Summary
ICP0 subit une translocation nucléaire-à-cytoplasmique au cours de l’infection par HSV-1. On ne connaît pas le mécanisme moléculaire de cet événement. Nous décrivons ici l’utilisation du microscope confocal comme un outil permettant de quantifier le mouvement ICP0 dans l’infection HSV-1, qui jette les bases pour l’analyse quantitative ICP0 translocation dans de futures études mécanistes.
Abstract
Cellule infectée protéine 0 (ICP0) de l’herpès simplex virus type 1 (HSV-1) est une protéine début immédiate contenant une anneau de type E3 ubiquitine ligase. Il est responsable de la dégradation de proteasome des facteurs restrictifs de l’hôte et l’activation des gènes viraux ultérieures. ICP0 contient une séquence de localisation nucléaire canonique (NLS). Il pénètre dans le noyau immédiatement après la synthèse de novo et exécute ses fonctions de défense de l’hôte contre principalement dans le noyau. Cependant, plus tard dans l’infection, ICP0 se trouve exclusivement dans le cytoplasme, ce qui suggère la présence d’une translocation nucléaire-à-cytoplasmique au cours de l’infection par HSV-1. Sans doute ICP0 translocation permet ICP0 de moduler ses fonctions selon ses emplacements sous-cellulaires lors des phases d’infection différents. Afin de délimiter la fonction biologique et le mécanisme de régulation de la translocation nucléaire-à-cytoplasmique ICP0, nous avons modifié une méthode de microscopie par immunofluorescence pour surveiller ICP0 traite au cours de l’infection par HSV-1. Ce protocole consiste immunofluorescence, microscope confocal imagerie nucléaire vs distribution cytoplasmique analyse et. Le but du présent protocole est d’adapter les images confocales état stationnaire, pris dans une évolution temporelle dans une documentation quantitative du mouvement ICP0 tout au long de l’infection lytique. Nous proposons que cette méthode peut être généralisée pour analyser quantitativement nucléaire vs localisation cytoplasmique d’autres protéines virales ou cellulaires sans faire appel à une technologie d’imagerie live.
Introduction
L’herpès simplex virus type 1 (HSV-1) provoque un large éventail de légère à sévères maladies herpétiques, y compris l’herpès labial, l’herpès génital, kératite stromale et l’encéphalite. Une fois infecté, le virus crée une vie latente dans les neurones des ganglions. Parfois, le virus peut être réactivé par différentes raisons telles que la fièvre, le stress et immunodépression1, conduisant à l’infection par l’herpès récurrent. Protéine de la cellule infectée 0 (ICP0) est un important régulateur viral crucial pour les lytique et latente infection HSV-1. Il transactive virus en aval gènes via contrecarrer l’hôte des défenses antivirales intrinsèque/innée2,3. ICP0 a une activité de ligase E3 ubiquitine, qui s’adresse à plusieurs facteurs cellulaires pour la dégradation du protéasome dépendante3. Il interagit aussi avec les diverses voies de cellule de réglementer leurs activités et par la suite pour compenser l’hôte antiviral restrictions3. ICP0 est connu pour localiser à différents compartiments subcellulaires à mesure que l’infection progresse3,4,5. La protéine a un signal de localisation nucléaire riche en lysine/arginine (NLS) situé à résidus 500 à 5066. Lors de la synthèse de novo au début infection HSV-1, ICP0 est immédiatement importées dans le noyau. Il est tout d’abord détecté à une dynamique nucléaire structure appelé domaine nucléaire 10 (ND10)7. L’activité de ligase E3 ubiquitine de ICP0 déclenche la dégradation des protéines organisateur ND10, protéine (PML) la leucémie promyélocytaire et protéine moucheté 100 kDa (Sp100)8,9,10. Après la perte de protéines de l’organisateur, ND10 corps nucléaires sont dispersées et ICP0 est diffusée pour remplir le noyau entier4,11.
