Summary
我们特此提出一个方案,在床边测量人类全血样本的内毒素活性。内毒素活性测定是一个简单的测试,可能是脓毒症危重病人的一个有用的生物标志物。
Abstract
脂多糖,也称为内毒素,是革兰氏阴性细菌的基本成分,在败血症和败血症休克的发展中起着至关重要的作用。早期发现正在迅速演变为严重疾病的传染性过程可能会促使更快和更密集的治疗,从而可能导致更好的患者结果。内毒素活性(EA)测定可在床边用作系统内毒素血症的可靠生物标志物。内毒素活性水平升高的检测已反复证明与败血症和败血症休克患者疾病严重程度增加有关。测定快速且易于执行。简单地说,取样后,全血的等分与抗内毒素抗体混合,并加入LPS。内毒素活性被测量为通过化学发光检测到的含以结束中性粒细胞的相对氧化爆发。测定的输出以从0(不存在)到1(最大)的刻度表示,并分为"低"(<0.4单位)、"中间"(0.4~0.59个单位)或"高"(±0.6个单位)。本手稿报告了实施 EA 测定的详细方法和理由。
Introduction
脂多糖(LPS),也称为内毒素,是革兰氏阴性(GN)细菌膜结构的关键组成部分。它约占细胞壁的10%,对外膜的完整性和平衡至关重要。此外,它是宿主先天免疫系统1,2的有力激活剂。
体外免疫系统细胞在体外接触LPS会导致多个基因的表达发生变化3。在健康人类志愿者中管理非常少量的LPS会触发急性全身炎症的级联,而败血症和败血症休克则可能以较高的内毒素浓度4、5出现。
败血症是一种危及生命的情况,如果不及时识别,可能导致多器官衰竭和死亡。消毒患者必须及时治疗,积极复苏,适当的抗生素治疗,最佳的源头控制和及时的器官支持策略。脓毒症病因的诊断主要基于临床识别和培养性病原体检测6。然而,微生物培养的结果可能长达48小时,在高达30%的病例7中没有结论。早期识别和干预可能导致更好的患者结果。在怀疑败血症的患者中,通常根据生理和生化参数作出决定,没有明确的内毒血症迹象。
内毒素活性(EA)的测量可以通过全血商业测定(见材料表)获得。它可以作为系统内毒血症的生物标志物,用于疾病严重程度的早期分层,特别是在有发生败血性休克8的风险的患者中。在最近出版的双盲随机对照临床试验中,该测定用于指导Polymyxin B血液灌注治疗。在危重病人中,MEDIC研究表明,EA水平增加与多器官功能障碍、重症监护病房(ICU)停留时间以及死亡率10相关。
已经开发出不同的检测检测内毒素。利穆卢斯阿莫博克莱特溶酶(LAL)测定,无论是作为凝胶凝固,浊度,或染色体检测,到目前为止一直是最经常采用的血清内毒素估计。它基于内毒素诱导马蹄蟹、利穆卢斯多聚苯酚的溶血性凝血的能力。然而,这种测定在特异性方面有一定的局限性。特别是,它也可以被内毒素以外的微生物产品激活,如真菌细胞壁的成分,并且它可以通过各种人类血浆蛋白11抑制。
在过去十年中,EA的测量被开发并验证为循环内毒血症的生物标志物。与 LAL 测试相比,EA 在临床环境中实现更快、更容易。此外,它已被证明比全血的LAL更准确,在体外和体内12的灵敏度和特异性增加。
尽管它最初作为早期诊断工具,用于快速识别 GN 细菌作为败血症致病剂,但 EA 水平也作为疾病严重程度的生物标志物进行了研究。在此背景下,它已被证明是特别有用的评估低灌注状态,由于持续的严重疾病,如败血性休克或心脏后骤停综合征13。最近,自开发净化电检系统以来,还提出了一个积极的EA结果,作为一种筛选工具,以准确识别这种治疗14的潜在候选者。我们最近对107例败血性休克患者早期高浓度EA的患病率和临床意义进行了观察性回顾性研究。根据其他最近的研究结果,我们发现EA是败血性休克15患者疾病严重程度的一个有希望的标志。
本手稿的目的是描述在床边或实验室执行 EA 测定的方法,并描述其在败血性休克的代表性情况下的潜在用途。该技术可以通过测量嗜中性粒细胞中的增强氧化性爆裂来检测LPS活性,这种活性是通过抗内毒素抗体和LPS的复合物启动的。增加的呼吸爆发由化学光度计检测,发出的光量与血液样本中的内毒素量成正比。测定需要很少的试剂,大约需要30分钟才能进行,使用全血12的40μL。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
