Summary
Vi præsenterer en protokol til real-time optisk påvisning af enkelt umærket proteiner som de udskilles fra levende celler. Dette er baseret på interferometriske spredning (iSCAT) mikroskopi, som kan anvendes til en række forskellige biologiske systemer og konfigurationer.
Abstract
Vi demonstrere interferometriske spredning (iSCAT) mikroskopi, en metode kan påvise enkelt umærket proteiner udskilles fra enkelte levende celler i realtid. I denne protokol dækker vi de grundlæggende trin for at realisere en iSCAT mikroskop og supplere det med ekstra billedbehandling kanaler til at overvåge rentabiliteten af en celle under undersøgelsen. Efter dette bruger vi metoden til real-time opdagelse af enkelt proteiner som de udskilles fra en levende celle, som vi viser med en udødeliggjort B-celle linje (Laz388). Nødvendige foranstaltninger vedrørende forberedelse af mikroskop og prøve samt analyse af de registrerede data diskuteres. Video-protokollen viser, at iSCAT mikroskopi tilbyder en enkel metode til at studere sekretion på enkelt-molekyle niveau.
Introduction
Udskilles proteiner spiller en væsentlig rolle i forskellige fysiologiske processer1. På grund af dette, er de rutinemæssigt undersøgt som en kollektiv ensemble (proteomics) eller som individuelle enheder2,3. Proteomics undersøger traditionelt hele sættet af proteiner til stede i et bestemt biologiske system som fx enzymmaerket assays (ELISA), flowcytometri eller massespektrometri4,5, 6. Enkelt proteiner, på den anden side er generelt fundet ved hjælp af en række teknikker, der er baseret på fluorescens7,8, plasmonics9,10, eller kryogene elektron11 microscopies. Alle disse teknikker bruge komplekse instrumenter, mærkning, eller begge dele og mangler ofte dynamics oplysninger, som de kun levere langsigtet information om systemet under undersøgelsen.
Her bruger vi iSCAT12,13 mikroskopi til forstand individuelle sekretoriske proteiner med lynhurtige tidsmæssige opløsning14. Vigtigere, registrerer teknikken, der den svage spredte signal iboende til hvert protein12,14. Mængden af lys, som en lille bioparticle scatters skalaer med sin polarizability. Antages det, at formen af et protein kan estimeres ved en effektiv spredning kugle14,15,16, og at forskellige proteiner har meget lignende refraktivt indeks, det målte signal kan være direkte tilsluttet molekylvægt (MW) af protein. Den empiriske kalibrering af iSCAT kontrast versus Molekylær vægt af referencemålinger gør det muligt at skelne mellem proteiner af forskellige størrelser. iSCAT eksperimenter kan let blive suppleret med Fluorescens mikroskopi17,18, immunosorbent reagenser samt fluorescerende eller spredning etiketter til at tillade en specifik påvisning af eventuelle protein interesse14 , 17 , 19.
I princippet fungerer iSCAT ved at forstærke et protein svage spredt lys via interferometriske blanding med en sekundær reference bølge. Den fundne intensitet (
) i en iSCAT mikroskop er beskrevet af
hvor 
er den indfaldende intensitet, 
er en koefficient for medfinansieringen fra reference bølgen, 
betyder spredning styrken af nano-objekt under undersøgelsen, og 
er faseskift mellem de spredte og reference bølger14. Enten den overførte eller tilbage-afspejlet indfaldende lys bruges typisk som en reference bølge, hvor i hvert enkelt tilfælde 
regnskab for transmissivity eller reflektion for eksempel afdeling, henholdsvis. Udtrykket 
er proportional med proteinet spredning tværs afsnit og kan overses i forhold til cross udtrykket. Således, at 
for komplet destruktiv interferens, det detekterede lys er givet ved 
hvor 
er reference intensitet og 
er indblanding intensiteten.
iSCAT mikroskopi tilbyder en fremragende metode til at undersøge biologiske processer på enkelt-molekyle niveau. Som et eksempel, vi undersøger Laz388 celler — en Epstein - Barr virus (EBV) transformeret B-lymfocytter celle linje20,21 — som de udskiller proteiner som IgG antistoffer16. Men metoden er generelle og kan anvendes til en lang række andre biologiske systemer. iSCAT er i sagens natur uspecifik og kan finde nogen protein eller nanopartikel eller det kan udvides med fælles overflade functionalization metoder for specifikke eller multipleksede påvisning. Dens enkelhed og evne til at blive kombineret med andre optiske teknikker, såsom Fluorescens mikroskopi, gør iSCAT en værdifuld supplerende værktøj i cellebiologi.
Protocol
Forsigtig: Læs venligst alle relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) før du bruger nogen kemikalier, overholde alle relevante sikkerhedspraksis og bære personlige værnemidler (laser beskyttelsesbriller, øjenbeskyttelse, handsker, laboratorium frakker) efter behov.
1. opbygning af iSCAT mikroskopet16,18
Bemærk: ISCAT mikroskop består typisk af en modificeret inverteret mikroskop setup. Kort sagt, en laser er fokuseret på tilbage brændplanet af en høj numerisk blænde (NA) mål og en billeddannelse linse bruges til at fokusere den partikel back-spredt lys på et kamera chip. I almindelighed, kan denne wide-felt mikroskop bygget fra bunden eller baseret på en eksisterende inverteret mikroskop. Denne protokol dækker de væsentlige skridt til at realisere setup, mens ændringer i den anvendte hardware er muligt. En mere detaljeret beskrivelse af en iSCAT mikroskop forsamling kan findes i Arroyo et al. arbejde 18.
Forsigtig: En iSCAT mikroskop indebærer en klasse IIIB til klasse IV laser lyskilde. Passende øjenbeskyttelse er nødvendige, når montering og justering af mikroskop optik. Under mikroskopet forsamling, Sørg for at stien laser stråle forbliver lige og er ikke afbøjes som nye optiske komponenter er tilføjet.
