Summary
ICP0 erfährt nuklearen-cytoplasmatische Translokation bei HSV-1 Infektion. Der molekulare Mechanismus dieses Ereignisses ist nicht bekannt. Hier beschreiben wir die Verwendung von confocal Mikroskop als Instrument zur ICP0 Bewegung in HSV-1-Infektion, die legt den Grundstein für die Analyse von quantitativ ICP0 Translokation in zukünftigen mechanistische Studien zu quantifizieren.
Abstract
Infizierten Zelle Protein 0 (ICP0) des Herpes-Simplex-Virus 1 (HSV-1) ist ein sofortiger Anfang Protein mit einem RING-Typ E3-Ubiquitin-Ligase. Es ist verantwortlich für den proteasomalen Abbau von Host einschränkende Faktoren und die anschließende virale Genaktivierung. ICP0 enthält eine kanonische nuklearen Lokalisierung Abfolge (NLS). Es tritt den Kern sofort nach de-Novo -Synthese und führt seine Anti-Host Verteidigungsfunktionen vor allem im Zellkern. Jedoch später in Infektion, was darauf hindeutet das Auftreten von einer nuklearen-cytoplasmatische Translokation bei HSV-1 Infektion ICP0 ausschließlich im Zytoplasma, gefunden. Vermutlich kann ICP0 Translokation ICP0 seine Funktionen entsprechend seine subzellulären Standorten in verschiedenen Infektion Phasen zu modulieren. Um die biologische Funktion und Regulationsmechanismus ICP0 Atom-cytoplasmatische Translokation abzugrenzen, haben wir eine immunofluorescent Mikroskopie-Methode zur Überwachung der ICP0 Menschenhandel bei HSV-1 Infektion geändert. Dieses Protokoll beinhaltet immunofluorescent Färbung, confocal Mikroskop Bildgebung und nukleare vs. zytoplasmatischen Verteilungsanalyse. Das Ziel dieses Protokolls ist die Steady-State konfokale Bilder in einen zeitlichen Verlauf in eine quantitative Dokumentation der ICP0 Bewegung in der lytischen Infektion anzupassen. Wir schlagen vor, dass diese Methode verallgemeinert werden kann, um nuklearen vs. zytoplasmatischen Lokalisierung von anderen viralen oder zelluläre Proteine quantitativ zu analysieren, ohne Einbeziehung von live-imaging-Technologie.
Introduction
Herpes-Simplex-Virus 1 (HSV-1) verursacht eine Vielzahl von leichten bis schweren herpetische Erkrankungen einschließlich Herpes Labialis, Herpes genitalis, stromale Keratitis und Enzephalitis. Einmal infiziert, stellt das Virus eine lebenslange latente Infektion in den Ganglien Neuronen. Gelegentlich kann das Virus durch verschiedene Ursachen wie Fieber, Stress und Immunsuppression1, führt zu immer wiederkehrenden Herpes-Infektion reaktiviert werden. Infizierten Zelle Protein 0 (ICP0) ist viral Schlüsselregulator für lytische und latente HSV-1 Infektion von entscheidender Bedeutung. Es transactivates nachgeschalteten Virus Gene über Bekämpfung der Host intrinsische/angeborenen antiviralen Abwehr2,3. ICP0 hat eine E3 Ubiquitin Ligase Tätigkeit, die mehrere Zelle Faktoren für Proteasom-abhängige Abbau3richtet sich an. Es interagiert auch mit verschiedenen Zelle Signalwege, ihre Aktivitäten zu regulieren und anschließend Rechner antiviralen Einschränkungen3auszugleichen. ICP0 tritt bekanntermaßen bei verschiedenen subzelluläre Kompartimente zu finden, da die Infektion3,4,5 verläuft. Das Protein besitzt ein Arginin/Lysin-reiche nuklearen Lokalisierung-Signal (NLS) Rückstände 500, 506-6. Bei der de-Novo -Synthese im frühen HSV-1 Infektion wird ICP0 sofort in den Zellkern importiert. Es ist zuerst erkannt, bei einer dynamischen nukleare Struktur bezeichnet Nuklearbereich 10 (ND10)7. Die E3 Ubiquitin Ligase Tätigkeit der ICP0 löst den Abbau von ND10 Veranstalter Proteine, Promyelocytic Leukämie (PML) Protein und gesprenkelten Protein 100 kDa (Sp100)8,9,10. Nach dem Verlust von Proteinen, Veranstalter ND10 nuklearen Einrichtungen sind weit verstreut und ICP0 wird verbreitet, um die gesamte Kern4,11zu füllen.
