Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Eleştirel hasta hastalarda tam kan endotoksemi tespiti için endotoksin aktivite assay

doi: 10.3791/58507 Published: June 24, 2019

Summary

Bu konuda, insan bütün kan örneklerinin endotoksin aktivitesinin başında ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Endotoksin aktivite tahlil gerçekleştirmek için basit bir test ve sepsis ile eleştirel hasta hastalarda yararlı bir biyomarker olabilir.

Abstract

Endotoksin olarak da bilinen lipopolysaccharide, gram-negatif bakterilerin temel bir bileşenidir ve sepsis ve septik şok gelişiminde önemli bir rol oynamaktadır. Kritik bir hastalığa hızla gelişen bulaşıcı bir sürecin erken tanımlanması, daha hızlı ve daha yoğun bir tedavi isteyebilir, böylece potansiyel olarak daha iyi hasta sonuçlarına yol açın. Endotoksin aktivitesi (EA) assay, sistemik endotoksemi güvenilir bir biyomarker olarak başucunda kullanılabilir. Yüksek endotoksin aktivite düzeylerinin tespiti, sepsis ve septik şok hastalarında artan bir hastalık şiddetiyle ilişkili olarak tekrar tekrar gösterildi. Tahlil hızlı ve kolay gerçekleştirmek için. Kısaca, örnekleme sonra, tam kan bir kısım bir anti-endotoksin antikor ile karıştırılır ve eklenen LPS ile. Endotoksin aktivitesi, kemioluminesans ile algılandığı gibi, astar nötrofiller bağıl oksidatif patlaması olarak ölçülür. Testin çıkışı 0 ' dan (bulunmayan) 1 ' e (maksimal) ve "düşük" (< 0.4 ünite), "Orta" (0.4 – 0.59 birimler) veya "yüksek" (≥ 0,6 birimler) olarak sınıflandırılmış bir ölçekte ifade edilir. Bu yazıda EA testin uygulanması için ayrıntılı metodoloji ve mantık bildirilmektedir.

Introduction

Endotoksin olarak da bilinen Lipopolysaccharide (LPS), gram-negatif (GN) bakterilerin membran yapısının önemli bir bileşenidir. Hücre duvarının yaklaşık% 10 ' unda, dış membran bütünlüğü ve homeostaz için hayati önem taşımaktadır. Dahası, bu ev sahibi doğuştan gelen bağışıklık sistemi güçlü bir aktivatörü1,2.

LPS için doğuştan gelen bağışıklık sistemi hücrelerinin in vitro pozlama çoklu genler ifadesinde değişikliklere yol açar3. Sağlıklı insan Gönüllüleri çok küçük miktarlarda LPS yönetimi Akut sistemik inflamasyon Cascade tetikler, sepsis ve septik şok yüksek endotoksin konsantrasyonları ile ortaya çıkabilir4,5.

Sepsis hayat tehdit edici bir durumdur, Eğer hemen tanınmazsa, çoklu organ yetmezliği ve ölüme yol açabilir. Septik hastalar zamanında tedavi edilmelidir, agresif resüsitasyon ile, yeterli antibiyotik tedavisi, optimum kaynak kontrolü, ve hızlı organ destek stratejileri. Sepsis etiyolojisinin tanısı öncelikle klinik tanıma ve kültür bazlı patojen algılama6' ya dayanır. Bununla birlikte, mikrobiyal kültürlerin sonuçları 48 h 'ye kadar sürebilir ve7' ye kadar% 30 ' a kadar sonuçsuz olabilir. Erken teşhis ve müdahale daha iyi hasta sonuçlarına yol açabilir. Sepsis şüphelenilen hastalarda, kararlar genellikle fizyolojik ve biyokimyasal parametreler temelinde yapılır, endotoksemi net bir işareti olmadan.

Endotoksin aktivitesi (EA) ölçümü, tüm kandaki ticari bir tahlil ( malzeme tablosunabakın) yoluyla elde edilebilir. Hastalığın şiddetinin erken katmanlaştırılması için sistemik endotoksemi biyomarker olarak kullanılabilir, özellikle septik şok geliştirme riski olan hastalarda8. Tahlil, septik şok9olan hastalarda son zamanlarda yayınlanan çift kör randomize kontrollü klinik denemlerde Polymyxin B hemoperfüzyon tedavisine rehberlik etmek için kullanılmıştır. Kritik hasta hastalarda, MEDIC çalışması, birden fazla organ fonksiyon bozukluğu, yoğun bakım ünitesi (ıCU) konaklama süresi ve mortalite10ile ILIŞKILENDIRILECEK EA düzeylerini artırdı.

