Endotoxin-Aktivitetsanalyse til påvisning af fuldblods Endotoxæmi hos kritisk syge patienter

Summary

Vi fremlægger hermed en protokol til måling af endotoksin aktivitet af humane fuldblodsprøver ved sengen. Den endotoxin aktivitet assay er en simpel test til at udføre og kan være en nyttig biomarkør hos kritisk syge patienter med sepsis.

Abstract

Lipopolysaccharid, også kendt som endotoxin, er en grundlæggende bestanddel af gram-negative bakterier og spiller en afgørende rolle i udviklingen af sepsis og septisk chok. Tidlig identificering af en smitsom proces, der hurtigt udvikler sig til en kritisk sygdom, kan medføre en hurtigere og mere intensiv behandling og dermed potentielt føre til bedre patientresultater. Den endotoxin aktivitet (EA) assay kan anvendes ved sengen som en pålidelig biomarkør af systemisk endotoxæmi. Påvisning af forhøjede endotoksin-aktivitetsniveauer er gentagne gange blevet påvist at være forbundet med en øget sygdoms sværhedsgrad hos patienter med sepsis og septisk Shock. Analysen er hurtig og nem at udføre. Kort efterprøve udtagning blandes en alikvot fuldblod med et anti-endotoksit antistof og tilsat LPS. Endotoksin aktivitet måles som den relative oxidativ eksplosion af primede neutrofiler som påvist ved chemioluminescens. Analysens udgang udtrykkes på en skala fra 0 (fraværende) til 1 (maksimal) og kategoriseres som "lav" (< 0,4 enheder), "intermediært" (0,4 – 0,59 enheder) eller "høj" (≥ 0,6 enheder). Den detaljerede metodologi og begrundelse for gennemførelsen af EA-analysen rapporteres i dette manuskript.

Introduction

Lipopolysaccharid (LPS), også kendt som endotoxin, er en vigtig bestanddel af membran strukturen af gram-negative (GN) bakterier. Det udgør omkring 10% af cellevæggen, er afgørende for den ydre membran integritet og homøostase. Desuden er det en potent aktivator af værten medfødte immunsystem^1,2.

In vitro eksponering af medfødte immunsystemceller til LPS fører til ændringer i ekspression af flere gener³. Indgivelse af meget små mængder af LPS hos raske humane frivillige udløser kaskade af akut systemisk inflammation, hvorimod sepsis og septisk Shock kan opstå med højere endotoksin koncentrationer^4,5.

Sepsis er en livstruende tilstand, som, hvis det ikke straks anerkendes, kan føre til multi-organsvigt og død. Septiske patienter skal behandles rettidigt, med aggressiv genoplivning, tilstrækkelig antibiotikabehandling, optimal kilde kontrol, og hurtig organ støtte strategier. Diagnosen af etiologien af sepsis er primært baseret på klinisk anerkendelse og kultur baseret patogen detektion⁶. Men, resultaterne af mikrobielle kulturer kan tage op til 48 h og er inkonklusive i op til 30% af tilfældene⁷. Tidlig identificering og intervention kan føre til bedre patientresultater. Hos patienter, hvor der er mistanke om sepsis, træffes beslutninger ofte på grundlag af fysiologiske og biokemiske parametre uden et klart tegn på endotoxæmi.

Måling af endotoksin aktivitet (EA) kan opnås ved hjælp af en kommerciel analyse (Se tabel over materialer) i fuldblod. Det kan bruges som en biomarkør af systemisk endotoxæmi til tidlig stratificering af sygdommens sværhedsgrad, især hos patienter med risiko for at udvikle septisk Shock⁸. Analysen blev brugt til at vejlede polymyxin B hæmoperfusion terapi i et nyligt offentliggjort dobbelt-blind randomiseret-kontrolleret klinisk forsøg hos patienter med septisk Shock⁹. Hos kritisk syge patienter viste MEDIC-studiet øget EA-niveau for at være forbundet med flere organ dysfunktion, intensiv pleje enhed (ICU) opholdets længde og dødelighed¹⁰.

Forskellige assays er blevet udviklet til påvisning af endotoxin. Den Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay, enten som en gel-prop, turbidimetrisk, eller kromogen test, har hidtil været den hyppigst vedtagne til vurdering af serum endotoxin. Det er baseret på endotoksin evne til at fremkalde koagulation af hemolymh af hestesko krabbe, Limulus polyphemus. Men, denne analyse har nogle begrænsninger i form af specificitet. Især kan det også aktiveres af mikrobielle produkter, bortset fra endotoxin, såsom komponenter af svampe cellevæggen, og det kan hæmmes af forskellige humane plasmaproteiner¹¹.