Interessant ist, nach dem Einsetzen der viralen DNA-Replikation verschwindet ICP0 aus dem Zellkern. Es findet ausschließlich im Zytoplasma, was darauf hindeutet das Auftreten von einer nuklearen-cytoplasmatische Translokation spät in HSV-1 Infektion4,12. Das Erfordernis der DNA-Replikation bedeutet die mögliche Beteiligung von einem späten virale benutzt bei der Erleichterung der zytoplasmatischen Translokation von HSV-1 ICP04,12. Offenbar ICP0 Handel unter verschiedenen Kompartimenten während der Infektion befähigt ICP0 seine Interaktionen zu verschiedenen zellulären Wege in eine räumlich-zeitliche Mode zu modulieren, und daher koordinieren ihre vielfältigen Funktionen zu feinen Melodie die Balance zwischen die lytische und latente HSV-1 Infektion13. Zum besseren Verständnis der ICP0 Multifunktionalität und die Koordination der ICP0 Funktionsbereiche in der lytischen Infektion seziert wir sorgfältig die molekulare Grundlagen der dynamischen ICP0 Translokation12. Um die mechanistische Studien bereits berichtet12durchführen zu können, haben wir eine immunofluorescent Färbung Methode um ICP0 subzelluläre Lokalisation bei verschiedenen Infektionsstatus unter confocal Mikroskop visualisieren angewendet. Wir haben auch eine quantitative Protokoll zu analysieren, die nukleare vs. zytoplasmatischen Verteilung der ICP0 mit Hilfe der konfokalen Software entwickelt. Die Bevölkerung von HSV-1 infiziert Zellen war während der gesamten Infektion tabellarisch dargestellt und die Trends der ICP0 Bewegung wurden unter verschiedenen biochemischen Behandlungen12analysiert. Hier beschreiben wir dem ausführliche Protokoll, dass Dokumente ICP0 Translokation in HSV-1-Infektion. Wir schlagen vor, daß diese Methode kann, als eine allgemeine Methode angenommen werden, um die nukleare vs. zytoplasmatischen Translokation für andere virale oder zelluläre Proteine, studieren die dienen können, als Alternative zur live Bildgebung, wenn die live bildgebende Verfahren ist nicht anwendbar auf Probleme wie Kennzeichnung Methode, Signalintensität oder Protein Fülle.
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Protocol
(1) Zelle Aussaat und Virus-Infektion
- Samen Sie bei 20-24 h vor der Virusinfektion 5 x 104 von menschlichen embryonalen Lunge (HEL) Fibroblastenzellen oder andere Zellen auf einer 11 mm 4-gut gestaffelten Folie in Wachstumsmedium (Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % fetalen Rindern geprüft werden Serum (FBS)). Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit 5 % Kohlendioxid (CO2).
Hinweis: Jede sollte gut 70-80 % Zelle Konfluenz zum Zeitpunkt der Infektion haben. - Am nächsten Tag das Wachstumsmedium zu entfernen und die Zellen mit Viren in Medium-199 bei einer Reichweite von 4 – 10 Pfu/Zelle zu infizieren. Inkubieren Sie Virus-infizierten Zellen für 1 h bei 37 ° c Schütteln Sie halten Sie die Folie während der Inkubationszeit.
- Nach 1 h Inkubation Medium-199 zu entfernen und zu ergänzen mit Wachstumsmedium.
Hinweis: Medikamente, die mit verschiedenen Infektion Phasen stören können bei diesem Schritt bzw. vor viralen Aufnahme hinzugefügt werden. - Die Virus-infizierten Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2 für verschiedene Längen der Infektion Periode auszubrüten.
