentrasjon på 0,5 mg/mL TRITC-dekstran) og returnere platen til 22 ° C 1t, som kan betydelig dekstran akkumulering men exocytosis av dekstran har ennå ikke begynt.
      Merk: en repeater pipette lar dette trinnet gjøres raskere, redusere feil.
  3. Forberede celler flowcytometri (figur 1 c).
    1. Umiddelbart før vasking, legge til 50 μL dekstran inneholder medier til 0 min opptak kontrollene.
    2. Dekanter mediet og tørk på en vev. Vask av submerging platen i iskalde KK2, deretter Dekanter.
      Merk: noen stammer med tilslutning defekter kan bli koblet i dette trinnet, f.eks en knockout av både homologs av Talin (talA-/ talB -)25. Vær forsiktig når du arbeider med linjer som feste dårlig og Sug opp media hvis nødvendig.
    3. Tilsett 100 μL av iskalde 5 mM Natriumazid oppløst i KK2MC (KK2 + 2 mM MgSO4 og 100 μM CaCl2).
      FORSIKTIG: Natriumazid er svært giftig. Bruk en støvmaske og vernebriller når du arbeider med pulver. Bruk alltid vernehansker og Laboratoriefrakk. Unngå varme og må ikke blandes med syre.
      Merk: Cellene koble raskt og exocytosis er forhindret24. Et mikroskop kan brukes å sjekk denne.
  4. Mål væske opptak av flowcytometri
    1. Hvis konvertere relative verdier til absolutt de, bruk perler for å standardisere flyt cytometer innstillinger (se avsnitt 2). Alternativt, bruk celler lastet med dekstran som i avsnitt 2 slik at frem scatter og siden scatter er angitt riktig isolere celler (figur 2A), sikre maskinen ikke er blokkert, (figur 2B) og justere parametere til måle den internalisert fluorescensen (figur 2C).
    2. Knytter høy gjennomstrømming direkte og legger til plate. Definere en protokoll å måle fluorescensen (for TRITC-dekstran bruker en gul-grønn laser å opphisse og måle i 582 nm kanalen eller lignende) med opptil 65 μL den cellen suspensjon og kjører.
  5. Analysere flyt cytometri resultater
    1. Gate på cellene frem scatter og siden xy (figur 2A). Beregne medianen fluorescens cellene alternativet statistikk. Angi disse parameterne med ett utvalg og gjelder alle prøvene.
      Merk: Fremover scatter/side scatter profilene kan variere mellom eksempler Når du bruker forskjellige mutanter eller hemmere.
    2. Bestemme gjennomsnittet av de tre brønnene for hvert vilkår og trekk fra 0 min opptak kontrollen. Enten konvertere til kvantitative verdier ved hjelp av formelen som er fastsatt i § 2 eller normalisere til kontrollen.

4. ytelse væske opptak tid-kurs

  1. Angi celler som del 3, med tre brønner for hvert punkt og belastninger/tilstand.
  2. Legg dekstran merket medium til forskjellige brønnene sekvensielt. En typisk tid-kurs måler væske opptak på 0, 30, 60, 90, 120 og 180 min. legge dekstran som inneholder mediet 180 min tidspunkt brønner, fulgte 60 min senere ved å legge det til brønnene for 120 min tidspunktet, etc. (figur 3A).
  3. 0 minutter, tilsett 50 μL av dekstran som inneholder mediet og umiddelbart Dekanter og vaske platen i Seksjon 3.3. Analysere som beskrevet i Seksjon 3.5.

5. dose svar kurver

  1. Definere celler som beskrevet i del 3, med tre brønner for hver stamme og tilstand.
  2. Fortynne sammensatt interesse i medium som inneholder 1 mg/mL dekstran på dobbel ønsket maks endelige av sammensatt. Forberede en andre rør som inneholder medium med dekstran med samme andelen kjøretøy som først. Vortex å blande.
  3. Opprette en fortynning serie sammensatte interesse 200 μL dekstran som inneholder mediet per prøve (figur 4A). Vortex å blande. Tilsett 50 μL av mediet hver prøve for 1 h.
  4. Vask og analysere som beskrevet i Seksjon 3.3 og utover.

