Summary
Macropinocytosis, büyük ölçekli özel olmayan sıvı alımı, klinik biyoloji İmmünoloji, enfeksiyon, kanser ve nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere birçok alanda önemlidir. Burada, mevcut teknikleri macropinocytosis model organizma Dictyostelium discoideum kullanarak macropinocytosis ölçümü akış sitometresi yüksek üretilen iş, tek hücreli çözümleme'ye izin için adapte edilmiştir.
Abstract
Büyük ölçekli özel olmayan sıvı alımını macropinocytosis tarafından bazı kanser hücreleri, antijen örnekleme, konak hücre işgali ve nörodejeneratif hastalıkların yayılması yayılması için önemlidir. Amip Dictyostelium discoideum yaygın olarak kullanılan laboratuar suşları hangi yüzde 90'ını macropinocytosis nedeniyle bitti besin ortamda büyüdü son derece yüksek sıvı alımını oranlarına sahip. Buna ek olarak, birçok memeli macropinocytosis bilinen çekirdek bileşenlerinin da macropinocytosis çalışmak için bir mükemmel model sistem yapım mevcuttur. Burada, içselleştirilmiş sıvı floresan dextran etiket olarak kullanarak ölçmek için standart teknik yüksek üretilen iş örnekleme (HTS) eki kullanarak akış sitometresi tarafından analiz örnekleri ile bir 96-şey plaka biçimine adapte olduğunu.
Hücreler için önceden belirlenmiş bir süre boyunca buz gibi soğuk arabellek daldırma tarafından yıkanmış ve ayrıca ekzositozu durur 5 mM sodyum azid kullanarak müstakil quenchable floresan dextran beslenir. Her şey hücrelerde sonra akış sitometresi tarafından incelenir. Yöntem aynı zamanda membran alımı ve fagositoz floresan boncuk veya bakteri ölçmek için adapte edilebilir.
Bu yöntem yüksek üretilen iş, emek ve kaynak verimli şekilde Dictyostelium tarafından sıvı alımını ölçümü izin vermek için tasarlanmıştır. Birden fazla suşları (Örneğin bir genin nakavt mutantlar) ve koşullar aynı anda karşılaştırma sağlar(hücreleri farklı medya veya inhibitörü farklı konsantrasyonları ile tedavi) paralel ve zaman-Dershaneler kolaylaştırır.
Introduction
Büyük ölçekli özel olmayan sıvı alımını macropinocytosis tarafından birkaç biyolojik bağlamlarda1' de, önemli olan antijen örnek bağışıklık yanında da dahil olmak üzere hücreleri2, patojen giriş ana hücreleri içine3, kanser hücre proliferasyonu4 ve prion hastalıkları5/ yayılıyor. Memeli ve Dictyostelium hücreleri, aktin6,7, PI (3,4,5) P38,9,10 (lipid kesin yapısını iki11arasında farklı olsa da), aktif Her ne kadar orada kalır macropinocytic yama nasıl hakkında cevaplanmamış birçok soru Ras12,13ve aktif Rac14,15 macropinocytosis tarafından verimli sıvı alımı için önemlidir. , organize ve sonunda içselleştirilmiş kurdu. Macropinocytosis daha kapsamlı bir anlayış vermek daha fazla protein macropinocytosis ve çeşitli biyolojik bağlamlarda nasıl önemliler sonraki belirlenmesi için önemli keşfetmek ve gelişmesine olanak sağlayabilecek koşullar bir dizi için hedeflenmiş tedaviler.
Dictyostelium macropinocytosis okuyan bir ideal modeli sistemidir. Standart laboratuar suşları bünye macropinocytosis yüksek düzeyde o sıvı alımı üzerinde macropinocytosis6nedeniyle % 90'ı demektir. Bu sadece memeli hücreleri macropinocytosis nedeniyle sıvı alımı oranı çok daha düşük nerede farklı olarak sıvı alımını belirlenerek ölçülecek macropinocytosis sağlar. Macropinocytosis çok iyi tanımlanmış ve bu sistemde kolayca görüntülenmeyecektir12 benzer şekilde sunan soruşturma için farklı avantajlar çekirdek macropinosome korunmuş bileşenlerinin diğer sistemleri üzerinde olabilir yerde birden çok düzenleyici sinyaller 16 , 17.
Macropinocytosis ölçmek için memeli hücreleri tarafından kullanılan standart teknik dextran pozitif veziküller18tarafından işgal bir hücre alanı belirlemek için mikroskobu ardından kısa bir süre için dextran ile darbe sonra hücreleri tamir içerir. Bu teknik ancak Dictyostelium19' bildirdi ve sadece tek uçak hücrenin içselleştirilmiş birim anlamı dikkate alır hücre, girdikten sonra daralma macropinosomes olasılığı için hesaba katmaz belli değil. Belirli bir süre içinde içselleştirilmiş macropinosomes sayılması alternatif bir tekniği, aynı downsides20vardır. Dictyostelium kullanarak bu sorunları önler; Ancak, Dictyostelium tarafından sıvı alımını ölçmek için varolan teknikleri nispeten hücreleri ve dextran21emek yoğun, büyük bir kullanarak miktarı vardır. Hücreleri yüksek yoğunluklu floresan dextran ve çeşitli noktalarda zaman-bir fluorimeter kullanarak içselleştirilmiş floresans tespiti için kaldırıldı örnekleri sarsıldı. Her ne kadar bu düşük işlem hacmi kalır bu şekilde hazırlanan hücreleri tek hücre, tercihan--dan nüfus düzeyi, çözünürlük22, kazanmak için akış sitometresi tarafından çözümlenebilir.