Endotoksini tespit etmek için farklı YAZIS geliştirilmiştir. Limulus Amoebocyte lysate (LAL) assay, bir jel-pıhtısı olarak, turbidimetrik, veya kromojenik test, şimdiye kadar en sık serum endotoksin tahmini için benimsenen olmuştur. Bu endotoksin, at nalı yengeç, Limulus Polyphemushemolymph koagülasyon neden yeteneği dayanmaktadır. Ancak, bu tahlil özgüllük açısından bazı sınırlamalar vardır. Özellikle, ayrıca endotoksin dışında Mikrobiyal Ürünler tarafından aktive edilebilir, mantar hücre duvar bileşenleri gibi, ve çeşitli insan Plazma proteinleri tarafından engellenmiş olabilir11.

Son on yıl içinde EA ölçümü gelişen endotoksemi biyomarker olarak geliştirilmiştir ve doğrulandı. LAL testi ile karşılaştırıldığında, EA daha hızlı ve klinik ortamda uygulanması daha kolaydır. Dahası, her ikisi de in vitro ve in vivo12, artan duyarlılık ve özgüllük ile, tüm kanda Lal daha doğru olduğu gösterilmiştir.

GN bakterilerinin sepsis nedensel ajanlar olarak hızlı tanımlanması için erken teşhis aracı olarak ilk uygulanmasına rağmen, EA seviyesi de hastalık şiddetinin biyomarker olarak incelenmiştir. Bu bağlamda, septik şok veya kardiyo sonrası tutuklanma sendromu13gibi devam eden kritik hastalık nedeniyle hipoperfüzyon durumunu değerlendirmek için özellikle yararlı olduğu gösterilmiştir. Daha yakın zamanda, hemofurasyon sistemlerinin gelişimi nedeniyle, olumlu bir EA sonucu da bu tür terapi için potansiyel adaylar doğru belirlemek için bir tarama aracı olarak önerilmiştir14. Son zamanlarda 107 yılında septik şok olan hastalarda EA 'nın erken yüksek düzeylerinin prevalansı ve klinik önemi hakkında gözlemsel retrospektif bir çalışma gerçekleştirdik. Diğer son sonuçlara göre, EA 'nın septik şok olan hastalarda hastalığın şiddetinin umut verici bir belirteci olduğunu bulduk15.

Bu yazının amacı, EA tahlil işlemini, baş ucunda ya da laboratuarda gerçekleştirme yöntemini tarif etmek ve septik şok temsili senaryosunda potansiyel kullanımını açıklamak. Bu teknik, bir anti-endotoksin antikor ve LPS kompleksler tarafından kendi astar aşağıdaki nötrofiller gelişmiş oksidatif patlama ölçerek LPS etkinliğini algılayabilir. Artmış solunum patlaması bir kemiluminometre ile tespit edilir ve yayılan ışık miktarı kan örneğinde endotoksin miktarına orantılı olarak kabul edilir. Tahlil birkaç reaktifler gerektirir, yaklaşık 30 dakika gerçekleştirmek için alır ve tüm kan 40 μL kadar az kullanır12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokol, insan biyoörneklerinin işlenmesi ile ilgili kurumsal yönergelere göre ve klinik laboratuvarımızın mevcut standart operatif prosedürlerini takiben gerçekleştirilir. Test edilen hastaların EA verilerinin ve klinik bilgilerinin kullanımı, kurumunuzun insan Araştırma Etik Komitesinin yönergelerini takip eder.

1. laboratuar ekipmanları ve tahlil kiti Içeriği

  1. EA setini kullanımda değilken 2 – 8 °C ' de saklayın.
  2. Her EA testi 5 farklı çeşit tüpten oluşur; her birini testin farklı bir bölümü için kullanın (bkz. Bölüm 2).
    1. Belirli bir antikor yokluğunda hastanın nötrofiller non-spesifik oksidatif patlama bazal etkinliğini ölçmek için tüp #1 ("kontrol" tüp) kullanın.
    2. LPS-Antibody kompleksine yanıt olarak oksidatif patlaması ölçmek için tüp #2 ("örnek" tüp) kullanın.
    3. Endotoksinin fazlasına yanıt olarak hastanın nötrofiller maksimal oksidatif patlaması ölçmek için tüp #3 ("Max" tüp) kullanın.
    4. Eksojen endotoksin kaynağı olarak tüp #4 ("LPS" tüpü) kullanın.
    5. Kan depolama için tüp #5 ("aliquot" tüp) kullanın.
      Not: Tüpler #1, #2 ve #3 kopyaları, test edilen her kan örneği için kullanılmak üzere toplam 8 tüp için sağlanır (EA reaktif şişesi ve kalite kontrol testi bir poşetin içerdiği tüm testler için kullanılabilir).
  3. EDTA antikoagülan içeren steril tüplerde hasta kan örneklerini toplayın. EA testini çalıştırmadan önce kan örneklerini oda sıcaklığında saklayın.
  4. Test başlamadan önce, kemiluminometre ve kuluçagör Shaker açın. 37 ° c sıcaklığına kadar ısıtıcıyı ısınır.
  5. İdeal olarak, kan koleksiyonundan 30 dakika içinde numuneyi işlemeye başlayın.