I løbet af det sidste årti er målingen af EA blevet udviklet og valideret som en biomarkør af cirkulerende endotoxæmi. Sammenlignet med LAL-testen er EA hurtigere og nemmere at implementere i de kliniske omgivelser. Desuden har det vist sig at være mere præcis end LAL i fuldblod, med øget følsomhed og specificitet, både in vitro og in vivo¹².

På trods af sin oprindelige gennemførelse som et tidligt diagnostisk værktøj til hurtig identifikation af GN bakterier som sepsis kausative agenter, er EA-niveauet også blevet undersøgt som en biomarkør af sygdommens sværhedsgrad. I denne sammenhæng har det vist sig at være særlig nyttigt at vurdere hypoperfusion tilstand på grund af igangværende kritisk sygdom, såsom septisk Shock eller post-hjertestop syndrom¹³. For nylig, siden udviklingen af hemopurificering systemer, et positivt EA resultat er også blevet foreslået som et screeningsværktøj til præcist at identificere potentielle kandidater til en sådan behandling¹⁴. Vi har for nylig gennemført en observations retrospektiv undersøgelse af forekomsten og den kliniske signifikans af tidlige høje niveauer af EA hos 107 patienter med septisk Shock. I overensstemmelse med andre nylige resultater konstaterede vi, at EA er en lovende markør for sygdommens sværhedsgrad hos patienter med septisk Shock¹⁵.

Formålet med dette manuskript er at beskrive metoden til udførelse af EA-analysen, enten ved sengen eller i laboratoriet, og at beskrive dens potentielle anvendelse i et repræsentativt scenario med septisk Shock. Denne teknik kan detektere LPS aktivitet ved at måle den forbedrede oxidativ burst i neutrofiler efter deres priming af komplekser af en anti-endotoxin antistof og LPS. Den øgede respiratoriske eksplosion påvises ved et kemiluminometer, og mængden af det udsendte lys anses for proportional med mængden af endotoksin i blodprøven. Analysen kræver få reagenser, tager ca. 30 min til at udføre og bruger så lidt som 40 μL fuldblod¹².

Protocol

Protokollen gennemføres i henhold til de institutionelle retningslinjer for håndtering af humane bioprøver og efter de nuværende standard operative procedurer i vores kliniske laboratorium. Brugen af EA-data og kliniske oplysninger om patienter, der testes, følger retningslinjerne i vores institutions etiske komité for human forskning.

1. laboratorieudstyr og indhold af Analysesæt

1. Opbevar EA-kittet ved 2 – 8 °C, når det ikke er i brug.
2. Hver EA-test består af 5 forskellige slags rør; Brug hver enkelt til en anden del af testen (se punkt 2).
   1. Brug tube #1 ("Control" tube) til at måle basal aktivitet af den ikke-specifikke oxidativ burst af patientens neutrofiler i fravær af et specifikt antistof.
   2. Brug tube #2 ("Sample" røret) til at måle den oxidativ burst som reaktion på LPS-antistof-komplekset.
   3. Brug tube #3 ("Max" røret) til at måle den maksimale oxidativ eksplosion af patientens neutrofiler som respons på et overskud af endotoxin.
   4. Brug Tube #4 ("LPS" røret) som en kilde til udefrakommende endotoksin.
   5. Brug tube #5 ("aliquot" tube) til opbevaring af blod.
      Bemærk: Der findes duplikater af rør #1, #2 og #3 for i alt 8 rør, der skal anvendes til hver enkelt blodprøve, der testes (EA-reagens flasken og kvalitetskontrol testen kan anvendes til alle prøvninger i en pose).
3. Indsamle patient blodprøver i sterile rør, der indeholder EDTA-antikoagulantia. Opbevar blodprøver ved stuetemperatur, før du kører EA-testen.
4. Før testen påbegyndes, skal du tænde for chemiluminometer og inkubator shaker. Varm inkubator til en temperatur på 37 °C.
5. Ideelt set, begynde at behandle prøven inden for 30 min fra blod opsamling.

