Summary
Por la presente presentamos un protocolo para medir al lado de la cama la actividad endotoxina de muestras de sangre entera humana. El ensayo actividad de la endotoxina es una prueba simple de realizar y puede ser un biomarcador útil en pacientes en estado crítico con sepsis.
Abstract
El lipopolisacárido, también conocido como endotoxina, es un componente fundamental de las bacterias gramnegativas y desempeña un papel crucial en el desarrollo de la sepsis y el shock séptico. La identificación temprana de un proceso infeccioso que está evolucionando rápidamente a una enfermedad crítica podría provocar un tratamiento más rápido e intensivo, lo que podría conducir a mejores resultados para los pacientes. El ensayo actividad de la endotoxina (EA) se puede utilizar junto a la cama como un biomarcador fiable de la endotoxemia sistémica. Se ha demostrado repetidamente que la detección de niveles elevados de actividad de la endotoxina está asociada con un aumento de la gravedad de la enfermedad en pacientes con sepsis y shock séptico. El ensayo es rápido y fácil de realizar. Brevemente, después del muestreo, una alícuota de sangre entera se mezcla con un anticuerpo anti-endotoxina y con LPS añadido. La actividad de la endotoxina se mide como la ráfaga oxidativa relativa de neutrófilos cebados detectados por quimioluminiscencia. La salida del ensayo se expresa en una escala de 0 (ausente) a 1 (máxima) y se clasifica como "baja" (<0,4 unidades), "intermedia" (0,4–0,59 unidades) o "alta" (0,6 unidades). La metodología detallada y los fundamentos para la implementación del ensayo del EA se informan en este manuscrito.
Introduction
El Lipopolisacárido (LPS), también conocido como endotoxina, es un componente clave de la estructura de la membrana de las bacterias Gram-negativas (GN). Constituye alrededor del 10% de la pared celular, siendo vital para la integridad de la membrana externa y la homeostasis. Además, es un potente activador del huéspedsistema inmune innato 1,2.
La exposición in vitro de células innatas del sistema inmunitario a LPS conduce a cambios en la expresión de múltiples genes3. La administración de cantidades muy pequeñas de LPS en voluntarios humanos sanos desencadena la cascada de inflamación sistémica aguda, mientras que la sepsis y el shock séptico pueden surgir con mayores concentraciones de endotoxinas4,5.
La sepsis es una afección potencialmente mortal que, si no se reconoce de inmediato, puede conducir a la insuficiencia multiorgánica y la muerte. Los pacientes sépticos deben ser tratados de manera oportuna, con reanimación agresiva, terapia antibiótica adecuada, control óptimo de la fuente y estrategias de apoyo a los órganos. El diagnóstico de la etiología de la sepsis se basa principalmente en el reconocimiento clínico y la detección de patógenos basada en el cultivo6. Sin embargo, los resultados de cultivos microbianos pueden tardar hasta 48 h y no son concluyentes en hasta el 30% de los casos7. La identificación temprana y la intervención pueden conducir a mejores resultados del paciente. En pacientes en los que se sospecha sepsis, las decisiones a menudo se toman sobre la base de parámetros fisiológicos y bioquímicos, sin un signo claro de endotoxemia.
La medición de la actividad de la endotoxina (EA) se puede obtener mediante un ensayo comercial (ver Tabla de Materiales)en sangre entera. Se puede utilizar como biomarcador de endotoxemia sistémica para la estratificación temprana de la gravedad de la enfermedad, particularmente en pacientes con riesgo de desarrollar shock séptico8. El ensayo se utilizó para guiar la terapia de hemoperfusión de polimixina B en un ensayo clínico aleatorizado aleatorizado doble ciego publicado recientemente en pacientes con shock séptico9. En pacientes en estado crítico, el estudio MEDIC mostró un aumento de los niveles de EA que se asociará con la disfunción de múltiples órganos, la duración de la estancia de la unidad de cuidados intensivos (UCI) y la mortalidad10.