2. endotoksin aktivite tahlil

  1. Test etmeniz gereken her hastanın kan örneği için EA test tüplerini hazırlayın. Tüpleri tüp rafları içine koyun. Sonra kapakları çıkarın.
  2. Bir combipipette kullanarak, bir 1 mL hacim EA reaktiği şişe tüpler içine #1 (kontrol tüpü), #2 (örnek tüp) ve #3 (Max tüp), her biri yinelenen.
    Not: Çözeltinin geri sıçramasını önlemek için tüpün yan tarafındaki pipet.
  3. Hasta kan örneğini hafifçe 20 kez kan toplama tüpünün tersine çevirerek karıştırın. Sonra, pipet 0,5 mL hasta kanı tüp #4 (LPS maks tüp) ve tüp #5 (aliquot tüp). Vortex tüp 10 s için #4.
  4. Tüp rafları tüm EA test tüpleri ile inküvatör Shaker koyun. Kapağı kapatın ve 37 °C sıcaklıkta 10 dakika boyunca inküye yapın.
  5. Kapağı açın ve boru rafları kuluçlağının çalkalayıcı çıkarın. Vortex tüp #5 (aliquot tüp). Steril bir uç kullanarak, pipet 40 #1 ve #2, çoğaltır.
  6. Vortex tüp #4 (LPS tüp). Aynı Pipet ucunu kullanarak, boru #4 boru #3 (maks tüp), çoğaltır, pipet 40 μL kan.
  7. Altı final test tüpü Vortex (#1, #2, #3 ve ilgili kopyaları), sonra onları geri onların raflar içine yerleştirin.
    Not: Tüm tüpler aynı miktarda zaman için vortekslenir emin olun.
  8. Tüp raflar geri inkükülasyon shaker içine koymak ve kapağı kapatın. 100 RPM 'de inküden çalkalayıcı ayarlayın, sonra 14 dakika hareket başlatın.
  9. EA etiketli çip kartını kemiluminometreye takın ve Başlat 'a basın. 14 dakika kuluçdak sonra, doğru sırada EA tüpleri okumak için kemiluminometre görüntülenen talimatları izleyin.
  10. Her tüpü, kemiluminometrenin örnek tutucusuna yerleştirmeden önce 10 s için hafifçe yerleştirin. Örnek çekmeceyi açın ve örnek tutucuya tüp #1 yerleştirin. Ardından, örnek çekmeceyi kapatın ve bağıl ışık ünitesi (RLU) okuması için bekleyin.
  11. Tüp 2 ve Tüp 3 için 2,10 adımı yineleyin.
  12. Yinelenen Tüpler 1, 2 ve 3 için 2,10 adım yineleyin.
    Not: Adım 2.10 – 2.12 sırasında aynı miktarda zaman için tüm tüpler Vortex deneyin.
  13. Tüm tüpler işlendikten sonra, EA sonuçlarının otomatik olarak hesaplanacağını ve yazdırıldığını unutmayın. Seviyeleri EA birimleri olarak ifade edilir ve aynı örneklerden yinelenen belirleyici ortalama temsil eder.
  14. Test edilmesi gereken her kan örneği için 2,13 2,2 adımları yineleyin.
  15. Tahlil tamamlandıktan sonra, kalan test tüplerini ve EA reaktiflerini 30 güne kadar 2 – 8 °C ' de saklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

72 yaşındaki bir adam, akademik bir kentsel hastanenin acil servise (ED) kabul edildi. Birkaç gün önce onun birincil bakım Doktoru idrar üzerine yanma şikayet sundu. Oral fosfomiyisin kısa kurs tedavisi tavsiye edildi. Onun tıbbi geçmişi hipertansiyon, karmaşık olmayan tip-2 diyabet ve benign prostat hiperplazisi dahil. İlaçları enalapril, atorvastatin, tamsulosin ve metformin dahil.