Burada, içselleştirilmiş sıvı floresan dextran etiket olarak kullanarak ölçmek için standart teknik yüksek üretilen iş örnekleme (HTS) eki kullanarak akış sitometresi tarafından analiz örnekleri ile bir 96-şey plaka biçimine adapte olduğunu. Hücreler için önceden belirlenmiş bir süre boyunca buz gibi soğuk arabellek daldırma tarafından yıkanmış ve ayrıca ekzositozu durur 5 mM sodyum azid kullanarak müstakil quenchable floresan dextran beslenir. Her şey hücrelerde sonra akış sitometresi tarafından incelenir. Bu yöntem yukarıdaki yöntemleri sınırlamalarının üstesinden gelir ve daha az kaynak kullanarak ve işçilik dahil azaltarak eşzamanlı suşları/koşullar çok sayıda sıvı alımını karşılaştırılması izin vermek için tasarlanmıştır.
Protocol
1. hücre ve malzemelerin hazırlanması
- Hücreleri ya SM ağar kaplamalar Klebsiella aerogenesgibi bakteriler ile birlikte veya HL5 gibi besin Orta tarihinde açıklanan23yetiştirmek.
Not: kusurlu macropinocytosis bakteri içinde nakavt mutantlar büyüyen macropinocytosis oranını artırabilir ikincil mutasyonların birikimi önlemek yardımcı olur. En iyi sonuçlar için hisse senedi hücrelerden kaplama sonra geçiş sayısını 4 aşağıda tutun. Mutantlar donmuş hisse senetleri en kısa zamanda yalıtım sonra muhafaza edilmelidir. - SM ağar kaplamalar hücrelerdeyse yetiştirmek için K. aerogenes izdiham SM ortamda büyümeye. 200 – 300 μL bakteri bir SM agar plaka üzerine ekleyin ve yayıldı. Bir kısır döngü hücre (başka bir bakteriyel tabaktan aktarırken) almak ve plaka bir kenarında yayıldı. Bir haftaya kadar 22 ° c için kuluçkaya.
- Tetra-metil-rodamine isothiocyanate (TRITC-) dextran 50 mg/ml suda çözülür, 1 mL aliquots 0,22 mikron filtre kullanarak filtre uygulama ve -20 ° C'de depolayın Aliquots süresiz olarak saklanır.
Not: 155 kDa bu yöntemle, rezervasyon yaptırın toplu olarak satın alınabilir, ama daha küçük dextrans macropinocytosis Dictyostelium24yılında sadece etkili tedbir olarak kullanılan tipik boyutudur. Farklı fluorophores gerekiyorsa art arda sıralı mavi veya Alexa-647, gibi farklı quenchable sigara dextrans alternatifleri vardır.
2. dönüştürmek içine nicel nitel ölçümleri (isteğe bağlı)
-
Bir sıvı alımını tahlil süspansiyon hücrelerde kullanarak gerçekleştirin.
- Axenically büyüyen hücreler 300 x g 3 dk de cips, süpernatant atmak ve besin orta 1 x 107 hücre/mL olarak resuspend. TRITC-dextran 0,5 mg/mL için eklemek ve 180 rpm, 22 ° c sallamak
- Örnekleri 0.7 mL buz gibi KK2 , 0, 30, 60, 90, 120 dk. yıkama içine bir kez buz gibi KK2 arabellek23 ' te benchtop santrifüj 1,5 ml, 1 ml içinde aynı tampon resuspend ve buz üzerinde depolamak 0.8 mL seyreltik.
Not: hemen veya tüm örneklerini topladıktan sonra yıkama eşdeğer sonuçlar verir.
-
Cilt hücreleri tarafından içselleştirilmiş sıvı belirleyin.
- Floresan bir uyarma dalga boyu 544 nm ve emisyon dalga boyu 574 kullanarak ölçmek için fluorimeter ayarla nm 10 nm kesilmiş. TRITC-dextran seyreltme serisi ayarladıysanız ve floresan için verilen ölçmek için kullanabilirsiniz dextran hacimleri. Bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.
- Bölüm 2.1 hücre süspansiyon 0.9 mL kullanarak hücreleri tarafından içselleştirilmiş floresans ölçmek. Kalibrasyon eğrisi24kullanarak hücre başına içselleştirilmiş sıvı hacmi hesaplamak.
- Her zaman noktasına ayrı olarak 0.5 mL buz soğuk KK2hücrelerden kalan sulandırmak. 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla 5 mL polistren akış sitometresi tüpler içine filtre. Her zaman noktası hücrelerden birbirinden farklı ve onların floresans kayıt akış sitometresi ayarlayın (3.4 ve 3.5 bölümlerine bakın).