Fait intéressant, après le début de la réplication de l’ADN viral, ICP0 disparaît du noyau. On le trouve uniquement dans le cytoplasme, ce qui suggère la présence d’une translocation nucléaire-à-cytoplasmique fin de HSV-1 infection4,12. L’exigence de la réplication de l’ADN implique l’implication potentielle d’un fin ou des protéines virales dans la facilitation de la translocation cytoplasmique de HSV-1 ICP04,12. Apparemment ICP0 traite entre les différents compartiments au cours de l’infection confère le pouvoir ICP0 de moduler ses interactions à diverses voies cellulaires de façon spatio-temporelle et donc coordonner ses multiples fonctions à fine tune l’équilibre entre lytique et latente HSV-1 infection13. Pour mieux comprendre ICP0 multifonctionnalité et la coordination des domaines fonctionnels ICP0 tout au long de l’infection lytique, nous avons soigneusement disséqué la base moléculaire de la dynamique de la translocation de ICP012. Pour mener les études mécanistiques rapportées antérieurement12, nous avons appliqué une méthode de coloration par immunofluorescence pour visualiser la localisation sous-cellulaire ICP0 au statut de différentes infections sous microscope confocal. Nous avons également développé un protocole quantitatif pour analyser la nucléaire vs cytoplasmique distribution de ICP0 en utilisant le logiciel confocal. La population de cellules infectés par HSV-1 a été tabulée pendant les phases de l’infection et les tendances du mouvement ICP0 ont été analysés, sous différents traitements biochimiques12. Nous décrivons ici le protocole détaillé que la translocation de documents ICP0 dans l’infection par HSV-1. Nous proposons que cette méthode puisse être adoptée comme une méthode générale pour étudier la translocation nucléaire vs cytoplasmique d’autres protéines virales ou cellulaires, qui peut servir d’alternative aux direct imaging lorsque la technique d’imagerie live est inapplicable en raison de problèmes tels que l’étiquetage méthode, intensité du signal ou l’abondance de la protéine.
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Protocol
1. cellule ensemencement et infection par le Virus
- 20 – 24 h avant l’infection par le virus, des graines de 5 x 104 cellules fibroblastes pulmonaires embryonnaires humaines (HEL) ou d’autres cellules pour être examiné sur une lame de 4 puits 11 mm décalées dans le milieu de croissance (de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) additionné de 10 % fœtale bovine sérum (FBS)). Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de dioxyde de carbone (CO2).
NOTE : Chaque bien doit avoir confluence de cellules de 70 à 80 % au moment de l’infection. - Le lendemain, retirer le milieu de croissance et infectent les cellules avec les virus en milieu-199 à une distance de 4 à 10 pfu/cellule. Incuber les cellules infectées par le virus pendant 1 h à 37 ° C. Garder secouant la diapositive au cours de la période d’incubation.
- Après l’incubation de 1 h, enlever le milieu-199 et compléter avec un milieu de croissance.
Remarque : Les médicaments qui interfèrent avec les phases de l’infection à différents peuvent être ajoutés à cette étape ou avant l’absorption virale. - Incuber les cellules infectées par le virus à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pour diverses durées de période d’infection.
2. fixation et Permeabilization
- Au moment de l’infection adéquate, vite laver les cellules infectées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 3 fois et ajouter 200 μl de paraformaldéhyde 4 % fraîchement préparé dans du PBS. Incuber les cellules avec du paraformaldéhyde pendant 8 à 10 min à température ambiante pour fixer les cellules dans chaque puits.
- Aspirer la paraformaldéhyde et laver les puits avec 200 μl de PBS pour 3 fois. Aspirer complètement PBS après le lavage 3rd .
- Ajouter 100 μL de surfactant non ionique de 0,2 % dans chaque puits pour permeabilize les cellules pendant 5 – 10 min.
- Aspirer le surfactant non ionique et laver les puits avec 200 μl de PBS pour 3 fois.
3. immunofluorescence
- Totalement aspirer PBS et ajouter 200 μl de tampon de blocage (1 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 5 % de sérum de cheval dans du PBS) dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 1 h ou à 4 ° C durant la nuit.
- Ajouter la concentration déterminée expérimentalement d’anticorps primaire (12d’anticorps polyclonal de lapin anti-ICP0) dans un tampon bloquant et incuber l’anticorps primaire à température ambiante pendant 2 h ou à 4 ° C jusqu’au lendemain.
- Lavez avec un tampon de blocage 3 fois avec 10 min d’incubation. Ajoutez l’anticorps secondaire anti-lapin conjugué Alexa 594 chèvre (1 : 400 dilué dans un tampon de blocage) et incuber les lames à température ambiante pendant 1 h. Puis laver les lames 3 fois avec un tampon de blocage à 10 min d’intervalle.
- Enfin laver la lame une fois avec du PBS pour enlever les BSA résiduel et sérum de cheval.