ED 'de, uyanmış olduğunda karıştı. Sıcaklık 39,1 °C, kalp hızı dakikada 125 atım, kan basıncı 80/40 mmHg, solunum hızı 20/dak, SpO2 ise% 94, 4 L/min oksijen ile burun kanüden% 99 ' e yükseliyordu. Abdominal sınav normaldi, kötü lokalize hafif suprapubik hassasiyet dışında. Zorluk ile, bir Foley kateter yerleştirilir. Düşük miktarda koyu renkli pürülan idrar boşaltıldı.

Tam bir kan sayımı 18,5 x 103beyaz hücre sayısı ortaya çıktı. Kreatinin 2,7 mg/dl, glikoz 250 mg/dl, ve laktik asit seviyesi oldu 4,5 mmol/L. arteriyel kan gazı analizi, pH 7,23, PCO2 48 mmHg, Po2 88 mmHg ve HCO3- 15 mmol/l ile karışık asidoz saptandı.

Bir Merkezi venöz kateter, ultrason rehberlik, sağ internal juguler ven içine yerleştirilir. Kateter yerleşimi üzerine bir kan gazı analizi elde edildi ve% 63 ScVO2 değeri ortaya çıkarıldı. 30 dk. norephinephrine infüzyon ile 30 ml/kg kristaloid bolus infüzyon ile derhal agresif sıvı resüsitasyon başlatıldı. Hasta, muhtemelen idrar yolu enfeksiyonunun kaynaklanan septik şok tanısı ile yoğun bakım 'a transfer edildi.

Yoğun bakım alanında, mikrobiyal kültürlerin toplanması ve ampirik antibiyotik terapi yönetimi arasında EA testi için tam bir kan örneği elde edildi. Tahlil, burada sunulan protokole göre hızla gerçekleştirildi.

EA sonuçlarını hesaplamak için, kemiluminometre kayıtları: nötrofiller (L1) Bazal lüminesans; kan numunesi (L2) içinde LPS yanıt olarak nötrofiller aktivitesinin lüminesans; LPS (L3) büyük pozlama yanıt olarak maksimal nötrofil aktivite. Sonuç olarak ifade edilir: endotoksin aktivitesi (EA) = (L2-L1)/(L3-L1). Bu nedenle, elde edilen EA değeri, hastanın nötrofiller oksidatif patlama endotoksin dolaşım varlığı nedeniyle derecesini yansıtır (L2), bir yanıt olarak aynı kan örneğinde ölçülebilir ışıkesans en yüksek düzeyde normalleştirilmiş LPS (L3) ' ın maksimal konsantrasyonu. Her iki değer de numunenin bazal lüminesans (L1) için kontrol edilir.

Yaklaşık 30 dakika sonra, klinisyen 0,75 EA birimlerini hastanın endotoksin aktivite seviyesi olarak kabul etmiştir.

Bir EA değeri az 0,40 EA birimleri düşük bir endotoksin aktivite seviyesini gösterir, düşük dolaşım LPS konsantrasyonu eşit, şiddetli bir hastalık durumuna ilerleme riski düşük temsil eden. 0,40 arasındaki sonuçlar EA ve 0,59 EA üniteleri, şiddetli sepsis ve septik şok gelişimi için yüksek bir risk temsil eden bir ara endotoksin aktivite seviyesini gösterir. Sonuçlar eşit veya 0,60 ' den büyük EA üniteleri, septik şok ve yoksul hasta sonuçları için yüksek risk gösteren yüksek endotoksin aktivite seviyesini gösterir (Tablo 1).

Bu nedenle, GN bakterileri nedeniyle septik şok tanısı onaylandı. Hasta aynı zamanda, eşlik eden organ arızaları ve lakdamak seviyesinin kanıtı doğrultusunda son derece yüksek riskli olarak sınıflandırılır. Ayrıca agresif hacim resüsitasyon ve vazoaktif destek ile tedavi edildi. Polimixin-B hemopürofikasyon tedavisi, hastanın sıvılara ve Vazopresörlere ikna edici erken tepkisi nedeniyle henüz uygulanmamış olarak kabul edildi. 2. gün, Escherichia coli pozitif kan kültürleri yoluyla etken olarak doğrulandı. Uygun antibiyotik terapisi ile, hasta iyileşti, 7. gün yoğun bakım 'dan taburcu edildi. Yoğun bakım tahliyesinden önce ikinci bir EA testi yapıldı. 0,2 EA ünitelerinin bir sonucu olarak, septik şok tarafından tetiklenen biyokimyasal basamaklara tam çözünürlük gösterilmiştir.

Şekil 1 , septik şok hastalarının örnek bir popülasyonunda 24 saat IÇINDE ölçülen EA değerlerinin dağılımını gösterir.