2. analyse af endotoksin aktivitet

1. Forbered EA'S reagensglas til hver patients blodprøve, du skal teste. Sæt rørene i Rørstativer. Fjern derefter caps.
2. Ved hjælp af en combipipette afpipetteres en 1 mL volumen af EA-reagenset fra flasken til rør #1 (kontrol røret), #2 (prøverør) og #3 (max tube), hver i to eksemplarer.
   Bemærk: Pipetten ned på siden af røret for at undgå, at opløsningen sprøjter op igen.
3. Bland patientens blodprøve ved forsigtigt at invertere blodindsamlings røret i 20 gange. Derefter pipetteres 0,5 mL patient blod i Tube #4 (LPS Max tube) og tube #5 (aliquot tube). Vortex Tube #4 i 10 s.
4. Sæt Rørbøjler med alle EA-reagensglas i inkubator-rysteapparatet. Luk låget og Inkuber i 10 min ved en temperatur på 37 °C.
5. Åbn låget og fjern rørstativerne fra inkubator shaker. Vortex tube #5 (aliquot tube). Brug en steril spids, pipetten 40 μL blod i rørene #1 og #2, i to eksemplarer.
6. Vortex Tube #4 (LPS tube). Brug samme pipettespids til at pipettere 40 μL blod fra rør#4 i rør#3 (maks. tube) i to eksemplarer.
7. Vortex de seks afsluttende reagensglas (#1, #2, #3 og de respektive dubletter), og Placer dem derefter i deres stativer igen.
   Bemærk: Sørg for, at alle rørene er vortexes for den samme mængde tid.
8. Sæt rørstativerne tilbage i den inkube ende shaker og luk låget. Indstil inkuberet shaker ved 100 rpm, og start derefter bevægelsen i 14 minutter.
9. Indsæt det EA-mærkede chipkort i chemiluminometeret, og tryk på Start. Efter 14 min inkubation skal du følge instruktionerne på chemiluminometeret for at læse EA-rørene i den rigtige rækkefølge.
10. Hvirv forsigtigt hvert rør i 10 s, før det anbringes på prøveholderen på kemi luminometeret. Åbn prøve skuffen, og Placer røret #1 i prøveholderen. Luk derefter prøve skuffen, og vent på, at den relative lysenhed (RLU) læses.
11. Gentag trin 2,10 for tube 2 og tube 3.
12. Gentag trin 2,10 for duplikerede rør 1, 2 og 3.
    Bemærk: Prøv at vortex alle rør for den samme mængde tid i trin 2.10-2.12.
13. Når alle rørene er blevet behandlet, skal du være opmærksom på, at EA'S resultater vil blive beregnet og udskrevet automatisk. Niveauerne udtrykkes som EA-enheder og repræsenterer middelværdien af dobbeltbestemmelse fra de samme prøver.
14. Gentag trin 2,2 til 2,13 for hver blodprøve, der skal testes.
15. Når analysen er færdig, opbevares de resterende reagensglas og EA-reagenser ved 2 – 8 °C i op til 30 dage.

Representative Results

En 72-årig mand blev optaget på skadestuen (ED) af et akademisk byhospital. Et par dage tidligere havde han præsenteret for sin primære pleje læge klager over afbrænding på vandladning. En kort behandlings behandling med oral foshomycin blev anbefalet. Hans sygehistorie omfattede hypertension, ukompliceret type-2 diabetes og benign prostatahyperplasi. Hans medicin inkluderede enalapril, atorvastatin, Tamsulosin og metformin.

I ED, han var sløvle, forvirret, når vækket. Hans temperatur var 39,1 °C, puls var 125 slag i minuttet, blodtrykket var 80/40 mmHg, respiratorisk hastighed var 20/min, og SpO₂ var 94% i rumluft, hæve til 99% med 4 L/min ilt gennem en næse kanyle. Abdominal eksamen var normal, bortset fra dårligt lokaliseret mild suprapubisk ømhed. Med besvær, et Foley kateter blev placeret. En lav mængde af mørkfarvet Purulent urin blev drænet.

En komplet blodtælling afslørede et hvidt celletal på 18,5 x 10³. Kreatinin var 2,7 mg/dl, glucose var 250 mg/dl, og mælkesyre niveauet var 4,5 mmol/L. arteriel blodgasanalyse afslørede blandet acidose, med pH 7,23, PCO₂ 48 mmHg, pO₂ 88 mmHg og HCO₃^- 15 mmol/L.

Et centralt venekateter blev placeret, med ultralyds vejledning, i den rigtige interne jugulære vene. En BLODGAS analyse blev opnået ved kateter placering, afslører en 63% ScVO₂ værdi. Aggressiv væske genoplivning blev straks startet med en 30 mL/kg krystalloid-infusion over 30 min. Norephinephrininfusion blev også initieret. Patienten blev overført til ICU med en diagnose af septisk Shock, sandsynligvis stammer fra en urinvejsinfektion.