6. fagocytose og membran opptak

  1. For å måle membran opptak, forberede cellene som beskrevet i del 3. Tilsett 50 μL av medium som inneholder 20 μM FM 1-43 for en siste konsentrasjon av 10 μM. Etter lasting, vask og forberede celler flowcytometri i Seksjon 3.3. Mål for 585 nm-kanalen eller lignende, bruke en blå laser for å opphisse.
    Merk: Membranen menneskehandel er raskere enn væske-fase, 10 min er et mer passende tidspunkt å bruke enn 1 h26. Alternative fargestoffer som fluoresce bare når innlemmet i membranen kan brukes i stedet.
  2. Bruk fluorescently merket perler eller bakterier for å måle fagocytose. Fluorescerende gjær kan ikke brukes som de er uatskillelig fra Dictyostelium av fremover og siden scatter24. Angitt celler som beskrevet i del 3 og analysere som beskrevet27.
    1. For å måle fagocytose av perlene legge til gul-grønne merket perler som beskrevet i del 3.2 til en siste konsentrasjon 5 x 107 perler/mL (1,75 og 2 μm) eller 1 x 108 perler/mL (1 og 1,5 μm) 1t før vask og forbereder flowcytometri som i Seksjon 3.3. Mål for 525 nm-kanalen eller lignende, bruke en blå laser for å opphisse.
      Merk: Høyere konsentrasjoner vil føre til celle avdeling.
    2. For å måle fagocytose bakterier, kan du legge til Texas-rød merket Escherichia coli bioparticles som beskrevet i del 3.2 1 x 108 bakterier/mL 1t før vask og forberede for flowcytometri i Seksjon 3.3. Mål for 610 nm-kanalen eller lignende, med en gul-grønn laser for å opphisse.

Representative Results

Når teknikken er utført og cellene er lastet med dekstran og klar for analyse (figur 1), sikre flyt-cytometer ikke er blokkert, og justere frem scatter/side scatter profilen å ligne cellene som vist i figur 2A. Hvis maskinen er blokkert, det ser mer ut som vist i figur 2B og må oppheves før du fortsetter. Sikre parameterne vise kontroll axenic celler har høy internalisert dekstran fluorescens på lengre tidspunkt og lav internalisert fluorescens på kortere seg (figur 2C).

Når du ser på forskjellene mellom mutanter, er det sannsynlig at det vil være en av tre fenotyper. Mutanter kunne ha normal væske opptak, de kunne ha en delvis defekt eller væske opptak kan bli helt nedlagt. Figur 2D viser en stamme med normal væske opptak, i dette tilfellet standard laboratorium belastningen Ax2, en mutant ~ 50% nedgang i væske opptak (Ax2 rasG-14) og ett med avskaffet væske opptak (Ax3 gefB-28). Få gjennomsnittlig median væske opptaket (inndelingen 3,5) og bruke den til å beregne volumet av væske internalisert (som i figur 3B) eller sammenligne data til en kontroll (som i figur 4B og 4 C).

Når du utfører en væske opptak tid kurs, som i figur 3A, internalisert fluorescens bør øke i 60-90 min, etter som dekstran begynner å bli exocytosed og et platå nås (figur 3B). Bruker 60 min som standardtid når sammenligne macropinocytosis i ulike mutanter/forhold derfor gjør et godt signal skal oppnås, og ingen signal er tapt på grunn av exocytosis. Mutanter der exocytosis er alvorlig hindret kan ta lengre tid å nå en platå29.

Når behandling av celler med hemmere som er effektiv mot macropinocytosis i Dictyostelium (definert i figur 4A), dekstran internalisert i 1t går ned til nesten ingenting på høyere hemmer konsentrasjoner i fleste tilfeller (Figur 4B). Noen hemmere kan ikke være 100% effektiv, men f.eks nocodazole bare hemmer opptil 50% av væske opptak av macropinocytosis når lagt akutt (figur 4C). Hvis hemmere ikke effektive, cellene vil internalisere like mye av dekstran som kontroll, og en nedgang i fluorescens vil ikke bli sett. Denne teknikken tillater et stort utvalg av forskjellige hemmere og hemmer konsentrasjoner å bli vist for effekter på væske opptak av macropinocytosis raskt, redusere tiden optimalisere hemmer behandling.