-
Opsætning af belysning stien af mikroskopet.
- Ved hjælp af en dæmpet optisk tabel og en stiv metal blok, opbygge et mikroskop prøve fase18 at indlemmer en høj numerisk blænde (NA) mål (100 X / 1.46 NA) og en oversættelsesenhed, der giver mulighed for lateral prøve oversættelse samt ændring af fokus holdning til formålet.
Bemærk: Drift af en iSCAT mikroskop på grænsen af afsløre enkelt proteiner er meget modtagelige for eksterne vibrationer. En centrosymmetric piezo fase, der understøtter prøve fra alle sider er anbefales at begrænse akustiske excitationer af den prøve, der ellers ville gå på kompromis fokale og lateral stabilitet. Figur 1 viser en passende stikprøve fase, herunder piezo oversættelsesenhed og målet. Derudover anbefales det, at massiv og stabil mounts bruges til alle optiske komponenter drøftet i de følgende trin. Sådanne komponenter er let tilgængelige fra kommercielle optik leverandører. - Bruge en 50 cm brændvidde singlet linse (wide-felt linse) og en 45° (lodret) kobling spejl for at fokusere på baggrund af en diodelaser på bølgelængde 445 nm på tilbage brændplanet af målet. Dette skaber en kollimeres stråle på det mål fremadrettet fokus og bliver iSCAT belysning kilde. Om nødvendigt filtreres laser rumligt før 50 cm linsen via en 30 µm pinhole eller single-mode fiber.
- Anvende en dråbe immersionsolie på målet og placere et glas coverslip i prøven flyet af mikroskop fase. Dette vil resultere i en stråle, der afspejler tilbage ned gennem den billeddiagnostiske mål.
Bemærk: Refleksion udspringer af luft-glas-grænseflade på oversiden af prøve coverslip og vil tjene som grundlag for iSCAT referencestråle. Resterende snavs eller støv på overfladen af coverslip vil give anledning til spredning punktkilder, som støtte i den korrekte fokusering af imaging formålet i de næste skridt.
Forsigtig: Størstedelen af laserlys sender via coverslip og rejser lige op fra målet. Placer en uigennemsigtig spejlende diffuser (fx., et papir kort) over coverslip til at minimere risikoen for skader fra laserlys.
- Ved hjælp af en dæmpet optisk tabel og en stiv metal blok, opbygge et mikroskop prøve fase18 at indlemmer en høj numerisk blænde (NA) mål (100 X / 1.46 NA) og en oversættelsesenhed, der giver mulighed for lateral prøve oversættelse samt ændring af fokus holdning til formålet.
Figur 1: iSCAT prøve fase. Fotografiet viser den massive aluminium blok hvor piezo oversættelsesenhed (sort) er monteret samt de centrerede 100 x mål. 3-akse piezo-etape giver mulighed for præcis positionering af prøven i brændplanet af målet. Grov fokus foretages ved at dreje et gevind rør hvor målet er monteret (ikke afbildet). Blokken er placeret på den optiske tabel med fire stål piedestaler over 45° kobling spejl. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
-
Oprette stien billeddannelse af mikroskopet.
- Introducere en antireflection (AR)-belagt stråledeler (70% refleksion, 30% transmission) i en 45° vinkel i forhold til det indfaldende strålebundt, og ca 10 cm efter wide-felt linse. Punkt AR coating mod Laserkilde. Dette sender det indfaldende strålebundt, og afspejler referencen og spredt bjælker i en 90° vinkel til det indfaldende strålebundt.
Bemærk: AR-belagt og/eller kilet beam splittere anbefales som betydelige ghosting og frynser virkninger kan opstå ved brug af beam opdeling kuber eller Ubestrøget planar beam splittere. Se diskussion for flere detaljer. Hvis det ønskes, kan enhver uønsket reflekterede stråle som følge af bagsiden af stråledeler blokeres ved hjælp af en irisblænde. - En tyk stråledeler vil indføre en betydelig beam forskydning, så laseren ikke kan angive målet lige længere. Hvis det er nødvendigt, justere stien laser stråle før stråledeler at sikre korrekt udbredelse gennem målet.
Bemærk: Beam splitter kan også tilføjes før bredt felt linsen og stadiet mikroskop er placeret (i trin 1.1.2.), så at strålen ikke bliver forskydes senere. - På dette punkt, fokuserer interferometeret imaging arm og sikre, prøve fly og kamera er parfokale. Placer en konkav f =-45 cm linse på en position 5 cm efter wide-felt linsen i stien indfaldende strålebundt. Dette vil resultere i en kollimeres stråle ind tilbage blænde af målet.
- Med en skærm, der er placeret i den reflekterede arm af interferometeret, flytte målet i den lodrette retning til at finde den grove fokale holdning. Målet er i fokus, når strålen rammer skærmen er kollimeret.
Bemærk: Figur 2 viser en skematisk af denne proces. - Fjerne begge f =-45 cm linse og skærmen når grove fokusere er fuldført.
Bemærk: Istedet for benytter en negativ brændvidde linse, wide-felt linsen selv kan være placeret på en bevægelig mount og flyttet ud af strålegang til dette trin. For at opnå den mest stabile mikroskop konfiguration, anbefales det dog at holde wide-felt linsen i en fast position. - Tilføje en anden f = 50 cm singlet linsen at fokusere det spredte lys og collimate det reflekterede lys på sensor kamera, CMOS. Sikre, at linsen er placeret 50 cm fra tilbage brændplanet af målet så igen collimate referencestråle og fokusere den spredt lys.
- Sted CMOS chip 50 cm fra f = 50 cm linse og Placer stråle direkte på midten af chippen.