- Yukarıdaki ayarları kullanarak akış sitometresi kalibrasyon boncuklar floresans ölçmek ve kaydedebilirsiniz.
Not: Bu akış sitometresi üzerinde tüm gelecekteki floresans ölçümler için referanstır: tekrar kullanmadan önce boncuk çalıştırın ve öylesine onlar-si olmak aynı floresans ayarlarını yapın. Bu çok dar tanımlı en yüksek verecektir. Bir kapı floresans tepe etrafında koyarak bu kolaylık sağlar. - Üç kez tekrarlayın ve bölümlerde 2.2 ve 2.3 birbirlerine karşı elde edilen hücre floresans verileri çizmek. En uygun bir çizgi çizmek ve denklemi nitel veri akış sitometresi nicel birimlerine dönüştürmek için kullanın.
3. ölçme sıvı alımı
Şekil 1: macropinocytosis yüksek üretilen iş ölçüm şematik. (A) Grow Dictyostelium bir SM plaka numaralı seribaşı ile K. aerogenes bakteri (sarı). Zaten Gelişmiş hücre kaçınarak hücrelerden besleme açık (turuncu), (yeşil), KK2 arabellek 25 mL hasat. Ayırmak için girdap tarafından 3 dk aralıklarla 300 x gde cips, sonra 3 kez 50 mL KK2 arabelleği, her zaman süpernatant atarak yıkayın. 1 x 105 hücre/ml HL5 büyüme orta resuspend ve 50 µL örnek bir düz dipli 96-şey plaka başına üç kuyu içine ekleyin. 22 ° c 24 h için (B) seyreltik TRITC-dextran 1 mg/ml HL5 büyüme orta olarak 50 mg/mL stok bir çözümden kuluçkaya. 50 µL (0 dak alımını kontrol wells hariç) her örnek ekleyin ve sonra hangi dextran 0 min alımı denetimine ekleyin 22 ° c için 1 h, kuluçkaya. (C) hemen medya dikkatle boşaltmak, plaka üzerinde aşırı orta kaldırmak ve banyo yıkamak için kuyu doldurma buz gibi KK2 arabellek daldırın bir doku pat. Arabellek dikkatle boşaltmak ve yine kuru pat. 5 mM sodyum azid KK2' hücreleri ayırmak için MC çözünmüş 100 µL ekleyin. Akış Sitometresi içselleştirilmiş floresans ölçümü için almak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
-
Bir düz oturaklı 96-iyi doku kültürü tabak (Şekil 1A) ayarlayın. Hücreleri bakteri ve onları daha önce tahlil; 24 h HL5 Orta (içeren 100 µg/mL dihydrostreptomycin, 100 µg/mL ampisilin ve 50 µg/mL sefaloridin) aktarmak için kullanma Bu upregulated bakteri24tarihinde yetişkin hücrelerinde görülen düşük düzeylerde olmak macropinocytosis sağlar. Alternatif olarak, doğrudan axenic kültür hatalar farklı yoğunlukları seyreltilmiş hücreleri nedeniyle azaltmak için tahlil önce 24 h için kuluçka, hücrelerden oranında seyreltin.
- Hasat hücrelerden besleme ön KK2 50 mL santrifüj tüpü 25 mL içine. Hücreleri vortexing ve 300 x g 3 dk.. için de pelet tarafından ayırmak Süpernatant atmak, Pelet resuspend ve 300 x g KK2her zaman bakteri kaldırın süpernatant atarak, 3 dk 50 ml için de 3 kere yıkayın.
- (Bir hemacytometer veya diğer hücre sayım sistemi kullanarak) hücre yoğunluğu belirlemek ve içine HL5 içeren antibiyotikler 1 x 105 hücre/ml seyreltik. 50 μL her kuyuya pipet üç kuyu her koşul için kullanma. 22 ° c 24 h 0 min alımı denetimi ayarlamak için anımsa için kuluçkaya.
Not: Bir alternatif orta, Örneğin SIH, VL6-ebilmek var olmak kullanılmış onun yerine.
-
Hücreler ile TRITC-dextran (Şekil 1B) yükleyin.
- 1 mg/ml kullanılan orta dextran seyreltik (Bu 2.5-5 mg/mL için çok düşük alımı hücrelerle değerlendirirken artırılabilir). 50 μL (0,5 mg/mL TRITC-dextran son bir konsantrasyon vererek) her şey eklemek ve plaka 22 ° C için 1 h, bu önemli dextran birikimi sağlar ancak dextran ekzositozu henüz başlamamış gibi geri dönün.
Not: hata azaltarak daha hızlı yapılması için bu adımı tekrarlayıcı pipet sağlar.
- 1 mg/ml kullanılan orta dextran seyreltik (Bu 2.5-5 mg/mL için çok düşük alımı hücrelerle değerlendirirken artırılabilir). 50 μL (0,5 mg/mL TRITC-dextran son bir konsantrasyon vererek) her şey eklemek ve plaka 22 ° C için 1 h, bu önemli dextran birikimi sağlar ancak dextran ekzositozu henüz başlamamış gibi geri dönün.