I ICU, blandt mikrobielle kulturer indsamling og empiriske antibiotikabehandling administration, en hel blodprøve blev opnået for EA test. Analysen blev hurtigt udført i henhold til protokollen præsenteret heri.

For at beregne EA'S resultater, chemiluminometer optegnelser: basal luminescens af neutrofiler (L1); luminescens af neutrofiler aktivitet som respons på LPS i blodprøven (L2); den maksimale neutrofile aktivitet som respons på massiv eksponering for LPS (L3). Resultaterne udtrykkes som: endotoxin aktivitet (EA) = (L2-L1)/(L3-L1). Derfor afspejler den resulterende EA-værdi graden af patientens neutrofile oxidativ burst på grund af tilstedeværelsen af cirkulerende endotoksin (L2), normaliseret med det højeste luminescens niveau, som kan måles i den samme blodprøve som reaktion på en over Maximal koncentration af LPS (L3). Begge værdier styres for den basale luminescens af prøven (L1).

Efter ca. 30 minutter erkendte klinikeren, at 0,75 EA-enheder var patientens endotoksin-aktivitetsniveau.

En EA-værdi på mindre end 0,40 EA-enheder indikerer et lavt endotoksin aktivitetsniveau svarende til en lav cirkulerende LPS-koncentration, hvilket udgør en lav risiko for progression til en svær sygdomstilstand. Resultater mellem 0,40 EA og 0,59 EA-enheder indikerer et intermediært endotoksin aktivitetsniveau, som udgør en forhøjet risiko for udvikling af svær sepsis og septisk Shock. Resultater, der er lig med eller større end 0,60 EA-enheder indikerer et højt endotoksin aktivitetsniveau, som udgør en høj risiko for septisk Shock og dårlige patientresultater (tabel 1).

Diagnosen septisk chok, sandsynligvis på grund af GN bakterier, blev derfor bekræftet. Patienten blev også kategoriseret som værende på ekstremt høj risiko, i overensstemmelse med evidens for samtidig organsvigt og laktat niveau. Han blev desuden behandlet med aggressiv volumen genoplivning og vasoaktiv støtte. Polymixin-B hemopurification behandling blev betragtet, men ikke implementeret, på grund af den overbevisende tidlig respons af patienten til væsker og vasopressorer. På dag 2 blev Escherichia coli bekræftet som det agens middel gennem positive blod kulturer. Med den passende antibiotikabehandling, patienten genvundet, bliver udskrevet fra ICU på dag 7. En anden EA-test blev udført før ICU-udledning. Et resultat af 0,2 EA-enheder indikerede fuldstændig opløsning af den biokemiske kaskade udløst af septisk Shock.

Figur 1 viser fordelingen af EA-værdier målt inden for 24 timer i en stikprøvepopulation af septisk Shock-patienter.

Figur 1: fordeling af endotoksin aktivitet (EA) målt inden for 24 timer fra septisk chok debut i en population af kritisk syge patienter (n = 107). Tilpasset fra Bottiroli, et al. med tilladelse¹⁵. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

EA-enheder	Endotoxin-aktivitetsniveau
< 0,40	Lav
0,40 – 0,59	Mellemliggende
≥ 0,60	Høj

Tabel 1: kategorier af endotoxin-aktivitetsniveauer. EA = endotoksin aktivitet.

Discussion

Septisk Shock er stadig i dag forbundet med en dødelighed så højt som 40%, selv om denne sats varierer i henhold til de betragtede rapporter¹⁶. Behovet for nye og bedre biomarkører er anbefalet af de fleste eksperter på områderne for at hjælpe klinikere i tidlig diagnose, bedre ledelse og prognose af patienter med septisk chok⁶.

Udførelse af en EA-test kræver ikke tidligere teknisk viden eller sofistikeret laboratorieudstyr, og enhver sundhedsudbyder kan nemt og hurtigt lære at køre den. En hurtig identifikation af en høj cirkulerende EA kan hjælpe med at stratificere patientens risiko, udløse en tidligere og mere aggressiv terapeutisk tilgang. Omvendt kan et EA-resultat på mindre end 0,40 EA-enheder indikere en lav risiko for progression til multi organsvigt¹⁷. Brugen af patientens prøver som deres egen kontrol er enkel, gør denne test mere følsom og en mere præcis gengivelse af det sande blod niveau af endotoxæmi.