该规程是按照有关处理人类生物标本的机构准则,并遵循我们临床实验室的现行标准操作程序进行的。使用EA数据和被检测患者的临床信息遵循我们机构人类研究伦理委员会的指导方针。
1. 实验室设备和检测套件内容
- 不使用时,将 EA 套件储存在 2~8 °C。
-
每个 EA 测试由 5 种不同的管组成;将每个部分用于测试的不同部分(参见第 2 节)。
- 使用管#1("控制"管)测量患者中性粒细胞在缺乏特定抗体的情况下非特异性氧化爆裂的基础活性。
- 使用管#2("样本"管)测量对LPS抗体复合物的氧化爆裂。
- 使用管#3("Max"管)测量患者中性粒细胞的最大氧化突发,以响应过量的内毒素。
- 使用管#4("LPS"管)作为外源内毒素的来源。
- 使用管#5("Aliquote"管)进行血液储存。
注:#1、#2和#3的管子副本,总共8个管子用于每个被检测的血液样本(EA试剂瓶和质量控制测试可用于袋中包含的所有测试)。
- 在含有EDTA抗凝剂的无菌管中收集患者血液样本。在运行 EA 测试之前,将血液样本储存在室温下。
- 在开始测试之前,打开化学光度计和孵化器摇床。将培养箱加热到 37°C 的温度。
- 理想情况下,从采血后 30 分钟内开始处理样品。
2. 内毒素活性测定
- 为需要测试的每个患者的血液样本准备 EA 试管。将管子放在管架上。然后取下盖子。
- 使用组合器,将1mL体积的EA试剂从瓶中移入管#1(控制管)、#2(样品管)和#3(最大管),每个试剂都重复。
注:移液管的侧面,以避免溶液溅起。 - 通过轻轻地反转采血管20次,混合患者血液样本。然后,将0.5 mL的患者血液移液器送入管#4(LPS最大管)和管#5(盐管)。涡流管#4为10s。
- 将带有所有 EA 试管的管架放入培养箱摇床。关闭盖子,在 37°C 温度下孵育 10 分钟。
- 打开盖子,从培养箱摇床上取下管架。涡旋管#5(盐管)。使用无菌尖端,将40μL的血液移液器#1和#2,重复将40μL的血液输送到管中。
- 涡流管#4(LPS 管)。使用相同的移液器尖端,移液器 40 μL 的血液从管#4到管#3(最大管),重复。
- 涡旋六个最终试管(#1、#2、#3和相应的重复物),然后将它们放回机架中。
注:确保所有管在相同的时间内涡旋。 - 将管架放回孵育摇床并合上盖子。将孵育摇床设置为 100 rpm,然后启动运动 14 分钟。
- 将 EA 标记的芯片卡插入化学光度计,然后按启动。孵育14分钟后,按照化学发光仪上显示的说明,以正确的顺序读取EA管。
- 轻轻地将每根管子涡旋10s,然后将其放在化学光度计的样品架上。打开样品抽屉,将管#1放在样品架中。然后,关闭样品抽屉并等待相对光单元 (RLU) 读数。
- 对于管 2 和管 3 重复步骤 2.10。
- 对重复管 1、2 和 3 重复步骤 2.10。
注:在步骤 2.10~2.12 期间,尝试在所有管中涡旋相同的时间。 - 处理完所有管后,请注意,EA 结果将自动计算和打印。级别表示为 EA 单位,表示从同一样本进行重复测定的平均值。
- 对于需要测试的每个血液样本,重复步骤 2.2 到 2.13。
- 完成测定后,将剩余的试管和EA试剂储存在2~8°C下长达30天。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
一名72岁男子住进一所学术城市医院的急诊科( ED)。几天前,他向初级保健医生提出抱怨小便燃烧。建议用口服磷霉素进行短期治疗。他的病史包括高血压、2型糖尿病和良性前列腺增生。他的药物包括依那普利、阿托伐他汀、坦苏洛辛和二甲苯。
在ED中,他昏昏欲睡,醒来时感到困惑。他的体温为39.1°C,心率为每分钟125次,血压为80/40 mmHg,呼吸速率为20/min,SpO2在室内空气中为94%,通过鼻管4升/分钟氧,达到99%。腹腔检查是正常的,除了局部性差的轻度超阴度。困难,一个Foley导管被放置。少量的深色化尿被排出。