-
Hücreleri akış sitometresi (Şekil 1 c) için hazır olun.
- Hemen yıkama önce 0 min alımı denetimlere 50 μL dextran içeren medya ekleyin.
- Orta dikkatle boşaltmak ve bir doku üzerinde kuru pat. Buz gibi KK2plaka batış tarafından yıkayın, sonra dikkatle boşaltmak.
Not: bazı suşları bağlılık kusurları ile bu adım sırasında Örneğin her iki Talin homologs nakavt müstakil hale (talA-/ talB -)25. Kötü iliştirin ve gerekirse medya Aspire hücre hatları ile çalışırken dikkatli olun. - Buz gibi 5 mM sodyum azid KK2' MC (KK2 + 2 mM MgSO4 ve 100 mikron CaCl2) çözünmüş 100 μL ekleyin.
Dikkat: Sodyum azid son derece zehirlidir. Toz maskesi ve koruyucu gözlük tozu ile çalışırken kullanın. Her zaman eldiven ve önlük giymek. Isı önlemek ve asit ile birlikte kullanmayın.
Not: Hücreleri hızla ayırmak ve ekzositozu EngellediBRÜKSEL24' tür. Mikroskop bunu denetlemek için kullanılabilir.
-
Akış Sitometresi tarafından ölçü sıvı alımı
- Eğer mutlak olanlar için göreli değerleri dönüştürmek planlama, boncuk (bkz: 2) akış sitometresi ayarları standart hale getirmek için kullanın. Alternatif olarak, kullanım hücreler olarak bölümde ileri dağılım ve yan dağılım uygun şekilde hücreleri (Şekil 2A), makine bloke değildir, sağlanması yalıtmak için ayarlandığından emin olmak için 2 dextran (Şekil 2B) yüklü ve parametrelerini ayarlamak içselleştirilmiş Floresan (Şekil 2C) ölçmek.
- Sistem yüksek üretilen iş örnekleme ekleyin ve plaka ekleyin. (TRITC-dextran kullanmak için sarı-yeşil lazer heyecanlandırmak ve 582 nm kanal veya benzer ölçmek için) Floresan ölçmek için bir protokol hazırlamam ayarla, 65 μL hücre süspansiyon ve Çalıştır.
-
Akış Sitometresi sonuçlarını analiz
- İleri dağılım ve yan dağılım (Şekil 2A) kullanarak hücreleri kapıda. Ortalama floresans İstatistikler seçeneğini kullanarak hücre hesaplama. Bir örnek kullanarak bu parametreleri ayarlayın ve tüm örnekleri için geçerlidir.
Not: İleri dağılım/yana dağılım profilleri farklı mutantlar veya inhibitörleri kullanıldığında örnekleri arasında değişebilir. - Her koşul için üç kuyular ortalamasını belirlemek ve 0 dk alımını kontrol çıkarın. Ya 2 bölümünde belirlenen denklemi kullanarak sayısal değerleri dönüştürmek veya denetime normalleştirmek.
- İleri dağılım ve yan dağılım (Şekil 2A) kullanarak hücreleri kapıda. Ortalama floresans İstatistikler seçeneğini kullanarak hücre hesaplama. Bir örnek kullanarak bu parametreleri ayarlayın ve tüm örnekleri için geçerlidir.
4. performans gösteren sıvı alımı zaman-Dershaneler
- Hücreleri olarak bölümde 3, üç kuyular için her zaman nokta ve zorlanma/koşulu ile ayarlayın.
- Dextran etiketli orta farklı wells için sırayla ekleyin. Tipik bir zaman ders sıvı alımını ölçer 0, 30, 60, 90 120 ve 180 dk. 60 dk sonra kuyular için 120 dk süresi noktası ekleyerek takip 180 dk zaman noktası kuyuları için orta dextran içeren eklemek vb (Şekil 3A).
- 0 dk az 50 μL dextran içeren eklemek orta ve hemen dikkatle boşaltmak ve plaka 3.3 bölümde olduğu gibi yıkayın. 3.5 bölümünde açıklandığı gibi analiz.
5. doz yanıt eğrileri
- Hücreleri bölümünde 3, üç kuyular için her zorlanma ve koşulu ile açıklandığı gibi ayarlayın.
- Bileşik faiz bileşik Çift istediğiniz maksimum son konsantrasyon , 1 mg/mL dextran içeren orta içine oranında seyreltin. Araç aynı oranda ilk olarak ile dextran ile orta içeren ikinci bir tüp hazırlayın. Girdap karıştırmak için.
- Örnek (Şekil 4A) başına orta içeren 200 μL dextran ilgi bileşik seyreltme serisi oluşturmak. Girdap karıştırmak için. Her örnek 1 h için iyi orta 50 μL ekleyin.
- Yıkama ve bölümde 3.3 itibaren açıklandığı gibi analiz.