2. Fixierung und Permeabilisierung
- Zeitpunkt der richtigen Infektion schnell waschen Sie die infizierten Zellen mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 3 Mal und 200 μL der 4 % Paraformaldehyd frisch zubereitet mit PBS-Puffer. Inkubation der Zellen mit Paraformaldehyd für 8 – 10 min bei Raumtemperatur, die Zellen in jedem Bohrloch zu beheben.
- Aspirieren Sie Paraformaldehyd und waschen Sie die Brunnen mit 200 μl PBS für 3 Mal. Aspirieren Sie völlig PBS nach der 3rd -Wäsche.
- Fügen Sie 100 μL von 0,2 % nicht-ionische Tenside in jede Vertiefung, die Zellen für 5 – 10 min permeabilize.
- Nichtionischen Tensids abzusaugen und die Brunnen mit 200 μl PBS für 3 Mal waschen.
3. immunofluorescent Färbung
- Ganz Aspirieren PBS und fügen Sie 200 μL der blockierenden Puffer (1 % Rinderserumalbumin (BSA) und 5 % Pferd Serum mit PBS-Puffer) in jede Vertiefung und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur 1 h oder bei 4 ° C.
- Fügen Sie experimentell ermittelten Konzentration der Primärantikörper (Kaninchen Anti-ICP0 polyklonalen Antikörper12) in blocking-Puffer und inkubieren Sie Primärantikörper bei Raumtemperatur für 2 h oder bei 4 ° C über Nacht.
- Waschen Sie mit blockierenden Puffer 3 Mal mit 10 min Inkubation. Fügen Sie Alexa 594 konjugiert Ziege Anti-Kaninchen Sekundärantikörper (1: 400 in blocking-Puffer verdünnt) und inkubieren Sie die Folien bei Raumtemperatur für 1 h. Dann waschen Sie die Folien 3 Mal mit blocking-Puffer in 10 min Intervall.
- Schließlich waschen Sie die Folie einmal mit PBS, passives BSA und Pferd Serum zu entfernen.
- Geben Sie einen Tropfen des antifade Eindeckmittel mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Montage der Folie und mit Deckglas mit transparenten Nagellack versiegeln.
4. confocal Imaging
- Legen Sie mit einem konfokalen Mikroskop die Wellenlänge bei 590 – 650 nm für Alexa 594 und 410 – 520 nm für DAPI. Wählen Sie Bildformat bei 1024 x 1024 und Linie Durchschnitt von 8, hochauflösende Bilder zu erwerben.
- Analysieren Sie jede Vertiefung auf der 4-Well-Folie unter confocal Mikroskop. Repräsentative Zelle Bilder unter dem 100 X Objektiv zu erwerben, wie in Abbildung 1 und Abbildung 2gezeigt.
- Nehmen Sie für die große Anzahl von Zellen zu zählen Bilder von aufeinander folgenden Felder unter den 40 X Objektiv.
Hinweis: Es erfordert 5 – 10 Bilder, über 200 infizierte Zellen von jeden Zeitpunkt jede Infektion zu sammeln. - Fotografieren Sie in jedem Experiment mit konstanter konfokale Parameter für alle Proben verglichen werden müssen.
5. Analyse der nuklearen vs. zytoplasmatischen Verteilung
- Offenes Projekt mit der konfokalen Anwendungssoftware. Wählen Sie ein Bild aus der Zellen für nukleare vs. zytoplasmatischen Verteilung der ICP0 tabellarisch dargestellt werden müssen.
- Klicken Sie auf die Registerkarte "Quantity" vom oberen Menü und wählen Sie "sortieren ROIs" aus dem Menü "Extras".
- Eine Linie längs über die Zelle analysiert werden, durch die Auswahl "Schlussstrich" oben im Menü.
Hinweis: Histogramm wird angezeigt der Fluoreszenzintensität entlang der Linie für ICP0 und DAPI. Im Histogramm blaue Linie stellt DAPI Pixel dar und markiert die Grenze des Kerns, während die rote Linie ICP0 Pixel darstellt. -
Basierend auf Hintergrundfärbung, richten Sie einen konstanten Schwellenwert für ICP0 Intensität ICP0 subzelluläre Verteilung in jedem Experiment zu analysieren.