Bemærk: Følgende parametre bruges typisk til billedbehandling. Output-effekt af laser (bølgelængde 445 nm) er sat til 100 mW. Pinhole og beam splitter dæmpe den gennemlysning, således at den effektive magt ind i målet er ca 9 mW. Lysbundtets diameter på positionen prøve beløber sig til 6 µm. Med den anvendte imaging linse er effektiv forstørrelsen af systemet omkring 300 x. Størrelsen af billedet på CMOS chip er sat til 128 × 128 pixel i det belyste område, resulterer i en cirka 5 × 5 µm2synsfelt. Figur 3 viser en skematisk af færdigsamlet iSCAT mikroskop.
- Introducere en antireflection (AR)-belagt stråledeler (70% refleksion, 30% transmission) i en 45° vinkel i forhold til det indfaldende strålebundt, og ca 10 cm efter wide-felt linse. Punkt AR coating mod Laserkilde. Dette sender det indfaldende strålebundt, og afspejler referencen og spredt bjælker i en 90° vinkel til det indfaldende strålebundt.
Figur 2: grove fokusering af iSCAT mikroskop. Skematiske viser arrangement af optik for at bringe systemet i fokus. AR-belagt bagsiden af beam splitter (70/30 BS) er markeret med rødt. Vigtigt afstande leveres i grøn. Brændvidder (f) af de brugte objektiver er angivet. Komponenter i den blå stiplet boks er tilføjet i trin 1.2.6 - 1.2.7. Den konkave linse (bruges til at re collimate konvergerende iSCAT strålen) og skærmen er fjernet senere. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: iSCAT mikroskop. Skematiske viser helt samlet iSCAT mikroskop. AR-belagt bagsiden af beam splitter (70/30 BS) er markeret med rødt. Vigtigt afstande leveres i grøn. Brændvidder (f) af de brugte objektiver er angivet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
-
Opsætning af ekstra billedbehandling kanaler.
Bemærk: Denne sektion tilføjer en anden tænkelig sti til mikroskop, der giver mulighed for observation af et stort område omkring iSCAT laser via-lysfelt mikroskopi og overvåge cellernes levedygtighed via Fluorescens mikroskopi.- Par output af en LED-lyskilde (ca. 500 nm < λ < 580 nm) ind i en lang arbejder afstanden 20 X / 0,4 NA mål, og installere mekaniske komponenter ovenfor i prøve salen der giver mulighed for fokuserer og lateral positionering af LED output på den prøven.
- Sikre, at LED output spektret dækker excitation række celle død markør (propidium Iodid (PI)) og ikke forstyrrer dens fluorescens (λ > 600 nm). Bruge optiske filtre, hvis nødvendigt.
- Flytte den øverste mål lateralt, så den øverste (wide-felt) og lavere (iSCAT) mål er kolineære. Dette bestemmes ved at placere en skærm under målet om lavere og maksimere intensiteten af LED lys på skærmen. Placer en λ = 550 nm kort-pass dichroic spejl (hovedformålet) at opdele de overførte LED lys fra iSCAT laser sti.
- Opdele denne stråle i to kanaler med en 8% reflective/92% Transmissiv beam splitter (BS). 92% sti er fluorescens kanal og stien 8% bruges til lysfelt billeddannelse.
- Billede lysfelt kanal på en CMOS kamera ved hjælp af en f = 5 cm akromatisk doublet linse.
- Billede fluorescens-kanal på en separat CMOS kamera ved hjælp af en f = 5 cm akromatisk doublet linse og en λ = 600 nm long-pass filter til at blokere excitation-lyset. Figur 4a viser en skematisk af den færdigsamlede mikroskop, herunder alle tænkelig kanaler.
- Par output af en LED-lyskilde (ca. 500 nm < λ < 580 nm) ind i en lang arbejder afstanden 20 X / 0,4 NA mål, og installere mekaniske komponenter ovenfor i prøve salen der giver mulighed for fokuserer og lateral positionering af LED output på den prøven.
Figur 4: iSCAT mikroskopi af protein udskilles af enkelt celler. (a) skematisk af mikroskopet beskrevet i protokollen. Se afsnit 1 for yderligere oplysninger. Forkortelser: LED, lysdiode; SPF, kort-pass filter. OBJ, mål; Hovedformålet, kort-pass dichroic spejl; BS, stråledeler; LPF, lang-pass filter. BF, lysfelt; fluor, fluorescens; C1-C3, kamera 1-3. (b) Bright-feltet billede af en enkelt Laz388 celle omkring 4 µm fra iSCAT synsfelt (skildret af en hvid firkant). Billede taget af kamera C3, skalalinjen: 10 µm. (c) fluorescens billede af det samme område med placeringen af cellen (b) præget af en hvid cirkel. Fravær af fluorescens angiver, at cellen er levedygtige. Billede taget af kamera C2, skalalinjen: 10 µm. (d) rå iSCAT kamera Billed Amatørfotografi med 80 µs eksponeringstid. Billede taget af kamera C1. (e) iSCAT billede af den samme region efter spatiotemporelle baggrund subtraktion som beskrevet i afsnittet diskussion. Billedet blev integreret over 1000 sekventielle rå rammer (d) med gangen endelige ramme 400 MS og afslører overfladeruhed af glas coverslip. (f) tilsvarende differentieret iSCAT billede, der viser den bindende hændelse af 2 proteiner på coverslip. Billedet blev beregnet ved at fratrække to på hinanden følgende filtreret billeder (e). Skalere barer i (d), (e), og (f): 1 µm. Dette tal er blevet tilpasset fra McDonald, M.P. et al. 16. ophavsret 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
-
Opsætning af computer og software.
- Tilslut alle kameraer til en computer. Installere respektive driverpakker og opnå/skrive software for deres kontrol.