Se han desarrollado diferentes ensayos para detectar endotoxinas. El ensayo de lisato de amebotocitos de Limulus (LAL), ya sea como una prueba de gel-clot, turbidimétrica o cromogénica, ha sido hasta ahora el más adoptado para la estimación de la endotoxina sérica. Se basa en la capacidad de la endotoxina para inducir la coagulación de la hemolinfa del cangrejo herradura, Limulus polyphemus. Sin embargo, este ensayo tiene algunas limitaciones en términos de especificidad. En particular, también puede ser activado por productos microbianos distintos de la endotoxina, tales como componentes de la pared celular de hongos, y puede ser inhibido por varias proteínas plasmáticas humanas11.
Durante la última década la medición de EA ha sido desarrollada y validada como un biomarcador de endotoxemia circulante. En comparación con la prueba LAL, EA es más rápido y fácil de implementar en el entorno clínico. Además, se ha demostrado que es más preciso que la LAL en sangre entera, con mayor sensibilidad y especificidad, tanto in vitro como in vivo12.
A pesar de su implementación inicial como una herramienta de diagnóstico temprano para la rápida identificación de las bacterias GN como agentes causantes de sepsis, el nivel de EA también se ha estudiado como un biomarcador de la gravedad de la enfermedad. En este contexto, se ha demostrado que es particularmente útil evaluar el estado de hipoperfusión debido a una enfermedad crítica en curso, como el shock séptico o el síndrome de paro post-cardiaco13. Más recientemente, desde el desarrollo de sistemas de hemopurificación, también se ha propuesto un resultado positivo de EA como una herramienta de cribado para identificar con precisión los candidatos potenciales para dicha terapia14. Recientemente realizamos un estudio retrospectivo observacional sobre la prevalencia y la importancia clínica de los niveles altos tempranos de EA en 107 pacientes con shock séptico. En línea con otros resultados recientes, encontramos que EA es un marcador prometedor de la gravedad de la enfermedad en pacientes con shock séptico15.
El objetivo del presente manuscrito es describir el método para realizar el ensayo de EA, ya sea junto a la cama o en el laboratorio, y describir su uso potencial en un escenario representativo de choque séptico. Esta técnica puede detectar la actividad de LPS midiendo la ráfaga oxidativa mejorada en neutrófilos después de su cebado por complejos de un anticuerpo anti-endotoxina y LPS. El aumento de la explosión respiratoria se detecta mediante un quimioluminómetro y la cantidad de luz emitida se considera proporcional a la cantidad de endotoxina en la muestra de sangre. El ensayo requiere pocos reactivos, tarda unos 30 minutos en realizarse y utiliza tan poco como 40 s de sangre entera12.
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Protocol
El protocolo se lleva a cabo de acuerdo con las directrices institucionales relativas al manejo de bioespecímenes humanos y siguiendo los procedimientos operativos estándar actuales de nuestro laboratorio clínico. El uso de datos de EA e información clínica de pacientes que se están probando sigue las directrices del comité de ética de investigación humana de nuestra institución.
1. Contenidos del equipo de laboratorio y del kit de ensayo
- Almacene el kit de EA a 2-8 oC cuando no esté en uso.
-
Cada prueba de EA consta de 5 tipos diferentes de tubos; utilizar cada uno para una parte diferente de la prueba (ver sección 2).
- Utilice #1 de tubos (el tubo "Control") para medir la actividad basal de la ráfaga oxidativa no específica de los neutrófilos del paciente en ausencia de un anticuerpo específico.
- Utilice #2 de tubos (el tubo "Muestra") para medir la ráfaga oxidativa en respuesta al complejo de anticuerpos LPS.
- Utilice #3 de tubos (el tubo "Max") para medir la ráfaga oxidativa máxima de los neutrófilos del paciente en respuesta a un exceso de endotoxina.
- Utilice tubos #4 (el tubo "LPS") como fuente de endotoxina exógena.
