ICP0 HSV-1 enfeksiyonu sırasında nükleer-için-sitoplazmik translocation uğrar. Bu olay moleküler mekanizması bilinmemektedir. Burada biz confocal mikroskop ICP0 translocation gelecek mekanik çalışmalarda kantitatif analiz etmek için zemin bırakır HSV-1 enfeksiyonu hareketinde ICP0 ölçmek için bir araç olarak nasıl kullanılacağını açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Herpes Simplex Virüsü 1 protein immünfloresan Confocal mikroskobu tarafından nükleer-için-sitoplazmik Translocation zamansal Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Enfekte hücre protein herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) 0 (ICP0), bir halka tipi E3 Ubikuitin ligaz içeren acil bir erken proteindir. Ana bilgisayar kısıtlayıcı faktörler ve sonraki viral gen harekete geçirmek proteasomal bozulması için sorumludur. ICP0 bir kanonik nükleer yerelleştirme sıra (NLS) içerir. Hemen de novo sentezi sonra çekirdek girer ve anti-konak savunma fonksiyonları çekirdeğinde esas olarak yürütür. Ancak, daha sonra enfeksiyon, sitoplazma içinde yalnızca, HSV-1 enfeksiyonu sırasında bir nükleer-için-sitoplazmik translocation geçtiği öne ICP0 bulunur. Muhtemelen ICP0 translocation fonksiyonları hücre altı onun konumları göre farklı enfeksiyon aşamaları modüle ICP0 sağlar. Biyolojik işlev ve ICP0 nükleer-için-sitoplazmik translocation düzenleyici mekanizma betimlemek için ICP0 HSV-1 enfeksiyonu sırasında kaçakçılığı izlemek için bir immünfloresan mikroskopi yöntemi değiştirildi. Bu iletişim kuralı immünfloresan boyama, confocal mikroskop düşsel ve nükleer vs. sitoplazmik dağıtım analiz içerir. Bu iletişim kuralı bir saat ders boyunca litik enfeksiyon ICP0 hareketinin niceliksel bir dokümantasyon içine çekilen kararlı duruma confocal görüntüler adapte hedeftir. Önerdiğimiz bu yöntem canlı görüntüleme teknolojisi içeren olmadan nükleer vs diğer viral veya hücresel proteinler sitoplazmik yerelleştirilmesini kantitatif analiz etmek için genelleştirilmiş.
Giriş
Herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) hafif ağır herpetik hastalığa herpes labialis, genital herpes, stromal keratit ve ensefalit gibi geniş bir dizi neden olur. Enfekte sonra Virüs sinir gangliyon hücreleri bir ömür boyu latent enfeksiyon oluşturur. Zaman zaman, virüs gibi ateş, stres ve bağışıklık suppression1tekrarlayan herpes enfeksiyonu için önde gelen, çeşitli nedenlerle tarafından etkinleştirilebilir. Enfekte hücre proteindir 0 (ICP0) bir anahtar viral regülatörü litik ve gizli HSV-1 enfeksiyonu için çok önemli. Ana bilgisayar içsel/doğuştan gelen antiviral savunma2,3mücadele aşağı ak....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. hücre tohum ve virüs enfeksiyonu
- Virüs enfeksiyonu önce 20-24 h 5 x 104 insan embriyonik akciğer (HEL) fibroblast hücreleri veya diğer hücreler büyüme orta (Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 ile fetal sığır takıma DMEM) 4-şey 11 mm sendeleyerek slayttaki incelenmesine tohum Serum (FBS)). %5 karbondioksit (CO2) ile 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