Figure 2
Figur 2: Sett opp med strømmen cytometer og representant data. (A) frem scatter (FSC) og scatter (SSC) sidelister celleområde bør angis slik at cellene kan lett skilles. Et eksempel på hvordan Ax2 celler skal se vises. (B) hvis flyt-cytometer er blokkert, som i dette eksemplet cellene har svært lav side scatter. Laser vil ikke opphisse fluorophores riktig og maskinen skal oppheves før du fortsetter. Data innhentet mens maskinen ble blokkert bør forkastes. (C) fluorescensen bør settes slik at et 0 min opptak utvalg har lav fluorescens, noe som øker når celler har blitt ruget for lengre i fluorescerende medium, som vist i dette eksemplet tatt fra Williams & Kay 201824. (D) eksempler på celler som har blitt ruget med TRITC dekstran 1t med normal macropinocytosis (Ax2, grønn), redusert macropinocytosis (Ax2 rasG -, HM172614, oransje) og avskaffet macropinocytosis (Ax3 gefB -, HM177628, blå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: utfører væske opptak tid-kurs i 96-brønnen plater. (A) dekstran skal legges til hvert sett av prøver sekvensielt, med samme finish tid. Deretter vaske brønnene, løsne og måle den internalisert fluorescensen av flowcytometri. Eksempel ganger til dekstran vises her. (B) væske opptak tid-retters celleområde Ax2 utført i 96-brønnen plater. Tatt fra Williams & Kay 201824, viser standardfeilen til tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: væske opptak dose svar kurver. (A) legge til sammensatt av interesse, i dette tilfelle PI3K hemmer LY294002, til HL5 som inneholder 1 mg/mL TRITC-dekstran på dobbel . ønsket endelige maks.. Bland med HL5 vekst medium + 1 mg/mL dekstran som inneholder kjøretøy alene i forskjellige proporsjoner for å generere en fortynning rekke 200 µL medium per betingelse. Legge til brønner som normalt 1t før vask og måle internalisert fluorescens. (B) væske opptak dose respons kurve for Ax2 celler inkubert med LY294002 som inneholder mediet fra A. Tilpasset fra Williams og Kay 201824. Flytende opptak er normalisert en ubehandlet kontroll. Viser standardfeilen til tre uavhengige eksperimenter. (C) væske opptak dose respons kurve for Ax2 celler inkubert med nocodazole. Tilpasset fra Williams og Kay 201824. Flytende opptak er normalisert en ubehandlet kontroll. Viser standardfeilen til tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Mens andre metoder for å vurdere væske opptak er lav overføringshastighet, vasking av celler i situ og bruk av Natriumazid koble celler er kritisk trinnene i denne metoden, som gir høy gjennomstrømming-måling av macropinocytosis, membran opptak, eller fagocytose av Dictyostelium. Som cellene er koblet til en overflate og mediet er ikke, kan de venstre knyttet mens mediet rundt dem er først kastet av og deretter endres ved nedsenkning i bufferen og kastet ut igjen. Natriumazid, som reduserer mobilnettet ATP og depolarizes membran30, brukes deretter koble cellene, og forhindrer også exocytosis uten å påvirke celle levedyktighet24.

Mens bruker flowcytometri til å måle macropinocytosis av Dictyostelium gir en svært nøyaktig måling av væske opptak svært raskt for å etablere grunnen til hvorfor en bestemt stamme eller tilstand har endret væske opptak, videre etterforskning bruker mikroskopi er nødvendig24. Det bør også bemerkes at tidligere publiserte resultatene har, i noen tilfeller vises en forskjell i væske opptak av mutant stammer vokst enten på en overflate (som i dette tilfellet), eller i risting suspensjon (som standard protokoll)31. Denne metoden kan bety, i sjeldne tilfeller, tilsynelatende flytende opptak defekter er savnet. I tillegg når du måler fagocytose, kan bare lave konsentrasjoner av partikler brukes. Den maksimale hastigheten på fagocytose som kan fastslås med denne teknikken er langt under det virkelige maksimalt, men det er fortsatt mulig å måle relevante forskjeller i fagocytose mellom stammer og betingelser24. For å bestemme den maksimale hastigheten på fagocytose, må opptak måles i risting suspensjon av en alternativ protokollen27. Celler som har phagocytosed perler har økt siden scatter, så dette bør korrigeres tilsvarende når flyt-cytometer.

Flowcytometri kan brukes til å måle væske opptak i pattedyrceller32, men høyere andelen væske fase opptak av andre endocytic veier enn sett i Dictyostelium er en bekymring. I tillegg er cellene vanligvis koblet med trypsin på 37 ° C, slik endocytic progresjon av internalisert dekstran. Iskald Natriumazid medfører ikke makrofager koble fra en overflate (Williams, upublisert observasjon), gjør denne teknikken ikke gjelder pattedyrceller uten ytterligere optimalisering.