- Beispielhaft in Abbildung 2, wenn im Durchschnitt das rote signal unterhalb der Schwelle im nuklearen Bereich jedoch oberhalb der Schwelle über die blaue Grenze, das rote Signal als überwiegend befindet sich im Zytoplasma zu kategorisieren.
- Wenn das rote Signal oberhalb der Schwelle in den Zellkern und jenseits der Grenze des blauen Signals ist, gruppieren Sie das rote Signal als Kern plus zytoplasmatischen Lokalisierung.
- Wenn das rote Signal oberhalb der Schwelle im Zellkern ist aber im Durchschnitt unterhalb es außerhalb der Begrenzungen des blauen Signal ist, gruppieren Sie das rote Signal als nukleare Lokalisation.
- Tabellieren Sie mehr als 200 infizierte Zellen von jeder Probe zu verschiedenen Infektion Zeit und Handlung im Balkendiagramm ICP0 Bewegung nach Zeit (Abbildung 3) illustrieren.
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Representative Results
Verständnis der molekularen Grundlagen und biologische Funktionen des Menschenhandels ICP0 bei HSV-1 Infektion, verwenden wir eine Methode immunofluorescent Mikroskopie ICP0 subzelluläre Verteilung auf verschiedene Infektion Phasen zu analysieren. Abbildung 1 zeigt die repräsentative Zellen mit markanten ICP0 Lokalisierung als die Infektion fortschreitet. Zur Quantifizierung der nuklearen-cytoplasmatische Translokation ICP0 analysieren wir ICP0 Verteilung bezogen auf den Kern durch die Kategorisierung von infizierter Zellen in drei Gruppen: nukleare Lokalisierung, zytoplasmatischen Lokalisierung und nukleare plus zytoplasmatischen Lokalisierung ( ( Abbildung 2). Um Elemente für ICP0 Handel während der Infektion zu verstehen, verfolgen wir bei verschiedenen Infektionen Phasen ICP0 Bewegungen in Wildtyp oder Mutant HSV-1. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für tabellarische Ergebnisse für subzelluläre Verteilung der ICP0 unterschiedlichen Zeitpunkt der Infektion.
Abbildung 1: dynamische Menschenhandel ICP0 bei HSV-1 Infektion. HEL-Zellen, die auf 4-Well Folien gezüchtet wurden mit Prototyp HSV-1 (F-Stamm) auf 10 Pfu/Zelle infiziert. Bei 1, 5 und 9 h Post Infektion (Hpi) wurden Zellen behoben, permeabilized, und reagierte auf Kaninchen Anti-ICP0 und Maus Anti-PML Primärantikörper und dann reagierte auf Alexa 594-konjugierten Anti-Kaninchen und Alexa 488-Cojugated Anti-Maus Sekundärantikörper für Bildgebung unter 100 X Ziele. Promyelocytic Leukämie (PML) Protein dient als Marker Protein für ND10 nuklearen Einrichtungen, die 5 und 9 HPI wegen Verschlechterung der PML in Infektion verschwindet. Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Analyse der subzellulären Verteilung ICP0. Links: mit einem konfokalen Mikroskop repräsentative Zellen wurden vergrößert, um zu zeigen, die längs-Linie gezogen über die Zelle, die die Region of Interest (ROI) definiert. Rechten Seite: Fluoreszenz Pixelintensität in ROI waren für ICP0 und DAPI in einzelnen Zellen quantifiziert und als Histogramme von der konfokalen Anwendungssoftware dargestellt. Eine willkürliche Schwelle (grüne Linie) wurde eingerichtet, um die Hintergrundfärbung widerspiegeln. Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Anteil der subzellulären Verteilung für Wildtyp und C-terminalen abgeschnitten ICP0. HEL-Zellen durch rekombinante Viren mit Wildtyp ICP0 infiziert wurden (ICP0 WT) oder C-terminalen ICP0 abgeschnitten (ICP0 C-Trunkierung) bei 4 Pfu/Zelle. Zu angegebenen Zeitpunkten waren Zellen fleckig und analysiert, wie oben beschrieben. Mehr als 200 Zellen waren für ICP0 Standort tabellarisch dargestellt. Anteil der Zellen mit nuklearen und zytoplasmatischen oder nuklearen + zytoplasmatischen ICP0 wurden mit einem Tabellenkalkulationsprogramm Berechnung dargestellt. Dies ist eine beispielhafte Experiment zeigen, dass mit dieser Methode wir ICP0 C-Terminus als eine Domäne erforderlich für nukleare zu zytoplasmatischen Translokation ICP0 identifiziert haben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Protokoll wurde verwendet, um die nukleare zu zytoplasmatischen Translokation von HSV-1 ICP0 zu studieren. ICP0 erfährt subzelluläre Menschenhandel bei HSV-1 Infektion (Abbildung 1). Wahrscheinlich, ICP0 interagiert mit verschiedenen Zelle Signalwege, verschiedene Funktionen an unterschiedlichen Standorten durchzuführen. Dies ermöglicht ICP0 zur Feinabstimmung ihre vielfältigen Funktionen in das Tauziehen mit menschlichen Gastgeber13. Aber ist wie ICP0 die vielfältigen Funktionen in gewissem Sinne räumlich-zeitliche Koordinaten nicht gut untersucht worden. Mit dem oben beschriebenen Fluoreszenz-Mikroskopie-Protokoll haben wir begonnen, die molekulare Grundlagen der nuklearen-cytoplasmatische Translokation ICP0 analysieren. Ab sofort haben wir die C-terminale ICP0 identifiziert 35 Aminosäuren als ein erforderliches Element wichtig, dass diese Translokation. In Ermangelung des C-Terminus ist ICP0 innerhalb des Zellkerns in der gesamten Infektion (Abbildung 3) gehemmt. Wir fanden, dass auch ein ICP0 E3 Ligase-abhängige atomare Bindung Kraft Verzögerungen der nuklearen-zu-cytoplasmatische Translokation in U2OS Zellen12. Darüber hinaus haben wir entdeckt, dass ICP0 C-Terminus und den Ausdruck der späten virale Proteine arbeiten zusammen, um zu überwinden das nukleare zurückhalten und zytoplasmatischen Translokation12erleichtern. Derzeit nutzen wir dieses Protokoll zum Bildschirm für die späten virale Proteine beteiligt die ICP0 Atom-cytoplasmatische Translokation.
Das Protokoll wurde ursprünglich entwickelt, um den dynamischen Handel mit ICP0 in HSV-1 Infektion zu untersuchen. Wie in Abbildung 1, früh bei HSV-1-Infektion ist ICP0 colocalized mit ND10, wo mehrere Schlüsselkomponenten des zellulären einschränkende Faktoren und ND10 Komponenten wie PML und Sp1008, abgebaut. Nach erniedrigende ND10 wichtige Bestandteile, ICP0 diffundiert in den Zellkern und spät Infektion, ICP0, Zytoplasma umgesiedelt ist. Weil ICP0 de-Novo -Synthese nach Infektion erfährt, die erste Protein-Zugehörigkeit sehr gering ist und eine robuste virale Synthese dann schnell wird verdecken Sie die Bewegung jeder einzelner Moleküle, die macht es schwierig, ein einzelnes Molekül mit Länge Live-imaging-Technologie. Daher haben wir bewusst nicht live Imaging verwenden. Stattdessen nahmen wir das obige Protokoll um die Steady-State ICP0 Lokalisierung an verschiedenen Infektionen, diente uns auch bei der Verfolgung von ICP0 zeitliche Bewegung in einer Population von HSV-1 infiziert Zellen zu studieren.