6. fagositoz ve membran alımı
- Membran alımını ölçmek için madde 3 te açıklandığı gibi hücreleri hazırlayın. 20 mikron FM 1-43 için 10 mikron son bir konsantrasyon içeren orta 50 μL ekleyin. Yükleme sonra yıkayın ve akış sitometresi olarak bölümde 3.3 hücreleri hazırlamak. 585 nm kanal veya benzer, heyecanlandırmak için mavi lazer kullanarak ölçmek.
Not: membran kaçakçılığı sıvı fazlı daha hızlı olduğundan, 10 min 1 h26' dan kullanmak için bir daha uygun zaman noktasıdır. Yalnızca membran dahil zaman bulabilsem alternatif boya yerine kullanılabilir. -
Fluorescently etiketli boncuk veya bakteri fagositoz ölçmek için kullanın. Gibi onlar ayrılmaz Dictyostelium tarafından ileri gelen ve yan dağılım24floresan Maya kullanılamaz. Hücreleri 3 bölümde açıklandığı gibi ayarlayın ve açıklanan27analiz.
- Fagositoz boncuk ekleyin sarı-yeşil etiketli bölümde 5 x 107 boncuk/mL (1,75 ve 2 mikron) veya 1 x 108 boncuk/mL (1 ile 1,5 mikron) 3.2 son bir konsantrasyon için 1 h için yıkama ve akış sitometresi anlamında hazırlama önce açıklandığı gibi boncuk ölçmek için Bölüm 3.3. 525 nm kanal veya benzer, heyecanlandırmak için mavi lazer kullanarak ölçmek.
Not: Daha yüksek konsantrasyonlarda hücre dekolmanı götürecek. - Fagositoz bakterilerin ölçmek için Texas-kırmızı etiketli Escherichia coli bioparticles Bölüm 3.2-1 x 108 bakteri/mL 1 h için yıkama ve akış sitometresi olarak bölümde 3.3 hazırlama önce açıklandığı gibi ekleyin. 610 nm kanal veya benzer, heyecanlandırmak için sarı-yeşil lazer kullanarak ölçmek.
- Fagositoz boncuk ekleyin sarı-yeşil etiketli bölümde 5 x 107 boncuk/mL (1,75 ve 2 mikron) veya 1 x 108 boncuk/mL (1 ile 1,5 mikron) 3.2 son bir konsantrasyon için 1 h için yıkama ve akış sitometresi anlamında hazırlama önce açıklandığı gibi boncuk ölçmek için Bölüm 3.3. 525 nm kanal veya benzer, heyecanlandırmak için mavi lazer kullanarak ölçmek.
Representative Results
Bir kez gerçekleştirilen teknik ve hücreleri dextran ile dolu ve analiz (Şekil 1) için akış sitometresi engellenmiş değil emin olmak ve Şekil 2Agösterildiği hücreler gibi bakmak için ileri dağılım/yana dağılım profili ayarlayın. Makine engellenmişse, daha böyle gösterildiği 2B şekil -ecek bakmak ve devam etmeden önce engellenmemiş olması gerekir. Parametrelerini göster denetim axenic hücreleri var uzun zaman noktalarda yüksek içselleştirilmiş dextran floresans ve daha kısa olanları, düşük içselleştirilmiş floresans sağlamak (Şekil 2C).
Mutantlar arasında farklılıklar ararken, bir üç fenotipleri olacağını muhtemeldir. Mutantlar normal sıvı alımı olabilir, kısmi bir kusur olabilir veya sıvı alımını tamamen kaldırılmış olabilir. Şekil 2B bir gerilme ile normal sıvı alımı, gösterir bu durumda Standart laboratuvar gerginliği Ax2, bir mutant bir ~ %50 ile azaltmak sıvı alımı (Ax2 rasG-14) ve bir ile sıvı alımı (Ax3 gefB-28) kaldırılmış. Ortalama medyan sıvı alımı (Bölüm 3.5) elde etmek ve ( Şekil 3Bolduğu gibi) içselleştirilmiş sıvı hacmi hesaplamak veya bir denetime verileri karşılaştırmak için kullanabilirsiniz ( Şekil 4B olduğu gibi ve 4 C).
Şekil 3A, olduğu gibi bir sıvı alımını zamanlı kurs gerçekleştirirken içselleştirilmiş floresans 60-90 dk için sonra exocytosed dextran başlar, artması gerektiğini ve bir plato (Şekil 3B) ulaşılır. 60 dk macropinocytosis farklı mutantlar/koşullarda bu nedenle ulaşılması için iyi bir sinyal verir ve sinyal yok ekzositozu nedeniyle kayıp olduğunda standart saati noktası olarak kullanarak. Mutantlar nerede ekzositozu ciddi engel bir plato29ulaşmak için daha uzun sürebilir.