Not: Her şey enfeksiyon anda % 70-80 cep confluency olmalıdır. - Ertesi gün, büyüme orta kaldırmak ve orta-199 virüsleri 4 – 10 pfu/hücre bir mesafeden hücrelerle bulaştırmak. Virüs bulaşan hücreleri 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya Slayt kuluçka döneminde sallayarak tutun. <....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Moleküler temeli ve ICP0 HSV-1 enfeksiyonu sırasında ticareti Biyolojik işlevleri anlamak için biz bir immünfloresan mikroskopi yöntemi farklı enfeksiyon aşamaları, ICP0 hücre altı dağılım çözümlemek için kullanın. Şekil 1 enfeksiyon ilerledikçe farklı ICP0 yerelleştirme temsilcisi bulunduğu hücreleri gösterir. ICP0 nükleer-için-sitoplazmik translocation ölçmek, ICP0 dağıtım çekirdeği göre üç gruba enfekte hücreleri kategorize tarafından analiz için: nükleer .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu iletişim kuralı HSV-1 ICP0 nükleer-için-sitoplazmik translocation çalışma kullanılmaya başlanmıştır. ICP0 hücre altı HSV-1 enfeksiyonu (Şekil 1) sırasında kaçakçılığı uğrar. Büyük olasılıkla, ICP0 farklı yerlerde farklı işlevleri gerçekleştirmek için çeşitli hücre yolları ile etkileşim kurar. Bu ICP0 birden çok fonksiyonları halat çekme insan konak13ile ince ayar sağlar. Ancak, ne kadar ICP0 birden fazla işlevi uzamsal-zamansal bir şekilde koordine eder iyi araştır.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Biz mali desteği Haidong Gu için layık bir NIH hibe (RO1AI118992) teşekkür ederim. Wayne State Üniversitesi'nde mikroskobu, görüntüleme ve sitometresi kaynakları (MICR) çekirdek tesis teknik destek için teşekkür ediyoruz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hücreler ve virüsler | |||
| İnsan Embriyonik Akciğer fibroblastları (HEL Hücreleri) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton Üniversitesi) | ile desteklenmiş DMEM'de büyütüldüDr | |
| . Bernard Roizman Lab | |||
| Orta | |||
| Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM) | Canlandırıcı | ve nbsp; 11965-092 | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
| Orta-199 (10x) | Gibco | 11825-015 | |
| < güçlü > Reaktifler< / güçlü > | |||
| 4 - kuyu 11 mm kademeli slayt | Cel-Line / Thermofisher Scientific | 30-149H-SİYAH | |
| %16 Paraformaldehit çözeltisi(w/h) Metanol içermeyen | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Fisher reaktifleri | BP151-1C0 | |
| Sığır Serumu Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| At Serumu | Sigma | H1270 | |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| NaCl | Fisher Biyoreaktif | BP358-212 | |
| KH2PO4 | Fisher Biyoreaktif | BP362-500 | |
| KCl | Fisher Bilimsel | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
| Bloke edici tampon (% 1 BSA ve% 5 At serumu ile PBS) | Dr. Haidong Gu laboratuvarı | ||
| Rabiit Anti-ICP0 antikoru | Dr. Haidong Gu laboratuvarı | ||
| PML (PG-M3) -Fare monoklonal IgG | santa Cruz Biyoteknoloji | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-keçi anti-tavşan IgG | invitrojen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-keçi anti-fare IgG | invitrogen | A11001 | |
| Vectashield DAPI Vektör laboratuvarları ile Mouting ortamı | H-1200 | ||
| Pasteur pipet | Fisher Marka | 13-678-20D | |
| Oje | Sally Hansen | ||
| Ekipman< / güçlü> | |||
| Konfokal Mikroskop | Leica SP8 | ||
| Konfokal Yazılım | Leica LAS X Uygulama paketi | ||
| Excel yazılımı | Microsoft Excel | ||
| HERAcell 150i CO2 inkübatör | Thermo Scientific | Sipariş kodu 51026282 |
Kaynaklar
- Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., et al. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Arvin, A., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., et al. Herpes simplex viruses. Fields' Virology. Knipe, D. M. , 6th Edition, Li....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