Bemærk: Passende hardware er nødvendige for højhastighedstog erhvervelser. Som minimum anbefales en multi-core processor, 16 GB RAM, en ramme grabber kort og en solid state disk til lagring af data. - Observere iSCAT billede på CMOS kamera og sikre, at det er i fokus ved at finde en resterende støv eller snavs partikel på glas coverslip. Kontroller, at den partikel billede er et cirkulært symmetrisk punkt spredes funktion (PSF).
Bemærk: Den væsentligste årsag til en ikke-cirkulært symmetrisk PSF er at laserstrålen ikke træder målet lige men i en lille vinkel med hensyn til den optiske akse. Dette er korrigeret ved at justere vinklen og placeringen af det indfaldende strålebundt med 45° kobling spejl. - Sammenlign kamerabilleder af lysfelt og fluorescens-kanaler. Sikre, at begge er i fokus og vise det samme område. Kontroller, at placeringen af iSCAT laser er omtrent i midten af billedet og tager sin holdning til senere reference til efterretning. Se figur 4b-4f for typiske kamerabilleder.
Bemærk: Brug en celle prøve eller fluorescerende perler for at finde fokus for de to kanaler. Midlertidigt fjerne fluorescens long-pass filter for at justere systemet. Fokus for konventionelle billeddannelse af celler skal være lidt højere end iSCAT fokalplan. For at kompensere for dette uden at flytte målet, fortrænge kameraer fra deres stillinger i fokus i de to respektive f = 5 cm linser. - Angiv den nødvendige kamera parametre. Bruge en fast framerate og deaktivere software gevinst og korrektion værktøjer.
Bemærk: Følgende parametre er brugt: iSCAT kameraet er indstillet til 5000 billeder per sekund (fps) med en eksponeringstid 80 µs. Som nævnt ovenfor, er billedets størrelse 128 × 128 pixel. Både lyse-feltet og fluorescens kameraer fungere på full frame størrelse (1280 × 1024 pixel). Bright-felt imaging er udført med en 20 ms eksponeringstid. Fluorescens kameraet er indstillet til 750 ms eksponeringstid, og 5 på hinanden følgende frames er akkumuleret for at danne en endelige billede. Bright-felt og fluorescens billeder er erhvervet på faste 20 s tidsintervaller.
- Tilslut alle kameraer til en computer. Installere respektive driverpakker og opnå/skrive software for deres kontrol.
2. forberedelse af forsøget
-
Forbered stock mikroskopi medium.
- Tilsættes 25 mL HEPES Buffer (1 mol/L) til 975 mL af RPMI 1640 medie til at få en endelig 1 L 25 mmol/L HEPES opløsning. Alternativt, brug en buffer medium med HEPES allerede inkluderet.
Bemærk: HEPES bruges til at opretholde pH værdien af mediet under en måling i omgivende betingelser (fx udenfor en inkubator og uden konstant CO2 levering). - Tage en prøve af den løsning, der for et eksperiment og lad det varme op til stuetemperatur. 2 mL af medium er tilstrækkelig. Holde den resterende stamopløsning ved 4 ° C.
- Tilsættes 25 mL HEPES Buffer (1 mol/L) til 975 mL af RPMI 1640 medie til at få en endelig 1 L 25 mmol/L HEPES opløsning. Alternativt, brug en buffer medium med HEPES allerede inkluderet.
-
Forberede mikroskop kuvette.
Bemærk: De følgende trin beskriver proceduren for en specialbygget prøveholderen består af en aluminium bundplade og en akryl kuvette parabol, der både retter coverslip og par det til den piezoelektriske 3D positioner. Fås sterile kultur retter med et glas bund kan også bruges.
Bemærk: Figur 5 viser fotografier af specialbyggede prøveholderen.- Tage en ny mikroskopi coverslip og skyl det med deioniseret vand (DI-vand) og ethanol. Luft tørre dias med nitrogen eller trykluft.
- Ren coverslip i en ilt plasma atmosfære (0,3 mbar gastryk) i 10 min på 500 W RF power. Dette fjerner alle organiske urenheder fra overfladen.
- Ren akryl kuvette skålen ved at nedsænke det i 0,2 mol/L NaOH opløsning i ca 10 min. Skyl med Deioniseret vand.
- Samle prøveholderen og dække det med en plastik petriskål indtil det skal bruges i eksperimentet.
Figur 5: specialbyggede prøveholderen. (a) prøve indehaveren komponenter: (1) akryl kuvette parabol; (2) aluminium bundplade; (3) holde skruer; (4) silikone o-ringen; (5) coverslip. (b) helt samlet prøveholderen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
-
Forberede mikroskop.
- Tænd iSCAT belysning laser, lyse-felt/fluorescens belysning LED, kameraer og anskaffelse/computersoftware. Blokere laserstråle på en position før målet.
- Sikre, at 100 X / 1.46 NA mål er rent. Hvis ikke, bruge linse rengøring klude og ethanol til at rense mål i overensstemmelse med fabrikantens retningslinjer.
- Påfør en dråbe immersionsolie på mikroskop mål.
- Tage prøveholderen (samlet i afsnit 2.2) og omhyggeligt montere den på piezo-etape af iSCAT lup, så at prøve coverslip er centreret om mikroskop mål. Være opmærksom og omhyggelig for ikke at skade formålet objektivet. At fastgøre enheden til den piezoelektriske positioner med fingerskruer samtidig sikre, at fabrikanten angivet maksimale drejningsmoment ikke er overskrides.
- Der tilsættes 1 mL af stock mikroskopi mediet (parat i punkt 2.1.) i kuvette.
- Tilsæt 2 dråber af propidium Iodid pletten til medium som en celle død markør16,22.
- Fjerne blokeringen af laser og bringe systemet i fokus. Kontroller først, at formålet er placeret i den korrekte afstand fra coverslip ved at gentage trin 1.2.3. – 1.2.5. (Figur 2). Derefter finjustere fokus med z-aksen af piezo-etape.