Ne zaman tedavi Dictyostelium ( 4A rakamolarak ayarlanır), macropinocytosis karşı etkilidir inhibitörleri ile 1s içinde içselleştirilmiş dextran hücreleri aşağı hemen hemen hiçbir şey, çoğu durumda daha yüksek inhibitörü konsantrasyonlarda gidecek (Şekil 4B). Bazı inhibitörleri % 100 etkili olmayabilir, ancak, Örneğin nocodazole sadece akut eklendiğinde macropinocytosis tarafından sıvı alımını % 50'engeller (Şekil 4 c). İnhibitörleri etkili değilse, hücreler dextran denetim olarak benzer bir miktar içselleştirmesi ve floresan bir düşüş değil görülecektir. Bu teknik çok sayıda farklı inhibitörleri ve sıvı alımını üzerindeki etkileri için macropinocytosis tarafından çok hızlı bir şekilde taranması için inhibitör konsantrasyonlarının inhibitörü tedavisi en iyi duruma getirme harcanan zamanı azaltır sağlar.
Şekil 2: Akış Sitometresi ve temsilcisi veri kümesi kadar. (A) hücreleri kolayca ayırt edilebilir böylece ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) profilleri hücre ayarlanmalıdır. Ax2 hücreleri görünmelidir nasıl bir örnek gösterilir. (B) akış sitometresi engellenmişse, bu örnekte olduğu gibi çok düşük dağılım hücreleri var. Lazer fluorophores düzgün heyecanlandırmak değil ve devam etmeden önce makine unblocked olmalıdır. Herhangi bir veri iken makine engellendi elde atılmalıdır. (C) böylece 0 min alımı örnek hücreleri için inkübe bağlandığınızda artırır düşük floresan, floresans Williams & Kay 201824alınan bu örnekte gösterildiği gibi floresan ortamda uzun ayarlanması gerekir. (D) örnekler ile normal macropinocytosis (Ax2, yeşil), 1 h için TRITC dextran ile inkübe hücre macropinocytosis (Ax2 rasG -, HM172614, turuncu) azaltılmış ve macropinocytosis (Ax3 gefB -kaldırıldı HM177628, mavi). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: 96-şey levha sıvı alımı zaman-Dershaneler gerçekleştirme. (A) Dextran var olmak mülhak her el örnekleri için sırayla, aynı bitiş saati ile. Sonra yıkayın kuyuları, ayırmak ve akış sitometresi tarafından içselleştirilmiş floresans ölçmek. Örnek kez dextran eklemek için burada gösterilir. (B) sıvı alımı zaman-ders Ax2 hücre 96-şey levha gerçekleştirilen. Williams & Kay 201824alınan, hata çubukları üç bağımsız deneyler standart hatasını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: sıvı alımı doz yanıt eğrileri. (A) ilgi 1 mg/mL TRITC-dextran, Çift Kişilik istenen son maksimum konsantrasyon içeren bu durumda PI3K inhibitörü LY294002, HL5 için bileşik ekleyin. HL5 büyüme orta + 1 mg/mL dextran araç yalnız koşul başına 200 µL orta seyreltme dizi oluşturmak için çeşitli oranlarda içeren ile karıştırın. Kuyu 1 h için normal olarak yıkama ve içselleştirilmiş floresans ölçme önce ekleyin. (B) sıvı alımı doz yanıt eğrisi Ax2 hücreler için aLY294002 içeren orta ile inkübe. Williams & Kay 201824uyarlanmıştır. Sıvı alımını tedavi edilmemiş bir denetim için normalleştirilmiş. Hata çubukları üç bağımsız deneyler standart hatasını gösterir. (C) sıvı alımı doz yanıt eğrisi Ax2 hücreler için nocodazole ile inkübe. Williams & Kay 201824uyarlanmıştır. Sıvı alımını tedavi edilmemiş bir denetim için normalleştirilmiş. Hata çubukları üç bağımsız deneyler standart hatasını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Sıvı alımını değerlendirmek için diğer yöntemleri iş hızı düşük ise, hücre içinde in situ ve hücreleri ayırmak için sodyum azid kullanımı yıkama macropinocytosis, membran alımı, yüksek üretilen iş ölçümü sağlayan kritik bu yöntemde adımlardır veya fagositoz tarafından Dictyostelium. Hücreleri bir yüzeye bağlı olan ve orta değil gibi onlar Orta çevrelerindeki ilk kapalı atılmış ise sol bağlı ve arabellek daldırma tarafından değiştirildi ve yine kapalı atılmış. Hangi hücresel ATP tüketir ve membran30depolarizes, sodyum azid sonra hücreleri ayırmak için kullanılan ve aynı zamanda hücre canlılığı24etkilemeden ekzositozu önler.