Für ein hohes Signal-Hintergrund-Verhältnis in der konfokalen Analyse sind zwei wichtige Schritte in der Nassbank Teil dieses Protokolls bemerkenswert. Zuerst erlauben die 4-gut gestaffelten Folien mehrere Proben auf einer einzelnen Folie verarbeitet werden. Es spart erheblich die Verwendung von wertvollen Reagenzien wie Viren und Antikörper. Jedoch weil das Volumen in jede Vertiefung statt so klein ist, kann verbleibende Puffer Puffer Veränderungen nicht vollständig geräumt das nachfolgende Reagenz stören. Daher braucht man eine gründliche Absaugung in jeder Puffer wechseln, bevor Sie hinzufügen des neuen Puffers. Zweitens ist wichtig für die Klarheit der Fluoreszenz Signale das Ausmaß der Vernetzung und Membran Durchlässigkeit der Zelle basierend auf unseren Erfahrungen. Wir haben eine empirische Reihe von 10 min für Paraformaldehyd und nichtionische Tenside Behandlungen. Wir fanden damals viel länger oder kürzer als 10 Minuten kann das Signal-Hintergrund-Verhältnis ab. Wie in Abbildung 1 und Abbildung 2, sowie in einer früheren Studie12gezeigt, sind in unseren Experimenten erhaltenen Bilder kristallklar. Das prominente blau Signal, das die nukleare Grenze klar skizziert ist Schlüssel zur Bestimmung der subzellulären Verteilung der ICP0. Im rechnerischen Teil dieses Protokolls soll ein entscheidender Schritt eine konstante Schwelle, den Hintergrund zu eliminieren. Eine erfolgreiche Färbung mit hohen Signal-Hintergrund-Verhältnis ist der Schlüssel zu einer niedrigeren Schwellenwert Linie und besseren Signal-Kontrast. Halten einen konstanten Schwellenwert für alle Proben im gleichen Experiment, allerdings ist die Grundlage für die quantitative Dokumentation der ICP0 (Abbildung 2 und Abbildung 3).
Das Protokoll kann auch dienen, als allgemeines Tool subzelluläre Handel für andere virale oder zelluläre Proteine, wenn eine geeignete live bildgebende Methode fehlt zu studieren. In live bildgebendes Verfahren werden Zellen auf optimale physiologische Umgebung weiterhin Zelle Stoffwechsellage14,15gehalten. Eine Grundvoraussetzung für das live Cell Imaging ist Eindringmittel kennzeichnen das Zielprotein, was erreicht werden kann, durch die Verschmelzung mit einem fluoreszierenden Tag16des Zielproteins oder um ein Fluorophor liefern konjugiert Molekül speziell für das Zielprotein17 . In beiden Fällen können Probleme ansteigen, wenn die Verschmelzung von fluoreszierenden Tag Zieleigenschaft Proteins ändert oder Fluorophor konjugierten Molekül hat Schwierigkeiten, die Zellmembran zu überqueren. Immunofluoreszenz, die Zellschäden dabei verursacht ist eine zusätzliche Sorge in live imaging18. Daher weiterhin neue Strategien, um die Beschränkung der live Bildgebung zu überwinden die Grenze der Technologieentwicklung. Das Protokoll, die, das wir hier beschrieben, sieht zeitliche Analyse der Steady-State konfokale Bilder, die als alternatives Instrument dienen kann, wenn eine ordnungsgemäße live-imaging-Methode nicht verfügbar ist. Die Methode ist einfach und zuverlässig. Freuen Sie sich auf klare Erkennung von Proteinen subzellulärer Lokalisierung mit minimaler Hintergrund. Konfokale Software verwenden, können wir quantitativ den Anteil der Zellen mit verschiedenen Distributionen des Zielproteins in einer Zellpopulation zu analysieren und dokumentieren die Bewegung des Zielproteins in andere Zelle Lebensphasen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken finanziellen Unterstützung aus einem NIH-Zuschuss (RO1AI118992) an Haidong Gu vergeben. Wir danken der Mikroskopie, Imaging & Zytometrie Ressourcen (MICR) Core-Anlage an der Wayne State University für den technischen Support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells and viruses | |||
| Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) | HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS | |
| HSV-1 viral Stock (Strain F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
| Medium | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
| Medium-199 (10x) | Gibco | 11825-015 | |
| Reagents | |||
| 4- well 11 mm staggered slide | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
| 16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Fisher reagents | BP151-1C0 | |
| Bovine Serum Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| NaCl | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagent | BP362-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
| Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| Rabiit Anti-ICP0 antibody | Dr. Haidong Gu lab | ||
| PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG | invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG | invitrogen | A11001 | |
| Vectashield Mouting medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Pasteur pipette | Fisher Brand | 13-678-20D | |
| Nail Polish | Sally Hansen | ||
| Equipment | |||
| Confocal Microscope | Leica SP8 | ||
| Confocal Software | Leica LAS X Application suite | ||
| Excel software | Microsoft Excel | ||
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | Order code 51026282 |
References
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