- Utilice tubos #5 ("tubo Aliquot") para el almacenamiento de sangre.
NOTA: Se proporcionan duplicados de tubos #1, #2 y #3 para un total de 8 tubos que se utilizarán para cada muestra de sangre que se está analizando (el frasco de reactivos de EA y la prueba de control de calidad se pueden utilizar para todas las pruebas contenidas en una bolsa).
- Recoger muestras de sangre del paciente en tubos estériles que contengan anticoagulante EDTA. Almacene muestras de sangre a temperatura ambiente antes de ejecutar la prueba de EA.
- Antes de iniciar la prueba, encienda el quimiluminómetro y la coctelera de la incubadora. Calentar la incubadora a una temperatura de 37oC.
- Idealmente, comience a procesar la muestra en un plazo de 30 minutos a partir de la recolección de sangre.
2. Ensayo de actividad de endotoxinas
- Prepare los tubos de prueba del EA para la muestra de sangre de cada paciente que necesita analizar. Ponga los tubos en bastidores de tubos. A continuación, retire las tapas.
- Con una combipipette, pipetee un volumen de 1 ml del reactivo eA de la botella en tubos #1 (tubo de control), #2 (tubo de muestra) y #3 (tubo máximo), cada uno de ellos por duplicado.
NOTA: Pipetear por el lado del tubo para evitar salpicaduras de solución de nuevo. - Mezcle la muestra de sangre del paciente invirtiendo suavemente el tubo de recolección de sangre durante 20 veces. Luego, pipeta 0,5 ml de sangre del paciente en #4 de tubo (tubo LPS max) y #5 de tubo (tubo aliquot). Tubo de vórtice #4 durante 10 s.
- Coloque los bastidores de tubos con todos los tubos de ensayo de EA en la coctelera de la incubadora. Cerrar la tapa e incubar durante 10 min a una temperatura de 37oC.
- Abra la tapa y retire los portatubos de la coctelera de la incubadora. Tubo de vórtice #5 (tubo Aliquot). Usando una punta estéril, pipetear 40 l de sangre en tubos #1 y #2, por duplicado.
- Tubo de vórtice #4 (tubo LPS). Usando la misma punta de pipeta, pipeta 40 l de sangre del tubo #4 en tubo #3 (tubo máximo), por duplicado.
- Vortex los seis tubos de ensayo finales (#1, #2, #3 y los duplicados respectivos), luego colóquelos de nuevo en sus bastidores.
NOTA: Asegúrese de que todos los tubos estén vórticos durante la misma cantidad de tiempo. - Vuelva a colocar los portatubos en la coctelera de incubación y cierre la tapa. Ajuste la agitadora de incubación a 100 rpm y, a continuación, inicie el movimiento durante 14 minutos.
- Inserte la tarjeta de chip con la etiqueta EA en el quimiluminómetro y pulse Start. Después de la incubación de 14 minutos, siga las instrucciones que se muestran en el quimiluminómetro para leer los tubos del EA en el orden correcto.
- Retírelo suavemente por cada tubo durante 10 s antes de colocarlo en el portamuestras del quimiluminómetro. Abra el cajón de muestras y coloque el tubo #1 en el soporte de la muestra. A continuación, cierre el cajón de muestra y espere a que la unidad de luz relativa (RLU) lea.
- Repita el paso 2.10 para el tubo 2 y el tubo 3.
- Repita el paso 2.10 para los tubos duplicados 1, 2 y 3.
NOTA: Trate de vórtice todos los tubos durante la misma cantidad de tiempo durante los pasos 2.10–2.12. - Una vez procesados todos los tubos, tenga en cuenta que los resultados del EA se calcularán e imprimirán automáticamente. Los niveles se expresan como unidades de eA y representan la media de las determinaciones duplicadas de las mismas muestras.
- Repita los pasos 2.2 a 2.13 para cada muestra de sangre que deba analizarse.