完整的血计数显示白细胞计数为18.5 x 103。肌酸为2.7mg/dL,葡萄糖为250mg/dL,乳酸水平为4.5 mmol/L.动脉血气分析显示混合酸中毒,pH 7.23,pCO2 48 mmHg,pO2 88 mmHg,HCO 3- 15 mmol/L。
中央静脉导管被放置在与超声波指导,进入右内静脉。在导管放置时进行了血气分析,揭示了63%的ScVO2值。在30分钟内,用30mL/kg的结晶性博柳输注迅速开始积极的液体复苏。诺赖芬肾上腺素输注也开始。患者被转到ICU,诊断为败血性休克,可能是尿路感染。
在ICU中,在微生物培养物收集和经验性抗生素治疗管理中,获得了用于EA测试的全血样本。根据本文提出的方案,迅速进行了测定。
为了计算EA结果,化学发光仪记录:嗜中性粒细胞(L1)的基础发光;中微粒细胞活性的发光对血液样本中的LPS(L2);最大嗜中性粒细胞活性,以响应大量接触LPS(L3)。结果表示为:内毒素活性(EA)=(L2-L1)/(L3-L1)。因此,生成的 EA 值反映了患者的嗜中性粒细胞氧化爆裂的程度,因为存在循环内毒素 (L2),通过最高级别的发光进行归化,该发光值可在同一血液样本中测量,以响应LPS (L3) 的超大浓度。这两个值都受样品 (L1) 基底发光的控制。
大约 30 分钟后,临床医生确认 0.75 EA 单位是患者的内毒素活性水平。
EA 值小于 0.40 EA 单位表示内毒素活性水平较低,等于低循环 LPS 浓度,表示进入严重疾病状态的风险较低。0.40 EA 和 0.59 EA 单位之间的结果显示中间内毒素活动水平,表明严重败血症和败血性休克的发展风险升高。结果等于或大于0.60 EA单位表示内毒素活性水平较高,表示败血性休克和不良患者结局的高风险(表1)。
因此,诊断的败血性休克,可能是由于GN细菌,因此被确认。患者也被归类为处于极高风险,符合伴随器官衰竭和乳酸水平的证据。此外,他还接受了积极的体积复苏和血管活性支持。由于患者对液体和血管压榨器的令人信服的早期反应,考虑了多混合辛-B血净化疗法,但尚未实施。第2天,大肠杆菌通过阳性血液培养被确认为病原体。在适当的抗生素治疗下,患者康复,于第7天从ICU出院。在 ICU 放电之前进行了第二次 EA 测试。0.2 EA 单位的结果表明,败血性休克触发的生化级联完全解决了。
图1显示了在24小时内在化脓性休克患者样本群中测量的EA值分布。
图1:在危重病人群中从败血性休克发病24小时内测得的内毒素活性(EA)水平的分布(n = 107)。改编自博蒂罗利等人与许可15。请点击此处查看此图的较大版本。
| EA 单位 | 内毒素活动水平 |
| <0.40 | 低 |
| 0.40 = 0.59 | 中间 |
| ±0.60 | 高 |
表1:内毒素活动水平的类别。EA = 内毒素活动。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
化血症休克现在仍然与死亡率高达40%有关,尽管这个比率根据考虑的报告16而变化。大多数专家都提倡需要新型和更好的生物标志物,以帮助临床医生早期诊断,更好地管理和预后化脓性休克患者6。
执行 EA 测试不需要以前的技术知识或复杂的实验室设备,任何医疗保健提供商都可以轻松快速地了解如何运行它。及时识别高循环 EA 可能有助于将患者的风险分层,从而触发更早和更积极的治疗方法。相反,EA结果小于0.40 EA单位可能表明进展到多器官衰竭17的低风险。使用患者的样本作为他们自己的控制是简单的,使这个测试更敏感,更准确地表示内毒血症的真实血液水平。
使用LPS抗体复合物和患者自己的嗜中性粒细胞保护EA测试免受其他因素(如血浆蛋白)的抑制。其他测试(如 LAL 测试)不能说这一点,它要求激活凝固级联。当内毒素不受特定受体结合时,LAL测试表现良好,但在血浆和全血中,不同的蛋白质结合LPS,干扰测定。此外,真菌产品可能触发乳液凝固级联,使测试对GN细菌的特异性降低。由于这些原因,EA优于仍然普遍采用的LAL测试,用于内毒血症18的评估。
但是,为了可靠,必须一丝不苟地遵循上述步骤。被测样品的内毒素水平是通过计算随时间的化学致发光量,测量相同血样作为参考值的基底(管#1)和最大(管#3)反应来计算的。因此,必须小心地将三个管按正确的顺序放入化学光度计中。