Høy gjennomstrømning måling av macropinocytosis har potensial til å bli brukt til skjermen raskt og billig for virkningene av hemmere, genetisk mutasjon eller genet knockdown på Dictyostelium celler. Mutanter bør alltid være i forhold til deres direkte foreldre bare. Hvis leseren har ingen tidligere innstilling for Dictyostelium belastning, ikke-axenic belastninger DdB eller NC4 er mer "wild-type" enn axenic og kan manipuleres så effektivt som axenic stammer33. Ellers Ax2 stammer er den axenic stammer med den færrest genomet duplikasjoner34, mens mange stammer av Ax4 Talin A fortrenging og bør unngås hvis mulig23. Mest tidligere publiserte stammer kan bestilles fra Dicty lager Center35.

Denne teknikken tillater større undersøkende muligheter enn tidligere mulig på virkningene av ulike forhold, hemmere og mutasjoner på macropinocytosis av Dictyostelium.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Medisinsk Forskningsråd UK for kjernen midler (U105115237) til RRK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LSR_II flow cytometer BD Biosciences - Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD
TRITC-dextran (155 kDa) Sigma-Aldrich T1287 Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine
HL5 medium Formedium HLGCFG
96-well tissue culture plate Corning 3596 Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work
Dihydrostreptomycin sulfate Sigma-Aldrich PHR1517
Ampicillin sodium Formdium AMP50
Kanamycin monosulfate Sigma-Aldrich 60615
Sodium azide VWR 103694M
Magnesium sulfate hydrate VWR 25169.295
Calcium chloride dihydrate VWR 1.02382.0250
Potassium dihydrogen phopshate VWR 1.04877.1000
Di-potassium hydrogen phosphate VWR 1.05104.1000
Fluorimeter Perkin-Elmer LS 50 B
FM1-43 Thermofisher T35356
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 µm Polysciences 15702-10
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 µm Polysciences 09719-10
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 µm Polysciences 17687-5
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 µm Polysciences 09847-5
Texas Red E. coli bioparticles Thermofisher E2863
Flow-set fluorospheres Beckman Coulter 6607007 Calibration Beads
SM agar Formedium SMACFG
0.22 µm syringe filter Elkay Laboratory Products E25-PS22-50S
10 mL Syringe Becton Dickinson 302188
Round-bottom polystyrene tubes Corning 352058 Use a tube that will fit onto your flow cytometer.
70 µm cell strainer Falcon 352350
50 mL centrifuge tube Sarstedt 62.547.004
Repeating pipette Eppendorf M4-SK
5 mL repeating pipette tips Eppendorf 30089650
DMSO Sigma-Aldrich D2650-100ML
LY294002 Cayman Chemical Company 70920
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404-2MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bloomfield, G., Kay, R. R. Uses and abuses of macropinocytosis. Journal of Cell Science. 129 (14), 2697-2705 (2016).
  2. Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182 (2), 389-400 (1995).
  3. Hardt, W. D., Chen, L. M., Schuebel, K. E., Bustelo, X. R., Galan, J. E. S. typhimurium encodes an activator of Rho GTPases that induces membrane ruffling and nuclear responses in host cells. Cell. 93 (5), 815-826 (1998).
  4. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
  5. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (9), 3548-3553 (2011).
  6. Hacker, U., Albrecht, R., Maniak, M. Fluid-phase uptake by macropinocytosis in Dictyostelium. Journal of Cell Science. 110, 105-112 (1997).
  7. Dowrick, P., Kenworthy, P., McCann, B., Warn, R. Circular ruffle formation and closure lead to macropinocytosis in hepatocyte growth factor/scatter factor-treated cells. European Journal of Cell Biology. 61 (1), 44-53 (1993).
  8. Buczynski, G., et al. Inactivation of two Dictyostelium discoideum genes, DdPIK1 and DdPIK2, encoding proteins related to mammalian phosphatidylinositide 3-kinases, results in defects in endocytosis, lysosome to postlysosome transport, and actin cytoskeleton organization. Journal of Cell Biology. 136, 1271-1286 (1997).
  9. Araki, N., Johnson, M. T., Swanson, J. A. A role for phosphoinositide 3-kinase in the completion of macropinocytosis and phagocytosis by macrophages. Journal of Cell Biology. 135 (5), 1249-1260 (1996).
  10. Araki, N., Egami, Y., Watanabe, Y., Hatae, T. Phosphoinositide metabolism during membrane ruffling and macropinosome formation in EGF-stimulated A431 cells. Experimental Cell Research. 313 (7), 1496-1507 (2007).