- Una vez completado el ensayo, guarde los tubos de ensayo y los reactivos de EA restantes a 2-8 oC durante un máximo de 30 días.
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Representative Results
Un hombre de 72 años fue ingresado en el Departamento de Emergencias (ED) de un hospital urbano académico. Unos días antes había presentado a su médico de atención primaria quejándose de ardor al orinar. Se recomendó una terapia de curso corto con fosfomicina oral. Su historia clínica incluyó hipertensión, diabetes tipo 2 sin complicaciones e hiperplasia prostática benigna. Sus medicamentos incluían enalapril, atorvastatina, tamsulosina y metformina.
En el ED, estaba letárgico, confundido cuando fue despertado. Su temperatura era de 39,1 oC, la frecuencia cardíaca era de 125 latidos por minuto, la presión arterial era de 80/40 mmHg, la frecuencia respiratoria era de 20/min, y la spO2 era del 94% en el aire de la habitación, elevando al 99% con oxígeno de 4 L/min a través de una cánula nasal. El examen abdominal fue normal, excepto por sensibilidad suprapúbica leve mal localizada. Con dificultad, se colocó un catéter Foley. Se drenó una baja cantidad de orina purulenta de color oscuro.
Un hemograma completo reveló un recuento de glóbulos blancos de 18,5 x 103. El análisis de gas sanguíneo arterial fue de 2,7 mg/dL, la glucosa fue de 250 mg/dL, y el nivel de ácido láctico fue de 4,5 mmol/L. El análisis de gas sanguíneo arterial reveló acidosis mixta, con pH 7,23, pCO2 48 mmHg, pO2 88 mmHg y HCO3- 15 mmol/L.
Se colocó un catéter venoso central, con guía por ultrasonido, en la vena yugular interna derecha. Se obtuvo un análisis de gas sanguíneo al colocar el catéter, revelando un valor de 63% ScVO 2. La reanimación agresiva de líquidos se inició rápidamente con una perfusión de bolo cristaloides de 30 ml/kg durante 30 min. También se inició la perfusión de norephinephrine. El paciente fue trasladado a la UCI con un diagnóstico de shock séptico, probablemente originado a partir de una infección del tracto urinario.
En la UCI, en medio de la recolección de cultivos microbianos y la administración de terapia antibiótica empírica, se obtuvo una muestra de sangre completa para las pruebas de EA. El ensayo se realizó rápidamente de acuerdo con el protocolo aquí presentado.
Con el fin de calcular los resultados del EA, el quimiluminómetro registra: la luminiscencia basal de los neutrófilos (L1); luminiscencia de la actividad de los neutrófilos en respuesta al LPS en la muestra de sangre (L2); la actividad máxima de los neutrófilos en respuesta a la exposición masiva a LPS (L3). Los resultados se expresan como: Actividad de la endotoxina (EA) - (L2-L1)/(L3-L1). Por lo tanto, el valor resultante del EA refleja el grado de ráfaga oxidativa de neutrófilos del paciente debido a la presencia de endotoxina circulante (L2), normalizada por el nivel más alto de luminiscencia que se puede medir en la misma muestra de sangre en respuesta a una concentración supramáxima de LPS (L3). Ambos valores se controlan para la luminiscencia basal de la muestra (L1).
Después de aproximadamente 30 minutos, el clínico reconoció 0,75 unidades de EA como el nivel de actividad de endotoxina del paciente.
Un valor de EA inferior a 0,40 unidades de EA indica un bajo nivel de actividad de endotoxina, igual a una baja concentración de LPS circulante, lo que representa un bajo riesgo de progresión a un estado de enfermedad grave. Los resultados entre 0,40 unidades EA y 0,59 EA indican un nivel intermedio de actividad de la endotoxina, que representa un riesgo elevado para el desarrollo de sepsis grave y shock séptico. Resultados iguales o superiores a 0,60 unidades de EA indican un alto nivel de actividad de la endotoxina, lo que representa un alto riesgo de shock séptico y resultados deficientes del paciente (Tabla1).