在临床实践中使用EA水平不应取代标准测试(如实验室测试和血液培养)在潜在传染病的发病中。虽然LPS显然与GN细菌膜产物的释放有关,但内内毒血症水平也有所上升,以防其他制剂感染19。众所周知,内毒血症可能是由于细菌通过肠道粘液的易位,特别是当组织低灌注和增加的肠道屏障渗透性可能发生20,21。在这种情况下,有可能期望循环LPS是败血症和休克的结果,而不是原因。在这种情况下,EA可以提供有关持续组织损伤的严重程度的信息,而不管细菌病因15。支持这一原则,格里马尔迪等人在最近的一项研究中发现,EA水平的升高与出院心脏骤停后休克的严重程度和持续时间有关。
有趣的是,Virzé等人还强调了内毒素(及其监测)在5型心肌综合征患者中的潜在作用,这种病症在不同系统疾病的设置中具有伴随的心脏和肾功能障碍。,如败血症23 。内毒素已知诱导心肌细胞损伤,虽然确切的病理生理学机制在很大程度上不清楚。另一方面,内毒血症已被证明诱导肾功能障碍,由于局部和全身损伤的几个途径,导致肾血流,肾细胞过滤率和管状功能22损伤。
但是,必须突出显示 EA 的一些限制。持续抗生素治疗对EA结果的影响目前尚未确定24。此外,有证据表明,在危重病人中,单点早期EA测量虽然有用,但并不能可靠地预测败血症休克死亡率,即使大于0.6单位15。可能需要进行连续的重复评估,尽管其数量和时间目前尚不明确。其他作者关注内电外血症的波动,假设每日变异性增加可能与多器官功能障碍的更高程度有关25。最后,需要考虑的另一个技术限制是测量内毒素活性的相对尺度(0至1个单位,最小可检测增量为0.01)。这使得极高的结果不可避免地稳定在最高水平附近,从而使患者子组(EA > 0.9 单位)的分化更难调查。
总之,虽然需要进一步的研究来评估监测内毒素水平对临床结果的潜在影响,但EA目前作为快速、简单和敏感的测试提供,这可能有助于ICU的决策过程危重病败血症患者的临床医生。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Estor SpA 支付了该杂志的出版和视频制作费用。提交人没有利益冲突可披露。
Acknowledgments
我们感谢保罗·布拉加内和丽莎·马蒂亚斯森博士对测定协议方法的审查。达里奥·温特顿,医学博士为审查手稿的英语语言能力提供了实质性帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EAA kit | Spectral Medical Inc. | EAAST-20 | Package with 20 tests + 1 quality control |
| Smart Line TL | Berthold | EAASL | Luminometer |
| Incubator shaker | GRANT | ES-20 | Mini-incubator shaker |
| Vortexer | VWR | 444-2790 | Vortex instrument |
References
- Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).
- Takeda, K. Evolution and integration of innate immune recognition systems: the Toll-like receptors. Journal of Endotoxin Research. 11 (1), 51-55 (2005).
- Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
- Natanson, C., et al. Endotoxin and tumor necrosis factor challenges in dogs simulate the cardiovascular profile of human septic shock. The Journal of Experimental Medicine. 169 (3), 823-832 (1989).