  11. Clark, J., et al. Dictyostelium uses ether-linked inositol phospholipids for intracellular signalling. The EMBO Journal. 33 (19), 2188-2200 (2014).
  12. Hoeller, O., et al. Two distinct functions for PI3-kinases in macropinocytosis. Journal of Cell Science. 126, 4296-4307 (2013).
  13. Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins. Science. 233 (4768), 1061-1068 (1986).
  14. Veltman, D. M., et al. A plasma membrane template for macropinocytic cups. Elife. 5, e20085 (2016).
  15. West, M. A., Prescott, A. R., Eskelinen, E. L., Ridley, A. J., Watts, C. Rac is required for constitutive macropinocytosis by dendritic cells but does not control its downregulation. Current Biology. 10 (14), 839-848 (2000).
  16. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109, 2731-2739 (1989).
  17. Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
  18. Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).
  19. Clarke, M., Kohler, J., Heuser, J., Gerisch, G. Endosome fusion and microtubule-based dynamics in the early endocytic pathway of Dictyostelium. Traffic. 3, 791-800 (2002).
  20. Pacitto, R., Gaeta, I., Swanson, J. A., Yoshida, S. CXCL12-induced macropinocytosis modulates two distinct pathways to activate mTORC1 in macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 101 (3), 683-692 (2017).
  21. Rivero, F., Maniak, M. Quantitative and microscopic methods for studying the endocytic pathway. Methods in Molecular Biology. , 423-438 (2006).
  22. Bacon, R. A., Cohen, C. J., Lewin, D. A., Mellman, I. Dictyostelium discoideum mutants with temperature-sensitive defects in endocytosis. Journal of Cell Biology. 127, 387-399 (1994).
  23. Basu, S., Fey, P., Jimenez-Morales, D., Dodson, R. J., Chisholm, R. L. dictyBase 2015: Expanding data and annotations in a new software environment. Genesis. 53 (8), 523-534 (2015).
  24. Williams, T. D., Kay, R. R. The physiological regulation of macropinocytosis during Dictyostelium growth and development. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
  25. Tsujioka, M., et al. Overlapping functions of the two talin homologues in Dictyostelium. Eukaryotic Cell. 7 (5), 906-916 (2008).
  26. Aguado-Velasco, C., Bretscher, M. S. Circulation of the plasma membrane in Dictyostelium. Molecular Biology of the Cell. 10, 4419-4427 (1999).
  27. Sattler, N., Monroy, R., Soldati, T. Quantitative analysis of phagocytosis and phagosome maturation. Methods in Molecular Biology. 983, 383-402 (2013).
  28. Wilkins, A., Chubb, J., Insall, R. H. A novel Dictyostelium RasGEF is required for normal endocytosis, cell motility and multicellular development. Current Biology. 10, 1427-1437 (2000).
  29. Thomason, P. A., King, J. S., Insall, R. H. Mroh1, a lysosomal regulator localized by WASH-generated actin. Journal of Cell Science. 130 (10), 1785-1795 (2017).
  30. van Duijn, B., Vogelzang, S. A., Ypey, D. L., van der Molen, L. G., van Haastert, P. J. M. Normal chemotaxis in Dictyostelium discoideum cells with a depolarized plasma membrane potential. Journal of Cell Science. 95, 177-183 (1990).
  31. Novak, K. D., Peterson, M. D., Reedy, M. C., Titus, M. A. Dictyostelium myosin I double mutants exhibit conditional defects in pinocytosis. Journal of Cell Biology. 131, 1205-1221 (1995).
  32. Mercer, J., Helenius, A. Vaccinia virus uses macropinocytosis and apoptotic mimicry to enter host cells. Science. 320 (5875), 531-535 (2008).
  33. Paschke, P., et al. Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum. PLoS One. 13 (5), e0196809 (2018).
  34. Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum. Genome Biology. 9 (4), R75 (2008).
  35. Fey, P., Dodson, R. J., Basu, S., Chisholm, R. L. One stop shop for everything Dictyostelium: dictyBase and the Dicty Stock Center in 2012. Methods in Molecular Biology. 983, 59-92 (2013).

Tags

Biologi problemet 139 Dictyostelium discoideum flowcytometri macropinocytosis høy gjennomstrømming endocytose encellede oppløsning flytende opptak
Høy gjennomstrømming-måling av <em>Dictyostelium discoideum</em> Macropinocytosis av Flow cytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Williams, T., Kay, R. R.… More

Williams, T., Kay, R. R. High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (139), e58434, doi:10.3791/58434 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter