从小鼠的补丁中提取体液免疫的关键参与者: 先进和优化的淋巴细胞分离协议
Summary
在这项研究中, 我们提出了一个新的和有效的方案, 从 peyer 的补丁 (pp) 的淋巴细胞分离, 随后可用于体内和体外功能分析, 以及流式细胞仪研究的卵泡 t辅助和萌发中心 b 细胞。
Abstract
在肠道黏膜中, 免疫细胞构成了一个独特的免疫实体, 它促进免疫耐受, 同时增强免疫防御病原体。通过承载几个效应 t 和 b 细胞子集, 人们已经很好地证实了 peyer 的贴片 (pp) 在黏膜免疫网络中的重要作用。这些效应细胞、滤泡 t 辅助细胞 (tfh) 和生殖细胞 (gc) b 细胞的一部分在体液免疫调节方面具有专业化功能。因此, 在 pp 内对这些细胞亚群的分化程序和功能特性进行表征可以提供有关黏膜免疫的重要信息。为此, 一种易于应用、高效和可重复的从 pp 中分离淋巴细胞的方法对研究人员具有重要意义。在这项研究中, 我们的目的是建立一个有效的方法来分离淋巴细胞从小鼠 pp 具有高细胞产量。我们的方法表明, 最初的组织处理, 如使用消化试剂和组织搅拌, 以及细胞染色条件和抗体面板的选择, 有很大的影响质量和身份的分离淋巴细胞和实验结果。
在这里, 我们描述了一个协议, 使研究人员能够有效地从 pp 中分离出淋巴细胞群, 从而对 t 和 b 细胞子集进行可重复的流式细胞化评估, 主要侧重于 tfh 和 gc b 亚群。
Introduction
从开始到结束, 整个胃肠道都装饰着广泛的淋巴网络, 其中含有的免疫细胞比人类和小鼠1中的任何其他器官都要多。peyer 的贴片 (pp) 是这个细胞免疫组织的肠道分支的主要组成部分, 即所谓的肠道相关淋巴组织 (galt)2,3。在 pp 中, 成千上万的抗原来自膳食材料、微生物群和病原体, 正在不断取样, 必要时对其进行适当的免疫反应, 从而保持肠道免疫稳态。从这个意义上说, pp 可以被命名为 “小肠扁桃体”。pp 由主要的亚隔组成: 上皮下圆顶 (sed)、大 b 细胞卵泡区;t 细胞所在的上覆卵泡相关上皮 (fae) 和卵泡间区域 (ifr).这种独特的分块的 pp 使不同的效应细胞亚群合作, 从而赋予免疫能力的肠道。
pp 缺乏传入淋巴管, 由于这个原因, 从小肠输送到 pp 的抗原没有通过淋巴管进行, 而不是与大多数其他淋巴器官相比。相反, 位于 fae 的特殊上皮细胞, 即所谓的 m 细胞, 负责将腔内抗原转移到 ppp5中。随后, 被运输的抗原被树突细胞 (dc) 和吞噬细胞所吸收, 这些细胞位于 fae6,7下的上皮圆顶 (sed) 区域。pp 中 dc 的抗原分选过程对于启动自适应免疫反应8和随后产生的 iga 分泌细胞9至关重要。
由于同源植物区系和膳食材料的抗原负担很重, pp 在 tfh和 iga + gc b 细胞10等大量细胞中存在内源激活效应 t 和 b 细胞亚群, 这表明 pp 是活性免疫的部位响应11。在未接种的幼小 c57bl6 小鼠中收集的 pp 中, 可检测到 cd4 + t 细胞室中高达20–25% 的 tfh 细胞, 在总 b 细胞中可检测到高达 10-15%的 gc b 细胞。与其他 t 辅助细胞类型 (即th1、th2、th17 细胞) 不同, tfh 细胞对 b 细胞的独特取向主要是由于 cxcr5 表达, 从而促进 tfh 细胞沿 cxcl13 梯度13归巢。在 pp 的 b 细胞卵泡区, tfh 细胞诱导 iga 类开关重组和体细胞重组在激活的 b 细胞中, 高亲和力 iga 产生细胞从中分化14。随后, 这些抗体分泌的血浆细胞迁移到固有层 (lp), 调节肠道内的免疫稳态 10.
在 pp 中确定和鉴定 tfh 和 gc b 细胞群, 可以使研究人员在稳定状态下研究体液免疫反应的动态, 而无需耗时的免疫模型传统上用于 tfh-gc b 细胞研究 15、16、17、18。分析 pp 中的 tfh 细胞并不像其他细胞子集那么简单。技术挑战包括确定理想的组织制备条件、表面抗体标记组合, 以及选择适当的阳性和阴性对照。tfh 和 pp 研究领域在实验过程方面都表现出很大的差异, 由于几个原因, 它们远远没有就建立标准化协议达成共识。首先, pp 中的每个细胞子集往往受到组织制备条件的不同影响, 需要以特定于细胞的方式进行进一步的修饰。第二, 所报告的方法在 pp 细胞制备细节方面存在显著差异. 第三, 研究理想组织制备技术和实验条件的基于协议的比较研究的数量对于 pp 和 tfh 的研究是相当有限的。
目前基于协议的研究表明, pp 细胞制备19,20,21,22不是 tfh-或 gc b 细胞为导向。此外, 一些组织制备条件推荐的 ppp19,20 , 如基于胶原蛋白的消化被发现影响 tfh 的结果, 流式细胞术对结果进行了否定的18。在此基础上, 我们推断, 一个优化的、标准化的和可重复的协议, 可用于研究 ppp 中的 tfh 和 gc b 细胞动力学, 这对研究这一主题的研究人员将是有价值的。这种需要使我们有动力为 pp 淋巴细胞的分离和表征制定了改进的最新协议, 该协议经过了很好的优化, 可用于细胞恢复、活力和几个 t 和 b 的流式细胞仪表征的效率单元格子集。我们还旨在排除以前的协议中建议的几个费力的制备步骤, 从而减少从 pp 组织和细胞制备所需的操作和时间。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 我们描述了一个优化的协议流式细胞仪表征 tfh 和 gc b 细胞。我们的协议的主要优点之一是, 它能够从单个小鼠 (c57bl6 菌株) 中分离出多达 107 (平均 4-5 x 10 6 细胞) 的总 pp 细胞, 而无需任何消化过程。我们观察到, 细胞总产量与 pp 的数量呈正相关, 可以从以下简单的方程中估计出来, 这对实验规划很有帮助: “每只小鼠的总 pp 细胞计数 = 0.5–1 x (每只切除 pp 的数量…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢劳拉·施特劳斯和彼得·萨奇对流式细胞术分析的有益讨论和支持。
Materials
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 ml syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
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