Macropinocytosis Dictyostelium tarafından ölçmek için akış sitometresi kullanarak sıvı alımı çok hassas bir ölçüm çok hızlı bir şekilde belirli zorlanma veya koşul sıvı alımı, neden değiştirdi neden kurmak için verir iken soruşturma kullanarak daha fazla Mikroskopi gerekli24' tür. Bu aynı zamanda daha önce yayımlanmış sonuçlar bazı durumlarda, sıvı alımını bir fark göstermiştir mutant suşları ya (Bu durumda), olduğu gibi bir yüzey üzerinde yetiştirilen tarafından unutulmamalıdır veya süspansiyon (olduğu gibi standart iletişim kuralı)31sallayarak. Bu yöntemi kullanarak nadir de olsa bazen belirgin sıvı alımını kusurları cevapsız, anlamına gelebilir. Ayrıca, ne zaman fagositoz ölçme, sadece düşük konsantrasyonlarda parçacıkların kullanılabilir. Fagositoz suşları ve koşullar24arasında ilgili farklılıklar ölçmek mümkün olmasına rağmen en fazla bu tekniği ile tespit edilebilecek fagositoz kadar gerçek maksimum oranıdır. Fagositoz en yüksek hızı belirlemek için alımını süspansiyon sallayarak bir alternatif iletişim kuralı27tarafından ölçülen gerekir. Bunun için buna göre akış sitometresi ayarlarken düzeltilmesi gerektiğini bu yüzden boncuk fagosite hücreleri yan dağılım, artmıştır.
Akış Sitometresi memeli hücreleri32içinde sıvı alımını ölçmek için kullanılabilir, ancak sıvı yüksek oranda aşama alımı endositik diğer yolları tarafından Dictyostelium görülen bir sorundur. Ayrıca, hücreleri genellikle daha fazla içselleştirilmiş dextran endositik ilerlemesini sağlayan 37 ° C'de tripsin kullanarak ayrılır. Buz gibi sodyum azid makrofajlar bu teknik daha fazla optimizasyon olmaksızın memeli hücreleri için geçerli değildir yapma (Williams, yayınlanmamış gözlem) bir yüzey, ayırmak neden olmaz.
Yüksek işlem hacmi ölçümü macropinocytosis inhibitörleri, genetik mutasyon veya gen nakavt etkileri Dictyostelium hücrelerde için hızlı ve ucuz ekran için kullanılan potansiyeline sahiptir. Mutantlar her zaman onların doğrudan üst'e sadece karşılaştırılmalıdır. Okuyucu Dictyostelium zorlanma için önceden hiçbir tercih varsa, axenic sigara suşları DdB veya NC4 gibi daha "vahşi axenic olanlardan daha tipi" ve axenic suşları33olarak etkili bir şekilde manipüle edilebilir. Aksi takdirde, Ax2 suşları axenic olan suşları ile iken Ax4 birçok suşu Talin A altını gizleme ve olması gereken en az sayıda genom mükerrer34, kaçınılması mümkünse23. Daha önce yayımlanmış suşlarının en Dicty stok Merkezi35sipariş edilebilir.
Bu teknik daha önce farklı koşullar, inhibitörleri ve mutasyonlar macropinocytosis Dictyosteliumtarafından üzerinde etkileri içine mümkün olandan daha fazla araştırma olanakları sağlar.
Disclosures
Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Tıbbi Araştırma Konseyi UK (U105115237) RRK için finansman çekirdek için teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR_II flow cytometer | BD Biosciences | - | Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD |
| TRITC-dextran (155 kDa) | Sigma-Aldrich | T1287 | Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine |
| HL5 medium | Formedium | HLGCFG | |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3596 | Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work |
| Dihydrostreptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1517 | |
| Ampicillin sodium | Formdium | AMP50 | |
| Kanamycin monosulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Sodium azide | VWR | 103694M | |
| Magnesium sulfate hydrate | VWR | 25169.295 | |
| Calcium chloride dihydrate | VWR | 1.02382.0250 | |
| Potassium dihydrogen phopshate | VWR | 1.04877.1000 | |
| Di-potassium hydrogen phosphate | VWR | 1.05104.1000 | |
| Fluorimeter | Perkin-Elmer | LS 50 B | |
| FM1-43 | Thermofisher | T35356 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 µm | Polysciences | 15702-10 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 µm | Polysciences | 09719-10 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 µm | Polysciences | 17687-5 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 µm | Polysciences | 09847-5 | |
| Texas Red E. coli bioparticles | Thermofisher | E2863 | |
| Flow-set fluorospheres | Beckman Coulter | 6607007 | Calibration Beads |
| SM agar | Formedium | SMACFG | |
| 0.22 µm syringe filter | Elkay Laboratory Products | E25-PS22-50S | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302188 | |
| Round-bottom polystyrene tubes | Corning | 352058 | Use a tube that will fit onto your flow cytometer. |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 50 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
| Repeating pipette | Eppendorf | M4-SK | |
| 5 mL repeating pipette tips | Eppendorf | 30089650 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| LY294002 | Cayman Chemical Company | 70920 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG |
References
- Bloomfield, G., Kay, R. R. Uses and abuses of macropinocytosis. Journal of Cell Science. 129 (14), 2697-2705 (2016).
- Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182 (2), 389-400 (1995).
- Hardt, W. D., Chen, L. M., Schuebel, K. E., Bustelo, X. R., Galan, J. E. S. typhimurium encodes an activator of Rho GTPases that induces membrane ruffling and nuclear responses in host cells. Cell. 93 (5), 815-826 (1998).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (9), 3548-3553 (2011).
- Hacker, U., Albrecht, R., Maniak, M. Fluid-phase uptake by macropinocytosis in Dictyostelium. Journal of Cell Science. 110, 105-112 (1997).