- Ajouter une goutte de milieu de montage antifade avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour monter la diapositive et scellez-la avec lamelle couvre-objet à l’aide de vernis à ongles transparent.
4. confocal imagerie
- Avec un microscope confocal, définissez la longueur d’onde à 590 – 650 nm pour Alexa 594 et 410 – 520 nm pour DAPI. Sélectionnez le format d’image en 1024 x 1024 et de la ligne moyenne de 8 à acquérir des images à haute résolution.
- Analyser chaque puits sur la lame de 4 puits sous microscope confocal. Acquisition d’images représentant cellule sous l’objectif X 100, comme illustré dans la Figure 1 et Figure 2.
- Pour compter un grand nombre de cellules, prendre des photos des champs consécutifs au titre de l’objectif X 40.
Remarque : Il faut 5 à 10 images d’accumuler plus de 200 cellules infectées de chaque instant de chaque infection. - Pour chaque expérience, prendre des photos avec des paramètres constants confocal pour tous les échantillons doivent être comparés.
5. analyse nucléaire vs cytoplasmique Distribution
- Ouvrir un projet avec le logiciel d’application confocale. Sélectionnez une image dont les cellules ont besoin être compilées pour nucléaire vs cytoplasmique distribution de ICP0.
- Cliquez sur l’onglet « Quantité » du menu principal et sélectionnez « trier les ROIs » dans le menu outils.
- Tracer une ligne longitudinale dans l’ensemble de la cellule à analyser en sélectionnant « Draw line » du menu principal.
Remarque : Histogramme s’affiche indiquant l’intensité de fluorescence le long de la ligne pour les ICP0 et DAPI. Dans l’histogramme, la ligne bleue représente les pixels DAPI et marque la limite du noyau, alors que la ligne rouge représente ICP0 pixels. -
Basé sur la coloration de fond, mis en place un seuil constant pour l’intensité de ICP0 analyser la distribution subcellulaire ICP0 dans chaque expérience.
- Tel qu’illustré dans Figure 2, si le rouge signal en moyenne est inférieure au seuil de la région nucléaire mais est supérieur au seuil au-delà de la frontière bleue, classer le signal rouge comme principalement situé dans le cytoplasme.
- Si le signal rouge est supérieur au seuil dans tout le noyau et au-delà de la limite du signal bleu, groupe le signal rouge comme noyau plus localisation cytoplasmique.
- Si le signal rouge est au-dessus du seuil dans le noyau mais en moyenne est inférieure à elle en dehors de la limite du signal bleu, groupe le signal rouge comme localisation nucléaire.
- Totaliser plus de 200 cellules infectées chaque échantillon au moment de l’infection par différentes et parcelle en graphique à barres pour illustrer le mouvement de ICP0 fonction de l’heure (Figure 3).
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Representative Results
Pour comprendre les bases moléculaires et les fonctions biologiques de la ICP0 traite au cours de l’infection par HSV-1, nous utilisons une méthode de microscopie par immunofluorescence pour analyser ICP0 distribution subcellulaire lors des phases d’infection différents. La figure 1 montre les cellules représentant avec distinctif ICP0 localisation en cours de l’infection. Afin de quantifier la translocation nucléaire-à-cytoplasmique de ICP0, nous analysons la distribution ICP0 par rapport au noyau en classant les cellules infectées en trois groupes : localisation nucléaire et cytoplasmique localisation localisation nucléaire et cytoplasmique ( La figure 2). Pour comprendre les éléments nécessaires pour ICP0 traite au cours de l’infection, nous suivons ICP0 mouvements dans le type sauvage ou mutant HSV-1 lors des phases d’infection différents. La figure 3 montre un exemple des résultats des tableaux de distribution subcellulaire des ICP0 à différents moment de l’infection.