Brugen af LPS-antistof komplekser og patientens egne neutrofiler beskytter EA-testen mod muligvis at blive hæmmet af andre faktorer (f. eks. plasmaproteiner). Det samme kan ikke siges om andre test, ligesom LAL test, som kræver aktivering af en koagulations kaskade. LAL-testen klarer sig godt, når endotoksin ikke er bundet af en specifik receptor, men i plasma og fuldblod forskellige proteiner binder LPS, interfererer med analysen. Desuden kan svampeprodukter udløse Limulus koagulations kaskade, hvilket gør testen mindre specifik for GN bakterier. Af denne grund er EA bedre end den stadig almindeligt vedtagne LAL-test til evaluering af endotoxemia¹⁸.

Men for at EA-testen skal være pålidelig, er det afgørende at følge de førnævnte trin omhyggeligt. Endotoksin-niveauet for den prøve, der testes, beregnes ved at beregne chemiluminescens over tid, idet der måles basal (tube #1) og maksimal (tube #3) respons for samme blodprøve som referenceværdier. Derfor er det bydende nødvendigt omhyggeligt at placere de tre rør i den rigtige rækkefølge i chemiluminometeret.

Brugen af EA-niveauer i klinisk praksis bør ikke erstatte standard tests (f. eks. laboratorieundersøgelser og blod kulturer) i oparbejdelse af en potentiel infektionssygdom. Selv om LPS klart kan være forbundet med frigivelsen af GN bakterier membran produkter, forhøjede niveauer af endotoxæmi er også blevet rapporteret i tilfælde af infektioner på grund af andre agenter¹⁹. Det er meget velkendt, at endotoxæmi kan skyldes omplacering af bakterier gennem tarmslimhinden, især når vævs hypoperfusion og øget tarm barriere permeabilitet sandsynligvis vil forekomme^20,21. Under sådanne forhold er det muligt at forvente, at cirkulerende LPS er en konsekvens, snarere end årsagen, af sepsis og chok. I dette scenarie kan EA give oplysninger om sværhedsgraden af den igangværende vævsskade, uanset bakterie ætiologi¹⁵. Understøtte dette princip, i en nylig undersøgelse Grimaldi et al. fandt elevation af EA niveauer til at være forbundet med sværhedsgraden og varigheden af chok efter out-of-Hospital hjertestop¹³.

Interessant, virzí et al. også fremhævet den potentielle rolle endotoksin (og dets overvågning) hos patienter med type 5 kardiorenal syndrom, en tilstand karakteriseret ved samtidig hjerte og renal dysfunktion i fastsættelsen af forskellige systemiske lidelser , såsom sepsis²³ . Endotoxin er kendt for at inducere svækkelse af hjertets myocytter, selv om den nøjagtige patofysiologiske mekanisme er stort set uklar. På den anden side har endotoxæmi vist sig at inducere nedsat nyrefunktion på grund af flere forskellige veje af lokal og systemisk skade, hvilket medfører nedsat blodgennemstrømning, glomerulær filtrationshastighed og rørformede funktioner²².

Men et par begrænsninger i EA skal fremhæves. Indflydelsen af en igangværende antibiotikabehandling på EA-resultatet er i øjeblikket ikke veletableret²⁴. Desuden tyder evidens på, at en enkeltpunkts tidlig EA-måling hos kritiske syge patienter, mens det er nyttigt, ikke pålideligt forudser septisk chok dødelighed, selv når større end 0,6 enheder¹⁵. Der kan være behov for serielle gentagne vurderinger, selv om deres antal og timing i øjeblikket er uklare. Andre forfattere fokuserede på udsving i endotoxæmi, en hypotese om, at en øget daglig variation kan være forbundet med en højere grad af multi-organ dysfunktion²⁵. Endelig er en yderligere teknisk begrænsning, der skal overvejes, den relative skala, langs hvilken endotoksin aktivitet måles (0 til 1 enheder, med 0,01 mindste påviseligt intervaller). Dette gør ekstremt høje resultater uundgåeligt plateau omkring det maksimale niveau, og dermed gøre differentieringer i denne under gruppe af patienter (EA > 0,9 enheder) sværere at undersøge.

Selv om der er behov for yderligere undersøgelser for at evaluere den potentielle indvirkning af overvågningen af endotoksin på det kliniske resultat, er EA i øjeblikket tilgængelig som en hurtig, enkel og følsom test, der kan lette beslutningsprocessen for ICU hos patienter med kritisk syge septisk behandling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EAA kit	Spectral Medical Inc.	EAAST-20	Package with 20 tests + 1 quality control
Smart Line TL	Berthold	EAASL	Luminometer
Incubator shaker	GRANT	ES-20	Mini-incubator shaker
Vortexer	VWR	444-2790	Vortex instrument