- Bekræft, at alle indstillinger for lyskilder, kamera og software er indstillet korrekt. Dette omfatter parametre såsom laser power, LED-intensitet, kamera billedhastigheder, kamera eksponering gange eller software gemmer stier.
Bemærk: Gemme videoer på høj billedhastigheder kan producere store filstørrelser. Sikre nok fri diskplads på computeren. - Blokere laserstrålen igen. Mikroskop er nu klar til et eksperiment.
-
Forberede cellerne.
Bemærk: Laz388 celler20 er kulturperler i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), aminosyrer, pyruvat, og antibiotika. Cellerne er inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 og opdelt og forsynet med friske medium hver 2-3 dage23.- Tage celle kultur kolben fra rugemaskinen og Opsug medium indeholdende ca 1 x 106 celler. For at bestemme den korrekte mængde, kvantificere koncentrationen af cellekultur ved brug af en hemocytometer.
- Bland den celle løsning med 10 mL af RPMI 1640 medium ved stuetemperatur og centrifugeres stikprøve på 300 x g i 7 min.
- Omhyggeligt uddrag og supernatanten samtidig med at pille af koncentreret celler fortsat er uforstyrret.
- Gentag trin 2.4.2. – 2.4.3. med koncentreret pellet af celler.
- Genopslæmmes celler i 0,5 mL stock mikroskopi mediet (parat i punkt 2.1.) og straks bruge dem i et eksperiment.
3. iSCAT mikroskopi af hemmelig celler
- Sikre, at Laserstrålen blokeres for at forhindre cellerne i at blive direkte udsat for iSCAT laserlys.
- Tilføre prøve kuvette cellerne.
- Tilføre prøve kuvette ca 3 µL af celle prøven (forberedt i afsnit 2.4.) lidt off-center. Blidt røre pipette tip til coverslip og langsomt injicere cellen løsning. Tillad cellerne til at slå sig ned på coverslip.
Bemærk: Brug små mængder pipette tips (10 µL) eller lang, fleksibel gel-loading tips. - Sikre, at tætheden af celler er under ca 1 celle pr. 500 µm², så én celle målinger ikke påvirkes af flere celler i området omkring iSCAT laser.
- Hvis antallet af celler er for lavt, gentages trin 3.2.1. indtil der findes et tilstrækkeligt antal.
- Hvis dækningen af celler er for tætte, bruge en indsprøjtning af ca 20 µL af yderligere mikroskopi medium til at sprede cellerne på tværs af coverslip.
- Tilføre prøve kuvette ca 3 µL af celle prøven (forberedt i afsnit 2.4.) lidt off-center. Blidt røre pipette tip til coverslip og langsomt injicere cellen løsning. Tillad cellerne til at slå sig ned på coverslip.
- Brug piezo positioner, flytte prøve lateralt til at placere en celle tæt (ca. 10 µm) til iSCAT synsfelt. Sikre, at cellen ikke træder iSCAT synsfelt, som direkte eksponering for 445 nm laserlys kan være skadelige for cellen.
- Brug lyse-felt og fluorescens billeder at finde og kontrollere den celle levedygtighed25.
Bemærk: En levedygtig celle har en rund form i lysfelt billedet og er ikke fluorescerende, mens celledød er angivet med stærk fluorescens signaler som følge af tilstedeværelsen af propidium Iodid inde i cellen22. - Fjerne blokeringen af iSCAT laserstråle og sikre, at coverslip overfladen er stadig i fokus. Vedlægge tabellen isolation for at minimere drift og akustisk kobling fra de omgivende omgivelser.
Bemærk: Sidstnævnte er udført med kraftig optisk gardiner eller akryl paneler omgiver tabellen optisk. - Start målingen af hentning af billeder fra iSCAT, lyse-felt og fluorescens-kameraer. Automatisere og styre processen gennem software til at maksimere eksperimentelle effektivitet. Kontrollér med jævne mellemrum cellen levedygtighed og fokus i systemet.
Bemærk: Afhængigt af laser intensitet, optiske komponenter og eksponeringsindstillinger i kameraet, iSCAT laser kan interferere med fluorescens kamera. Hvis denne adfærd er observeret, kan du overveje at forskallingen iSCAT laser midlertidigt under fluorescens billede erhvervelser.
4. dataanalyse
Bemærk: Eksperimentelle data er i sagens natur støjende, og iSCAT billeder er ikke anderledes. Der er flere kilder til støj i et typisk iSCAT måling, herunder wavefront forvridninger i hændelse lyskilde, overfladeruhed coverslip og kamera støj. Nedenstående afsnit præsenterer nogle måder, hvorpå disse støjkilder er afhjulpet via efterbehandling. Derudover laterale mekanisk ustabilitet i opsætningen af føre til støjende data og skal behandles som beskrevet i afsnittet diskussion nedenfor. De beskrevne analyser er udført med brugerdefinerede scripts, MATLAB.
- Minimere kamera støj ved at filtrere de rå data med en to-dimensionelle Fourier filter, der udelukker høj rumlige frekvenser. Størrelsen af filteret skal justeres for at passe den specifikke eksperimentelle variant (for det meste bestemmes af systemets numerisk blænde).
Bemærk: Træk i billedet med højere rumlige frekvenser end det optiske system stammer fra eksterne kilder (såsom kamera udlæsning støj) og kan blive forsømt. - Konvertere billederne fra raw kamera tæller til iSCAT kontrast.
Bemærk: Signal detekteres af kameraet er
. iSCAT kontrast er defineret som 
hvor 
er intensiteten af lys, reference, i dette tilfælde del afspejles af coverslip, og 
er interferens mellem og de spredte intensitet (
).- Adskille signal ind i og ved at beregne den tidsmæssige middelværdi af særlige rammer hvor partikler af interesse ikke er til stede. Den resulterende billede giver reference signal .