- Dowrick, P., Kenworthy, P., McCann, B., Warn, R. Circular ruffle formation and closure lead to macropinocytosis in hepatocyte growth factor/scatter factor-treated cells. European Journal of Cell Biology. 61 (1), 44-53 (1993).
- Buczynski, G., et al. Inactivation of two Dictyostelium discoideum genes, DdPIK1 and DdPIK2, encoding proteins related to mammalian phosphatidylinositide 3-kinases, results in defects in endocytosis, lysosome to postlysosome transport, and actin cytoskeleton organization. Journal of Cell Biology. 136, 1271-1286 (1997).
- Araki, N., Johnson, M. T., Swanson, J. A. A role for phosphoinositide 3-kinase in the completion of macropinocytosis and phagocytosis by macrophages. Journal of Cell Biology. 135 (5), 1249-1260 (1996).
- Araki, N., Egami, Y., Watanabe, Y., Hatae, T. Phosphoinositide metabolism during membrane ruffling and macropinosome formation in EGF-stimulated A431 cells. Experimental Cell Research. 313 (7), 1496-1507 (2007).
- Clark, J., et al. Dictyostelium uses ether-linked inositol phospholipids for intracellular signalling. The EMBO Journal. 33 (19), 2188-2200 (2014).
- Hoeller, O., et al. Two distinct functions for PI3-kinases in macropinocytosis. Journal of Cell Science. 126, 4296-4307 (2013).
- Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins. Science. 233 (4768), 1061-1068 (1986).
- Veltman, D. M., et al. A plasma membrane template for macropinocytic cups. Elife. 5, e20085 (2016).
- West, M. A., Prescott, A. R., Eskelinen, E. L., Ridley, A. J., Watts, C. Rac is required for constitutive macropinocytosis by dendritic cells but does not control its downregulation. Current Biology. 10 (14), 839-848 (2000).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109, 2731-2739 (1989).
- Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).
- Clarke, M., Kohler, J., Heuser, J., Gerisch, G. Endosome fusion and microtubule-based dynamics in the early endocytic pathway of Dictyostelium. Traffic. 3, 791-800 (2002).
- Pacitto, R., Gaeta, I., Swanson, J. A., Yoshida, S. CXCL12-induced macropinocytosis modulates two distinct pathways to activate mTORC1 in macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 101 (3), 683-692 (2017).
- Rivero, F., Maniak, M. Quantitative and microscopic methods for studying the endocytic pathway. Methods in Molecular Biology. , 423-438 (2006).
- Bacon, R. A., Cohen, C. J., Lewin, D. A., Mellman, I. Dictyostelium discoideum mutants with temperature-sensitive defects in endocytosis. Journal of Cell Biology. 127, 387-399 (1994).
- Basu, S., Fey, P., Jimenez-Morales, D., Dodson, R. J., Chisholm, R. L. dictyBase 2015: Expanding data and annotations in a new software environment. Genesis. 53 (8), 523-534 (2015).
- Williams, T. D., Kay, R. R. The physiological regulation of macropinocytosis during Dictyostelium growth and development. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
- Tsujioka, M., et al. Overlapping functions of the two talin homologues in Dictyostelium. Eukaryotic Cell. 7 (5), 906-916 (2008).
- Aguado-Velasco, C., Bretscher, M. S. Circulation of the plasma membrane in Dictyostelium. Molecular Biology of the Cell. 10, 4419-4427 (1999).
- Sattler, N., Monroy, R., Soldati, T. Quantitative analysis of phagocytosis and phagosome maturation. Methods in Molecular Biology. 983, 383-402 (2013).
- Wilkins, A., Chubb, J., Insall, R. H. A novel Dictyostelium RasGEF is required for normal endocytosis, cell motility and multicellular development. Current Biology. 10, 1427-1437 (2000).
- Thomason, P. A., King, J. S., Insall, R. H. Mroh1, a lysosomal regulator localized by WASH-generated actin. Journal of Cell Science. 130 (10), 1785-1795 (2017).
- van Duijn, B., Vogelzang, S. A., Ypey, D. L., van der Molen, L. G., van Haastert, P. J. M. Normal chemotaxis in Dictyostelium discoideum cells with a depolarized plasma membrane potential. Journal of Cell Science. 95, 177-183 (1990).
- Novak, K. D., Peterson, M. D., Reedy, M. C., Titus, M. A. Dictyostelium myosin I double mutants exhibit conditional defects in pinocytosis. Journal of Cell Biology. 131, 1205-1221 (1995).
- Mercer, J., Helenius, A. Vaccinia virus uses macropinocytosis and apoptotic mimicry to enter host cells. Science. 320 (5875), 531-535 (2008).
- Paschke, P., et al. Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum. PLoS One. 13 (5), e0196809 (2018).
- Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum. Genome Biology. 9 (4), R75 (2008).
- Fey, P., Dodson, R. J., Basu, S., Chisholm, R. L. One stop shop for everything Dictyostelium: dictyBase and the Dicty Stock Center in 2012. Methods in Molecular Biology. 983, 59-92 (2013).
