Unraveling i giocatori chiave di immunità umorale: avanzata e ottimizzata protocollo di isolamento del linfocita da Patches murino placche di Peyer
Summary
In questo studio, presentiamo un romanzo e un efficace protocollo per l’isolamento dei linfociti da placche di Peyer (PPs), che può essere utilizzati successivamente per saggi funzionali in vivo ed in vitro come pure gli studi cytometric di flusso di follicolare T Helper e cellule centro germinale B.
Abstract
Nella mucosa dell’intestino, cellule immunitarie costituiscono un’entità unica immunologica, che promuove la tolleranza immunitaria mentre contemporaneamente conferimento difesa immunitaria contro gli agenti patogeni. È affermato che di Peyer (PPs) hanno un ruolo essenziale nella rete immune mucosa ospitando diversi T effettrici e sottoinsiemi delle cellule B. Una certa frazione di queste cellule effettrici, follicolare T helper (TFH) e cellule di B del centro germinativo (GC) sono professionalizzata nella regolazione dell’immunità umorale. Quindi, la caratterizzazione di questi sottoinsiemi di cellule all’interno di PPs in termini di loro programma di differenziazione e proprietà funzionali può fornire informazioni importanti sull’immunità mucosale. A tal fine, un metodo facilmente applicabile, efficace e riproducibile di isolamento dei linfociti da PPs sarebbe prezioso per i ricercatori. In questo studio, abbiamo mirato a generare un metodo efficace per isolare i linfociti da mouse PPs con resa elevata delle celle. Il nostro approccio ha rivelato che l’elaborazione come l’uso di reagenti digestivi e agitazione del tessuto, il tessuto iniziale così come colorazione condizioni e selezione dei pannelli di anticorpo delle cellule, hanno una grande influenza sulla qualità e identità dei linfociti isolati e il risultati sperimentali.
Qui, descriviamo un protocollo che consente ai ricercatori di isolare in modo efficiente popolazioni linfocitarie da PPs permettendo la valutazione di base di citometria a flusso riproducibile dei sottoinsiemi di cellule T e B concentrandosi soprattutto su sottoinsiemi di cellule TFH e GC B.
Introduction
L’intero tratto gastrointestinale dall’inizio alla fine è addobbato con una vasta rete di linfoide che contiene le cellule immunitarie più di qualsiasi altro organo in essere umano e del mouse1. Peyer di patch (PPs) costituiscono una componente importante del ramo intestinale di questa organizzazione immune cellulare, cosiddetto tessuto linfoide associato all’intestino (GALT)2,3. All’interno di PPs, migliaia di milioni di antigeni derivati da materiali dietetici, agenti patogeni e commensale microbiota sono campionati continuamente e quando necessarie e appropriato le risposte immunitarie verso di loro sono montato così mantenere immunitario intestinale omeostasi. In questo senso, PPs può essere denominata come “tonsille del piccolo intestino”. PPs sono costituiti principali sub-compartimenti: cupola subepiteliale (SED), ampie zone di B-cellula del follicolo; l’epitelio sovrastante follicolo-collegata (FAE) e la regione interfollicular (IFR) dove le cellule T sono situati4. Questa compartimentazione unica di PPs sottoinsiemi di cellule effettrici diverse consente di cooperare, conferisce quindi, immunocompetenza nell’intestino.
PPs mancano vasi linfatici afferenti, e proprio per questo motivo, gli antigeni trasportati in PPs dal piccolo intestino non sono stati condotti attraverso i vasi linfatici in contrasto con la maggior parte degli altri organi linfoidi. Invece, le cellule epiteliali specializzate situate in FAE, cosiddette cellule M, sono responsabili per il trasferimento degli antigeni luminal in PPs5. Successivamente, gli antigeni trasportati sono stati prelevati dalle cellule dendritiche (DCs) e fagociti che si trovano nella regione subepiteliale cupola (SED) sotto la FAE6,7. Questo processo di cernita di antigene da DCs in PP è fondamentale per avviare la generazione successiva di IgA che secerne le cellule9e risposta immunitaria adattativa8 .