Bemærk: Alternativt, en aktiv baggrund subtraktion trin kan udføres som beskrevet i debatten nedenfor. - Beregne kontrast i henhold til
12,14,16.
- Adskille signal ind i
- Oprette en rullende differentieret billede ved at trække hver på hinanden følgende billede fra sin efterfølger.
Bemærk: Resterende signaler fra overfladeruhed af coverslip og wavefront fordrejninger fjernes effektivt i dette trin, da de er konstant inden for sammenhængende rammer. Det rullende differentierede fjerner disse resterende signaler, forlader kun protein bindingerne, der opstår fra en ramme til næste. Denne dynamiske baggrund subtraktion er gavnligt, da det ikke er følsomme over for langsigtet prøve driver. - Anvende en peak-søger algoritme til at opdage og indeksere én partikler for hver ramme for at fastslå deres specifikke kontrast og holdning.
- Bruge de indsamlede i trin 4.4 oplysninger til at oprette histogrammer af protein bindende begivenheder og relatere deres udpakkede kontraster at protein massen gennem en kalibreringskurve kompileret fra kendte protein prøver14,24.
. iSCAT kontrast er defineret som 
hvor 
er intensiteten af lys, reference, i dette tilfælde del afspejles af coverslip, og 
er interferens mellem 
).
12,14,16.Representative Results
En skematisk af en iSCAT mikroskop er vist i figur 4a. Repræsentative lysfelt, fluorescens og rå iSCAT billeder er vist i figur 4b, 4 cog 4 d, henholdsvis16. Figur 4e og 4f vise resultaterne af baggrund fjernelse og differentieret efterbehandling; to adsorberet proteiner er synlig som diffraktion-begrænset steder i figur 4f. Figur 6 viser et histogram over de fundne proteiner i løbet af 125 s. Disse data blev opnået ved at anvende en peak-søger algoritme til billederne at tælle de bindende begivenheder og katalogisere deres kontrast16. Et samlet antal på 503 proteiner blev opdaget.
Næste, udskilles arter er identificeret forhold referencemålinger udføres på oprenset protein løsninger, eller gennem yderligere målinger med functionalized glas overflader14,16. ISCAT data, visualisere således direkte cellulære sekretion dynamik på en subsecond skala16. Som et eksempel, har vi tidligere fundet at IgG antistoffer, en stor del af Laz388 secretome og frigives fra celle med en hastighed på ca. 100 molekyler per andet16. Derudover er andre partikler, der spænder over en række 100 kDa - 1000 kDa udskilles af celler16. Den beskrevne metode kan være yderligere ansat f.eks., at undersøge den rumlige koncentration graduering af sekreter omkring en celle16, eller til at bestemme den tidsmæssige dynamics af cellulære lysis16.
Figur 6: kvantificering af udskilles proteiner af en enkelt Laz388 celle. Histogrammet viser fundne proteiner i en periode af 125 s. kontrast værdier akkumuleres i 1 x 10-4 kontrast placeringer (blå søjler). I alt 503 individuelle proteiner blev talt under denne måling. Eksperimentet blev gentaget 10 gange med lignende resultater. Dette tal er blevet tilpasset fra McDonald, M.P. et al. 16. ophavsret 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
En af de mest afgørende aspekter til at opnå nyttige iSCAT data er evnen til at finde den korrekte fokale position på coverslip overflade og endvidere, at holde denne stilling i lange perioder. Ikke at gøre dette vil resultere i bredere vævede, svag iSCAT signaler og drift-associerede artefakter i dynamics analyser. Det viser sig at finde brændplanet på en ren, nøgne coverslip overflade ikke er en let opgave som overflade funktioner ikke er synlig baggrund beam store reference (Se figur 4 d).
Rå iSCAT billeder er ofte overskygget af baggrunden signaler, der opstår fra wavefront urenheder i magnetisering kilde, og kan hæmme ens evne til at finde den korrekte tænkelig plan. Aktive wavefront subtraktion er en nyttig måde at omgå dette problem og efterfølgende overvåge iSCAT fokus under en måling16. En måde at opnå dette er gennem fysisk prøve graduering. Kort sagt, gælder en funktionsgenerator en 50 Hz firkantet bølge til havnens ekstern kontrol af den piezo fase, hvilket resulterer i en fysisk prøve graduering på de anvendte frekvens (290 nm amplitude). Synkron kamera opkøb er udløst fra samme kilde, og når de kombineres gennem lock-in principper, resulterer i en wavefront-kompenseret billede14,16. Den resulterende billede viser typisk overfladeruhed af coverslip (figur 4e). Små features resterende på glasset efter rengøring kan bruges til at bringe mikroskop i fokus. Parametre, der bruges til denne aktive baggrund subtraktion trin kan ændres efter den billedfrekvens, eksponeringstid eller hardware.
Som nævnt ovenfor, brug af en høj kvalitet stråledeler i opsætningen af iSCAT (trin 1.2.1.) anbefales som billeddannelse artefakter som ghosting eller forstyrrelser som følge af tynd planar stråle splittere vil påvirke billedet og forstyrre målingen. Figur 7 viser en sammenligning mellem en høj kvalitet og lav kvalitet stråledeler. Både rå iSCAT billeder viser den samme område på den coverslip, der indeholder nogle resterende partikler. Den samme iSCAT opsætning blev brugt til at fange både billeder, kun stråledeler blev udvekslet. Figur 7a viser det billede, der dannes på kameraet ved hjælp af en tykkere (5 mm), AR-belagt, og klemt stråledeler. Den kilet design, den reflekterede stråle fra ryg overfladen af beam splitter er anti-parallelle til de overvejelser, der opstår fra den forreste overflade og går ikke ind i målet. Ingen indblanding artefakter forekomme. Figur 7b viser det samme synsfelt på prøve, men denne gang en tyndere (1 mm) planar beam splitter blev brugt. De to refleksioner fra front og bagside af beam splitter er parallelle og overføres til kameraet. Interferens artefakter er klart synlige.