Figure 1 : un trafic dynamique de ICP0 au cours de l’infection par HSV-1. Les cellules HEL cultivées sur des lames de 4 puits étaient infectés par prototype HSV-1 (souche F) à 10 pfu/cellule. À 1, 5 et 9 h après infection (hpi), cellules étaient fixes, perméabilisées et a réagi à la souris et anti-ICP0 anti-PML primaire des anticorps de lapin et ensuite réagis à anti-lapin conjugué Alexa 594 et Alexa 488-cojugated anti-souris secondaires anticorps pour moins de 100 objectifs de X de l’imagerie. Protéine (PML) la leucémie promyélocytaire sert une protéine marqueur pour ND10 corps nucléaires, qui disparaît à 5 et 9 hpi due à la dégradation de la PML en infection. Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : analyse de la distribution subcellulaire ICP0. Panneau de gauche : avec un microscope confocal, cellules représentatives ont été agrandies pour afficher la ligne longitudinale tirée à travers la cellule qui définit la région d’intérêt (ROI). Panneau de droite : intensités de Fluorescence pixel au ROI ont été quantifiées pour ICP0 et DAPI dans des cellules individuelles et illustrées en histogrammes par le logiciel d’application confocale. Un seuil arbitraire (ligne verte) a été fixé pour tenir compte de la coloration de fond. Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : pourcentage de distribution subcellulaire de type sauvage et C-terminal tronqués ICP0. Cellules HEL ont été infectés par des virus recombinants contenant ICP0 de type sauvage (WT ICP0) ou C-terminal tronqué ICP0 (ICP0 C-troncature) à 4 pfu/cellule. Aux moments indiqués, les cellules étaient tachés et analysés comme décrit ci-dessus. Plus de 200 cellules ont été compilés pour ICP0 emplacement. Pourcentage des cellules contenant du nucléaire et cytoplasmique ou nucléaire + cytoplasmique ICP0 ont été tracées avec un logiciel de calcul du tableur. Il s’agit d’une expérience exemplaire pour montrer qu’en utilisant cette méthode, nous avons identifié ICP0 C-terminale comme un domaine requis pour ICP0 translocation nucléaire-à-cytoplasmique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole a été utilisé pour étudier la translocation nucléaire-à-cytoplasmique de HSV-1 ICP0. ICP0 subit le trafic sous-cellulaire au cours de l’infection par HSV-1 (Figure 1). Sans doute, ICP0 interagit avec différentes voies cellulaires à des fonctions différentes à différents endroits. Cette mesure ICP0 affiner ses multiples fonctions dans le bras de fer avec l’hôte humain13. Cependant, comment ICP0 coordonne les multiples fonctions d’une manière spatio-temporelle n'a pas été bien étudiée. Avec le protocole de microscopie fluorescente décrit ci-dessus, nous avons commencé à analyser la base moléculaire de la translocation nucléaire-à-cytoplasmique ICP0. A partir de maintenant, nous avons identifié le ICP0 C-terminal 35 acides aminés comme un élément nécessaire et important pour cette translocation. En l’absence de l’extrémité C-terminale, ICP0 est retenu dans le noyau tout au long de l’infection (Figure 3). Nous avons aussi constaté qu’une translocation ICP0 E3 ligase dépendant rétention nucléaire force retards le nucléaire-à-cytoplasmique dans U2OS cellules12. En outre, nous avons découvert que ICP0 C-terminale et l’expression des protéines virales fin coopèrent pour surmonter la rétention nucléaire et faciliter la translocation cytoplasmique12. Actuellement, nous utilisons ce protocole à l’écran pour les protéines virales fin impliqués dans la translocation nucléaire-à-cytoplasmique ICP0.
Le protocole a été développé initialement pour étudier la dynamique traite de ICP0 infection par HSV-1. Comme illustré à la Figure 1, au début de l’infection par HSV-1, ICP0 est colocalisé avec ND10, où plusieurs composants clés des facteurs restrictifs cellulaires et ND10 composants tels que PML et Sp1008, sont dégradés. Après dégradant les principaux constituants ND10, ICP0 se diffuse dans tout le noyau et la fin de l’infection, ICP0 est transloquée vers le cytoplasme. Parce que ICP0 subit une synthèse de novo à l’infection, l’abondance des protéines initial est très faible et ensuite une synthèse virale robuste masquera rapidement le mouvement de toutes les molécules individuelles, ce qui rend difficile de suivre une seule molécule en utilisant vivre la technologie d’imagerie. Par conséquent, nous avons délibérément choisi ne pas d’utiliser l’imagerie live. Au lieu de cela, nous avons adopté le protocole ci-dessus pour étudier la localisation de l’état stationnaire ICP0 aux points d’infection différentes, qui nous a servi bien dans le suivi de mouvement temporel ICP0 chez une population de cellules infectées par HSV1.