- Suffredini, A. F., et al. The cardiovascular response of normal humans to the administration of endotoxin. The New England Journal of Medicine. 321 (5), 280-287 (1989).
- Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA: The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).
- Gupta, S., et al. Culture-Negative Severe Sepsis: Nationwide Trends and Outcomes. Chest. 150 (6), 1251-1259 (2016).
- Ikeda, T., Ikeda, K., Suda, S., Ueno, T. Usefulness of the endotoxin activity assay as a biomarker to assess the severity of endotoxemia in critically ill patients. Innate Immunity. 20 (8), 881-887 (2014).
- Dellinger, R. P., et al. Effect of Targeted Polymyxin B Hemoperfusion on 28-Day Mortality in Patients With Septic Shock and Elevated Endotoxin Level. The EUPHRATES Randomized Clinical Trial. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 320 (14), 1455-1463 (2018).
- Marshall, J. C., et al. Diagnostic and prognostic implications of endotoxemia in critical illness: results of the MEDIC study. The Journal of Infectious Diseases. 190 (3), 527-534 (2004).
- Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica. 19 (1), 186-197 (1968).
- Marshall, J. C., et al. Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence. Critical Care. 6 (4), London, England. 342-348 (2002).
- Grimaldi, D., et al. High Level of Endotoxemia Following Out-of-Hospital Cardiac Arrest Is Associated With Severity and Duration of Postcardiac Arrest Shock. Critical Care Medicine. 43 (12), 2597-2604 (2015).
- Klein, D. J., et al. The EUPHRATES trial (Evaluating the Use of Polymyxin B Hemoperfusion in a Randomized controlled trial of Adults Treated for Endotoxemia and Septic shock): study protocol for a randomized controlled trial. Trials. 15, 218 (2014).
- Bottiroli, M., et al. Prevalence and clinical significance of early high Endotoxin Activity in septic shock: An observational study. Journal of Critical Care. 41, 124-129 (2017).
- Kaukonen, K. M., Bailey, M., Suzuki, S., Pilcher, D., Bellomo, R. Mortality related to severe sepsis and septic shock among critically ill patients in Australia and New Zealand. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311 (13), 1308-1316 (2014).
- Biagioni, E., et al. Endotoxin activity levels as a prediction tool for risk of deterioration in patients with sepsis not admitted to the intensive care unit: a pilot observational study. Journal of Critical Care. 28 (5), 612-617 (2013).
- Roth, R. I., Levin, F. C., Levin, J. Optimization of detection of bacterial endotoxin in plasma with the Limulus test. The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 116 (2), 153-161 (1990).
- Yaguchi, A., Yuzawa, J., Klein, D. J., Takeda, M., Harada, T. Combining intermediate levels of the Endotoxin Activity Assay (EA) with other biomarkers in the assessment of patients with sepsis: results of an observational study. Critical Care. 16 (3), London, England. (2012).
- Earley, Z. M., et al. Burn Injury Alters the Intestinal Microbiome and Increases Gut Permeability and Bacterial Translocation. PLoS One. 10 (7), (2015).
- Munster, A. M., Smith-Meek, M., Dickerson, C., Translocation Winchurch, R. A. Incidental phenomenon or true pathology? Annals of Surgery. 218 (3), 321 (1993).
- Clementi, A., Virzì, G. M., Brocca, A., Ronco, C. The Role of Endotoxin in the Setting of Cardiorenal Syndrome Type 5. Cardiorenal Medicine. 7 (4), 276-283 (2017).
- Virzì, G. M., et al. Cardiorenal Syndrome Type 5 in Sepsis: Role of Endotoxin. in Cell Death Pathways and Inflammation. Kidney and Blood Pressure Research. 41 (6), 1008-1015 (2016).
- Mignon, F., Piagnerelli, M., Van Nuffelen, M., Vincent, J. L. Effect of empiric antibiotic treatment on plasma endotoxin activity in septic patients. Infection. 42 (3), 521-528 (2014).
- Klein, D. J., et al. Daily variation in endotoxin levels is associated with increased organ failure in critically ill patients. Shock. 28 (5), 524-529 (2007).