Figur 7: sammenligning af iSCAT billeder produceret med høj og lav kvalitet beam splittere. (a) resulterende rå iSCAT billede ved brug af en 5 mm tyk, AR-belagt og kilet beam splitter. (b) resulterende rå iSCAT billede af det samme område ved brug af en 1 mm tyk planar stråledeler. Begge beam splittere har samme opdeling mellem (50% refleksion, 50% transmission). Interferens artefakter som følge af Fresnel refleksioner er tydeligt observeret i billedet produceret med 1 mm tyk planar beam splitter. Skalere barer: 2 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
I denne protokol beskriver vi en wide-felt belysning ordning for iSCAT da det er hurtigt, let at indse og giver mulighed for parallelle sensing over et stort område14. En anden fælles tilgang er at bruge akustisk-optisk deflektorer (delegation) og scanne en Konfokal stråle på tværs af prøven12,17. Denne tilgang undgår behovet for høj kvalitet wavefronts men er mere eksperimentelt komplekse end konventionelle wide-felt billeddannelse. Derudover er Konfokal belysning hastighed begrænset af, af delegation. Afhængigt af de ønskede eksperimentelle parametre, kan, enten Konfokal eller wide-felt belysning ordninger i princippet, udnyttes til at opdage enkelt proteiner udskilles fra levende celler.
Som omtalt i hele protokollen, er det nødvendigt at minimere laterale mekaniske svingninger i prøven fase af mikroskopet. Selv nanometer afvigelser i positionen af prøven kan føre til variationer i træk kamera rammer og fremkalde betydelige uvedkommende støj i differential billedet. Det anbefales derfor at bruge en mekanisk stabile mikroskop fase og en dæmpet optisk tabel (trin 1.1.1.) og dække setup med optisk gardiner eller paneler under et eksperiment (trin 3.5.).
En aktiv fokus stabilization ordning kan også overvejes langsigtet målinger. I denne tilgang, er en anden laser indarbejdet i mikroskop i en total interne reflection (TIR) arrangement, og efterfølgende afbildet på en kvadrant fotodiode. Ændringer i systemets fokus oversætte til sideværts forskydninger af TIR-laser spot på kvadrant diode, som derefter kan bruges i en aktiv feedback loop til at kontrollere om z-aksen af piezo fase26. Lodret drift langtidsvirkninger er dermed elimineret.
Flere ændringer og udvidelser kan anvendes til den præsenterede teknik til at løse specifikke eksperimentelle behov. For eksempel, kommercielle mikroskop fase inkubatorer er tilgængelige, kan let integreres i iSCAT mikroskop for langsigtet billeddannelse af celler. Andre teknikker kan også implementeres som supplement til iSCAT imaging, såsom Konfokal eller TIR-fluorescens microscopies17. For at tilpasse systemet under undersøgelsen, iSCAT sekretion målingerne kan foretages i andre celle medier såsom DMEM eller DPBS, dog bør pH indikator phenol rød undgås da det kan forstyrre eksperimentet på grund af absorption af laserlys. Derudover indeholder supplerer gerne føtalt kalveserum (FCS) eller menneskelige trombocyttal lysate (hPL) proteiner, der kan forstyrre iSCAT opdagelse. Afhængigt af den ønskede følsomhed af eksperimentet, bør disse kosttilskud udelukkes fra mikroskopi medium.
iSCAT er afhængig af en analysand evne til scatter lys – en egenskab, der er iboende til alle proteiner – og er derfor i sagens natur uspecifik. Ikke desto mindre er en vis grad af specificitet muligt som iSCAT signaler skalaen lineært med protein masse14,27,28. Dette giver mulighed for kalibrering af et iSCAT system ved hjælp af standard protein prøver, som bovint serumalbumin (BSA) og fibrinogen14,27,28. I virkeligheden, for nylig, unge et al. 28 har udvidet på arbejdet i Piliarik & Sandoghdar14 og har vist, at iSCAT kan bruges til at bestemme molekylvægt af proteiner så lille som streptavidin (53 kDa) med en masse resolution af 19 kDa og en nøjagtighed på omkring 5 kDa. Flere konventionelle tilgange kan yderligere supplerer iSCAT ved at give en ekstra grad af specificitet. Som et eksempel, enzym-forbundet immunosorbent assays (ELISA), og/eller andre overflade ændringer, skal du begrænse protein bindende begivenheder, så kun target proteinet er fundet16.