Dovuto il pesante fardello antigenico da flora commensale e materiale alimentare, PPs host in modo endogeno attivato T effettrici e sottoinsiemi di cellule B in grande abbondanza come TFH e IgA+ GC B cellule10, suggerendo che il PPs rappresentano un sito di attivo immune risposta di11. Rilevazione di fino a 20 – 25% cellule TFH all’interno totale CD4+ T cell vano e fino a 10 – 15% GC B cellule all’interno di cellule B totali è possibile in PPs raccolti da non immunizzati giovane di topi C57BL/612. A differenza di altri tipi di cellula dell’assistente di T (cioè., Th1, Th2, Th17 cellule), TFH cellule mostrano tropismo unico in follicoli di cellule B principalmente a causa di espressione CXCR5, che promuove l’homing delle cellule TFH lungo gradienti CXCL1313. Nelle zone delle cellule di B del follicolo di PPs, TFH cellule inducono IgA classe interruttore ricombinazione e ipermutazione somatica in cellule di B attivate da cui ad alta affinità IgA producendo cellule differenziano14. Successivamente, queste cellule di plasma disecrezione migrare verso la lamina propria (LP) e regolano l’omeostasi immune nell’ intestino10.
Identificazione e caratterizzazione di popolazioni di cellule TFH e GC B all’interno di PPs potrebbe consentire ai ricercatori di studiare la dinamica della risposta immunitaria umorale sotto condizioni di stato stazionario senza la necessità di modelli di immunizzazione richiede molto tempo utilizzato tradizionalmente in TFH-GC B cella studi15,16,17,18. Analizzando le cellule TFH entro PPs non è così semplice come altri sottoinsiemi di cellule. Sfide tecniche includono identificare condizioni di tessuto ideale preparazione, combinazione di anticorpo-indicatore della superficie, così come la selezione di appropriati controlli positivi e negativi. Campi di ricerca sia TFH e PP presentano grande variabilità in termini di procedure sperimentali e sono tutt’altro che conferisce un consenso per stabilire protocolli standardizzati per diversi motivi. In primo luogo, ogni sottoinsieme delle cellule all’interno di PPs tende a risentire differenzialmente condizioni di preparazione dei tessuti che richiedono ulteriori modifiche nel modo di sottoinsieme specifico delle cellule. In secondo luogo, c’è una discrepanza significativa tra i metodi segnalati per quanto riguarda i dettagli della preparazione delle cellule da PPS. terzo, il numero di studi comparativi basati su protocollo studiando tecniche di preparazione del tessuto ideale e condizioni sperimentali per PP e TFH ricerca è piuttosto limitato.
Attuali studi basati su protocollo suggeriti per PP cella preparazione19,20,21,22 non erano TFH – o GC delle cellule di B-oriented. Inoltre, alcune condizioni di preparazione del tessuto consigliati per PPs19,20 come digestione basati su collagenosi sono stati trovati per influenzare negativamente il risultato dell’identificazione di TFH tramite flusso cytometry18. Su questa base, abbiamo ragionato che un protocollo ottimizzato, standardizzato e riproducibile che può essere utilizzato per studiare la dinamica cellulare TFH e GC B all’interno di PPs sarebbe prezioso per gli investigatori lavorando su questo argomento. Questa necessità ci ha dato l’impulso per generare un protocollo migliorato e aggiornato per l’isolamento e la caratterizzazione dei linfociti PP finemente ottimizzato per recupero cellulare, redditività ed efficienza per la caratterizzazione di cytometric di flusso delle diverse T e B sottoinsiemi di cellule. Abbiamo anche mirato a escludere diversi passaggi di laboriosa preparazione suggeriti nei precedenti protocolli, quindi, riducendo le opportune manipolazioni e i tempi per la preparazione di tessuti e cellule da PPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per la caratterizzazione di cytometric di flusso delle cellule TFH e GC B. Uno dei vantaggi principali del nostro protocollo è che permette l’isolamento di fino a 10 cellule PP totale7 (media 4 – 5 x 106 cellule) da un singolo mouse (ceppo C57BL/6) senza alcun processo digestivo. Abbiamo osservato che la resa totale delle cellule è stata correlata positivamente con il numero di PPs e poteva essere stimata dalla seguente equazione semplice che è utile p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Laura Strauss e Peter Sage per utili discussioni e supporto con analisi di citometria a flusso.
Materials
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 ml syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
References
- van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
- Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
- Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
- Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer’s patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
- Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
- Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
- Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
- Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
- Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
- Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
- Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
- Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
- Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
- Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
- Espéli, M., Walker, J. M. . T follicular helper cells – Methods and Protocols. , (2015).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
- Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
- Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
- Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
- Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
- Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
- Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
- Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
- Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
- Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
- Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).