Pour un rapport signal-à-fond élevé en analyse confocale, deux étapes cruciales sont remarquables dans la partie humide-banc du présent protocole. Tout d’abord, les diapositives décalés de 4 puits permettent plusieurs échantillons à manipuler sur une seule diapositive. Il permet d’économiser grandement l’utilisation de réactifs précieux comme les virus et les anticorps. Cependant, parce que le volume qui s’est tenu dans chaque puits est si petit, tampon résiduel pas complètement dégagée lors des changements de la mémoire tampon peut interférer avec le réactif ultérieur. Par conséquent, dans chaque commutateur de tampon, une aspiration approfondie est nécessaire avant d’ajouter la nouvelle mémoire tampon. En second lieu, selon nos expériences, la mesure de la perméabilité de réticulation et de la membrane cellulaire est importante pour la clarté des signaux fluorescents. Nous avons fixé un nombre empirique de 10 min pour paraformaldéhyde et traitements d’agent tensio-actif non ionique. Nous avons trouvé cette fois beaucoup plus longues ou plus courtes que 10 min peut diminuer le ratio signal-à-fond. Comme illustré dans la Figure 1 et Figure 2, ainsi que dans une précédente étude12, les images obtenues dans nos expériences sont limpides. Le signal bleu éminent qui expose clairement la limite nucléaire est essentielle pour déterminer la distribution subcellulaire des ICP0. Dans la partie informatique du présent protocole, une étape cruciale est de définir un seuil constant pour éliminer le fond. Une coloration réussie avec signal-à-fond élevé est la clé d’une ligne inférieure du seuil et le meilleur signal contraste. Gardant un seuil constant pour tous les échantillons dans la même expérience, cependant, est la base de documentation quantitative de ICP0 (Figure 2 et Figure 3).
Le protocole peut également servir d’un outil général pour étudier le trafic sous-cellulaire d’autres protéines virales ou cellulaires lorsqu’une méthode d’imagerie live appropriée est manquant. Technique d’imagerie vivant, les cellules sont maintenus à environnement physiologique optimal pour maintenir la cellule état métabolique14,15. Une exigence de base pour l’imagerie de cellules vivantes est fluorescent étiqueter la protéine cible qui peut être obtenue en fusionnant la protéine cible avec une balise fluorescent16, ou pour offrir un fluorophore conjugué molécule spécifique de la protéine cible17 . Dans les deux cas, les problèmes peuvent augmenter si la fusion de balise fluorescent change propriété protéine cible ou fluorophore molécule conjuguée a de la difficulté à traverser la membrane cellulaire. Photoblanchiment qui provoque des dommages aux cellules dans le processus est un autre sujet de préoccupation en direct d’imagerie18. Par conséquent, de nouvelles stratégies pour surmonter la limitation de l’imagerie vivant continuent d’être la pointe du progrès technologique. Le protocole que nous décrit ici fournit une analyse temporelle de l’état d’équilibre images confocales, qui peut servir comme un outil alternatif quand une bonne méthode d’imagerie live n’est pas disponible. La méthode est simple et fiable. Il fournit la détection claire de localisation subcellulaire des protéines avec fond minimal. Utilisez le logiciel confocale, nous sommes capables de quantitativement analyser le pourcentage de cellules avec des distributions différentes de la protéine cible dans une population de cellules et de documenter les mouvements de protéine cible lors des phases de cellule différente.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions financièrement par une subvention du NIH (RO1AI118992) attribuée à Gu Haidong. Nous remercions l’installation de microscopie, d’imagerie et cytométrie en ressources (MICR) Core à la Wayne State University pour le support technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells and viruses | |||
| Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) | HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS | |
| HSV-1 viral Stock (Strain F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
| Medium | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
| Medium-199 (10x) | Gibco | 11825-015 | |
| Reagents | |||
| 4- well 11 mm staggered slide | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
| 16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Fisher reagents | BP151-1C0 | |
| Bovine Serum Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| NaCl | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagent | BP362-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
| Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| Rabiit Anti-ICP0 antibody | Dr. Haidong Gu lab | ||
| PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG | invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG | invitrogen | A11001 | |
| Vectashield Mouting medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Pasteur pipette | Fisher Brand | 13-678-20D | |
| Nail Polish | Sally Hansen | ||
| Equipment | |||
| Confocal Microscope | Leica SP8 | ||
| Confocal Software | Leica LAS X Application suite | ||
| Excel software | Microsoft Excel | ||
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | Order code 51026282 |
References
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