I denne protokol beskrev vi, hvordan iSCAT mikroskopi kan bruges til at undersøge cellulære sekreter på enkelt protein niveau med subsecond tidsmæssige opløsning16. Teknikken er generelle og kan gennemføres på nogen kommerciel eller hjem-bygget mikroskop. I modsætning til enkelt-molekyle fluorescens tilgange, metoden, der ikke lider af photobleaching eller blinker effekter, men det stadig opnår single-protein følsomhed. Disse funktioner gør iSCAT et kraftfuldt værktøj inden for biosensing og mikroskopi. Fremtidige ansøgninger vil fokusere på belyse komplekse cellulære vekselvirkninger såsom immunologiske reaktion på en stimulus eller cellulære kommunikation.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Max Planck Society, en Alexander von Humboldt professorat og Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC 1181). Vi takker Stefanie Schaffer på Universitätsklinikum Erlangen, for at give Laz388 celler og til nyttige diskussioner. Vi takker Simone Ihloff og Maksim Schwab på MPL for teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item/Device | |||
| 100x / 1.46 NA objective | Zeiss | 420792-9800-000 | alpha Plan Apochromat oil immersion |
| 20x / 0.4 NA objective | Leica | 566049 | N Plan |
| Piezo Stage | PI | P-517k020 | 3-axis stage with 100x100x10µm range |
| Diode laser (445 nm) | Lasertack | PD-01236 | |
| Optics/Optomechanics | Thorlabs/Newport | - | lenses, mirrors, posts, mounts |
| Pinhole | Thorlabs | P30H | |
| LED light source | Thorlabs | MCWHL5 | |
| Shortpass filter (580 nm) | Omega Optical | 580SP | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
| Longpass filter (500 nm) | Thorlabs | FEL0500 | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
| 70R/30T beam splitter | Newport | 20Q20BS.1 | |
| Economy beam splitter | Thorlabs | EBS1 | used for the comparison of fringe effects |
| Wedged plate beam splitter | Thorlabs | BSW26 | used for the comparison of fringe effects |
| Shortpass dichroic mirror (550 nm) | Edmund Optics | 66249 | |
| 8R/92T beam splitter | Thorlabs | BP108 | |
| CMOS camera | Photonfocus | MV1-D1024E-160-CL | for iSCAT aquisition |
| CMOS cameras | Mightex | SCE-B013-U | for bright field / fluorescence aquisition |
| Longpass filter (600 nm) | Thorlabs | FELH0600 | |
| Computer | Fujitsu Siemens | - | Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD |
| Acquisition Software | LabVIEW | - | LabVIEW 2016 Suite |
| Analysis Software | Matlab | - | Matlab 2014 Suite |
| Plasma Cleaner | Diener | Diener pico | |
| Incubator | Binder | Model CB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Reagent/Material | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11835063 | without phenol red |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Sigma Aldrich | 59205C | |
| Cover slides | Marienfeld | 107052 | |
| Glass bottom culture dishes | ibidi | 81158 | |
| Fluorescent Microspheres | Invitrogen | F8821 | used for calibration |
| Immersol immersion oil | Zeiss | 444960 | |
| Propidium iodide stain | Invitrogen | R37108 | |
| Small pipette tips | Eppendorf | 30075005 | |
| Flexible pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Ethanol, 99.8% | Fisher Scientific | E/0650DF/15 | |
| Sodium hydroxide, pellets | Sigma Aldrich | 221465 | for preparing 0.2M NaOH solution |
References
- Hathout, Y. Approaches to the study of the cell secretome. Expert Review of Proteomics. 4 (2), 239-248 (2007).
- Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405 (6788), 837-846 (2000).
- Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. Journal of Proteomics. 73 (12), 2291-2305 (2010).
- Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).
- MacBeath, G. Protein microarrays and proteomics. Nature Genetics. 32, 526-532 (2002).
- Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8 (4), 247-258 (2008).
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Borisov, S. M., Wolfbeis, O. S. Optical biosensors. Chemical Reviews. 108 (2), 423-461 (2008).
- Dantham, V. R., Holler, S., Barbre, C., Keng, D., Kolchenko, V., Arnold, S. Label-Free Detection of Single Protein Using a Nanoplasmonic-Photonic Hybrid Microcavity. Nano Letters. 13 (7), 3347-3351 (2013).
- Zijlstra, P., Paulo, P. M. R., Orrit, M. Optical detection of single non-absorbing molecules using the surface plasmon resonance of a gold nanorod. Nature Nanotechnology. 7 (6), 379-382 (2012).
- Rickgauer, J. P., Grigorieff, N., Denk, W. Single-protein detection in crowded molecular environments in cryo-EM images. eLife. 6, e25648 (2017).
- Lindfors, K., Kalkbrenner, T., Stoller, P., Sandoghdar, V. Detection and Spectroscopy of Gold Nanoparticles Using Supercontinuum White Light Confocal Microscopy. Physical Review Letters. 93 (3), 037401 (2004).
- Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface. Optics Express. 14 (1), 405 (2006).
- Piliarik, M., Sandoghdar, V. Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites. Nature Communications. 5, 4495 (2014).
- Roux, K. H. Immunoglobulin Structure and Function as Revealed by Electron Microscopy. International Archives of Allergy and Immunology. 120 (2), 85-99 (1999).
- McDonald, M. P., et al. Visualizing Single-Cell Secretion Dynamics with Single-Protein Sensitivity. Nano Letters. 18 (1), 513-519 (2018).
- Kukura, P., Ewers, H., Müller, C., Renn, A., Helenius, A., Sandoghdar, V. High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus. Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).
- Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging. Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).
- Spindler, S., et al. Visualization of lipids and proteins at high spatial and temporal resolution via interferometric scattering (iSCAT) microscopy. Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (27), 274002 (2016).
- Lazarus, H., et al. Characterization of a unique cell line (LAZ 221) from human acute lymphocytic ("null" cell) leukemia. Cancer Research. 38 (5), 1362-1367 (1978).
- Mackensen, A., et al. Evidence for in situ amplification of cytotoxic T-lymphocytes with antitumor activity in a human regressive melanoma. Cancer Research. 53 (15), 3569-3573 (1993).
- Crowley, L. C., Scott, A. P., Marfell, B. J., Boughaba, J. A., Chojnowski, G., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), 647-651 (2016).
- Freshney, R. I. Primary Culture. Culture of Animal Cells. , (2005).
- Dahmardeh, M., et al. Unpublished data. , (2018).
- Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. American Journal of Pathology. 146 (1), 3-15 (1995).
- Bellve, K., Standley, C., Lifshitz, L., Fogarty, K. Design and Implementation of 3D Focus Stabilization for Fluorescence Microscopy. Biophysical Journal. 106 (2), 606a (2014).
- Liebel, M., Hugall, J. T., Van Hulst, N. F. Ultrasensitive Label-Free Nanosensing and High-Speed Tracking of Single Proteins. Nano Letters. 17 (2), 1277-1281 (2017).
- Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