Por lo tanto, se confirmó el diagnóstico de shock séptico, probablemente debido a la bacteria GN. El paciente también fue clasificado como de un riesgo extremadamente alto, en línea con la evidencia de fallas concomitantes de órganos y nivel de lactato. Además, fue tratado con reanimación de volumen agresiva y apoyo vasoactivo. Se consideró, pero no se implementó la terapia de hemopurificación de polimixina-B, debido a la convincente respuesta temprana del paciente a líquidos y vasopresores. El día 2, Escherichia coli fue confirmado como el agente causante a través de cultivos sanguíneos positivos. Con la terapia antibiótica adecuada, el paciente se recuperó, siendo dado de alta de la UCI el día 7. Se realizó una segunda prueba de EA antes de la descarga de la UCI. Un resultado de 0,2 unidades EA indicó una resolución completa de la cascada bioquímica provocada por un shock séptico.
La Figura 1 muestra la distribución de los valores de EA medidos dentro de 24 h en una población de muestra de pacientes con shock séptico.
Figura 1: Distribución de los niveles de actividad de la endotoxina (EA) medidos en un plazo de 24 h a partir de la aparición de shock séptico en una población de pacientes en estado crítico (n.o 107). Adaptado de Bottiroli, et al. con permiso15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Unidades de EA | Nivel de actividad de la endotoxina |
| <0.40 | Bajo |
| 0.40 – 0.59 | Intermedio |
| 0,60 | Alto |
Tabla 1: Categorías de niveles de actividad de la endotoxina. EA - Actividad de la endotoxina.
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Discussion
El shock séptico todavía hoy en día se asocia con una mortalidad de hasta el 40%, aunque esta tasa varía según los informes considerados16. La necesidad de biomarcadores novedosos y mejores es defendida por la mayoría de los expertos en los campos con el fin de ayudar a los médicos en el diagnóstico temprano, mejor manejo, y pronóstico de pacientes con shock séptico6.
Realizar una prueba de EA no requiere conocimientos técnicos previos ni equipos de laboratorio sofisticados, y cualquier proveedor de atención médica puede aprender fácil y rápidamente cómo ejecutarlo. La rápida identificación de un EA de alta circulación podría ayudar a estratificar el riesgo del paciente, desencadenando un enfoque terapéutico más temprano y más agresivo. Por el contrario, un resultado de EA de menos de 0,40 unidades eA podría indicar un bajo riesgo de progresión a la insuficiencia multiorgánica17. El uso de las muestras del paciente como su propio control es simple, hace que esta prueba sea más sensible y una representación más precisa del verdadero nivel sanguíneo de endotoxemia.
El uso de complejos de anticuerpos LPS y los propios neutrófilos del paciente protege la prueba de EA de ser posiblemente inhibida por otros factores (por ejemplo, proteínas plasmáticas). No se puede decir lo mismo de otra prueba, como la prueba LAL, que requiere la activación de una cascada de coagulación. La prueba de LAL funciona bien cuando la endotoxina no está unida por un receptor específico, pero en plasma y sangre entera diferentes proteínas unen LPS, interfiriendo con el ensayo. Además, los productos fúngicos pueden desencadenar la cascada de coagulación limulus, haciendo que la prueba sea menos específica para las bacterias GN. Por esta razón, el EA es superior a la prueba LAL todavía comúnmente adoptada para la evaluación de la endotoxemia18.
Sin embargo, para que la prueba de EA sea fiable, es crucial seguir meticulosamente los pasos antes mencionados. El nivel de endotoxina de la muestra que se está probando se calcula calculando la quimioluminiscencia a lo largo del tiempo, midiendo las respuestas basales (#1 tubo) y máximas (#3) para la misma muestra de sangre que los valores de referencia. Por lo tanto, es imperativo colocar cuidadosamente los tres tubos en el orden correcto en el quimiluminómetro.
El uso de los niveles de EA en la práctica clínica no debe reemplazar las pruebas estándar (por ejemplo, pruebas de laboratorio y cultivos sanguíneos) en el estudio de una posible enfermedad infecciosa. Aunque LPS podría estar claramente asociado con la liberación de productos de membrana de bacterias GN, también se han notificado niveles elevados de endotoxemia en caso de infecciones debidas a otros agentes19. Es muy conocido que la endotoxemia podría deberse a la translocación de bacterias a través de la mucosa intestinal, especialmente cuando es probable que se produzca hipoperfusión tisular y aumento de la permeabilidad de la barrera intestinal20,21. En tales condiciones, es posible esperar que el LPS circulante sea una consecuencia, en lugar de la causa, de sepsis y shock. En este escenario, el EA podría proporcionar información sobre la gravedad de la lesión tisular en curso, independientemente de la etiología bacteriana15. Apoyando este principio, en un estudio reciente Grimaldi et al. encontraron que la elevación de los niveles de EA se asociaría con la gravedad y duración del shock después del paro cardíaco fuera del hospital13.
Curiosamente, Virzí et al. también destacaron el papel potencial de la endotoxina (y su monitoreo) en pacientes con síndrome cardiorrenal tipo 5, una condición caracterizada por disfunción cardíaca y renal concomitante en el entorno de diferentes trastornos sistémicos , como la sepsis23 . Se sabe que la endotoxina induce deterioro de los miocitos cardíacos, aunque el mecanismo fisiopatológico exacto no está claro en gran medida. Por otro lado, se ha demostrado que la endotoxemia induce disfunción renal debido a varias vías de lesión local y sistémica, causando deterioros del flujo sanguíneo renal, tasa de filtración glomerular y función tubular22.
Sin embargo, se deben destacar algunas limitaciones del EA. La influencia de una terapia antibiótica en curso en el resultado del EA no está actualmente bien establecida24. Además, la evidencia sugiere que en pacientes con enfermedades críticas una medición de EA temprana de un solo punto, aunque útil, no predice de forma fiable la mortalidad por shock séptico, incluso cuando es mayor de 0,6 unidades15. Es posible que se necesiten evaluaciones repetidas en serie, aunque su número y horario no están claros actualmente. Otros autores se centraron en las fluctuaciones en la endotoxemia, hipotetizando que un aumento de la variabilidad diaria podría estar asociado con un mayor grado de disfunción multiorgánica25. Por último, una limitación técnica adicional a tener en cuenta es la escala relativa a lo largo de la cual se mide la actividad de la endotoxina (0 a 1 unidades, con 0,01 incrementos mínimos detectables). Esto hace que los resultados extremadamente altos inevitablemente se estanca alrededor del nivel máximo, haciendo diferencias en este subgrupo de pacientes (EA > 0.9 unidades) más difíciles de investigar.
En conclusión, si bien se necesitan más estudios para evaluar el impacto potencial de la monitorización de los niveles de endotoxina en los resultados clínicos, el EA está actualmente disponible como una prueba rápida, sencilla y sensible, lo que podría facilitar el proceso de toma de decisiones de la UCI médicos en pacientes sépticos críticos.
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Disclosures
Estor SpA cubrió el costo de la cuota de publicación y producción de video de la revista. Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Paolo Bragano y Lisa Mathiasen, Ph.D. por su revisión de la metodología del protocolo de ensayo. Dario Winterton, MD proporcionó una ayuda sustancial para revisar el manuscrito para el dominio del idioma inglés.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EAA kit | Spectral Medical Inc. | EAAST-20 | Package with 20 tests + 1 quality control |
| Smart Line TL | Berthold | EAASL | Luminometer |
| Incubator shaker | GRANT | ES-20 | Mini-incubator shaker |
| Vortexer | VWR | 444-2790 | Vortex instrument |
References
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