Figure 1
Resim 1: eleştirel hastalar (n = 107) nüfusunda septik şok başlangıcından itibaren 24 saat Içinde ölçülen endotoksin AKTIVITESI (EA) düzeylerinin dağılımı. Bottiroli, ve al. izin15ile adapte. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

EA üniteleri Endotoksin aktivite seviyesi
< 0.40 Düşük
0,40 – 0,59 Ara
≥ 0,60 Yüksek

Tablo 1: endotoksin aktivite düzeylerinin kategorileri. EA = endotoksin aktivitesi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Septik şok halen günümüzde% 40 kadar yüksek bir mortalite ile ilişkilidir, ancak bu oran kabul edilen raporlara göre değişir16. Yeni ve daha iyi biyomarkerlere olan ihtiyaç, klinisyenler erken teşhis, daha iyi yönetim ve septik şok6olan hastaların prognostikasyonunda yardımcı olmak amacıyla alanlarda çoğu uzman tarafından savunulmuş.

Bir EA testi yapmak, önceki teknik bilgi veya sofistike laboratuvar ekipmanlarını gerektirmez ve herhangi bir sağlık kuruluşu bunu nasıl çalıştıracağınızı kolayca ve hızlı bir şekilde öğrenebilir. Yüksek dolaşan bir EA 'nın istem kimliği, hastanın riskini tabakalaşmaya yardımcı olabilir, daha önceki ve daha agresif bir terapötik yaklaşımı tetikler. Bunun tersi olarak, 0,40 EA birimlerinin az olduğu bir EA sonucu, Multi-org yetmezliği17' ye ilerlemenin düşük riskine işaret edebilir. Hastanın örneklerinin kendi kontrolü gibi kullanımı basittir, bu testi daha hassas ve endotoksemi gerçek kan seviyesinin daha doğru bir gösterimini yapar.

LPS-Antibody kompleksler ve hastanın kendi nötrofiller kullanımı, EA testini diğer faktörlerin (örn. Plazma proteinleri) muhtemelen etkisiz hale gelen bir şekilde korur. Aynı diğer test için, bir koagülasyon Cascade aktivasyonu gerektiren LAL testi gibi söylenir olamaz. LAL testi, endotoksin belirli bir reseptör ile bağlı değil, iyi gerçekleştirir, ancak plazma ve tam kan farklı proteinler bind LPS, tahlil ile müdahale. Dahası, mantar ürünler toynaklı pıhtılaşma basamakını tetikleyebilir ve test GN bakterileri için daha az spesifik hale gelebilir. Bu nedenle EA, endotoksemi18' in değerlendirilmesi için hala yaygın olarak BENIMSENEN Lal testine üstün gelmiştir.

Ancak, EA testinin güvenilir olması için, yukarıda belirtilen adımları titizlikle takip etmek çok önemlidir. Test edilen numunenin endotoksin seviyesi, referans değerleri olarak aynı kan örneği için bazal (tüp #1) ve maksimum (Tüp #3) yanıtlarını ölçme, zaman içinde kemiluminesans hesaplama ile hesaplanır. Bu nedenle, üç tüpü doğru düzende kemiluminometreye dikkatle yerleştirmek zorunludur.

Klinik uygulamada EA düzeylerinin kullanımı, potansiyel bir bulaşıcı hastalığın işleyişlerinde standart testleri (örn. laboratuar testleri ve kan kültürlerini) değiştirmemelidir. LPS açıkça GN bakteri membran ürünlerinin serbest bırakılması ile ilişkili olabilir rağmen, diğer ajanlar nedeniyle enfeksiyon durumunda yüksek endotoksemi düzeyleri de bildirilmiştir19. Endotoksemi bağırsak mukozası yoluyla bakterilerin translokasyon nedeniyle olabilir çok iyi bilinmektedir, özellikle doku hipoperfusion ve artmış gut bariyer geçirgenliği ortaya olasılığı20,21. Bu şartlar altında, sirkülasyon LPS, sepsis ve şok nedeni yerine, bir sonuç olarak beklemek mümkündür. Bu senaryoda, EA, bakteriyel etiyolojiden bağımsız olarak, devam eden doku hasarının şiddeti hakkında bilgi verebilir15. Bu ilkeyi destekleyen, son zamanlarda yapılan bir çalışmada Grimaldi ve ark. EA seviyelerinin yükselmesi, hastane dışı kardiyak arrest13' ün şiddeti ve şok süresi ile ilişkilendirilmesini buldu.

İlginçtir, Virzí ve al. Ayrıca endotoksin potansiyel rolünü vurgulandı (ve onun izleme) Tip 5 Kardiyorenal sendromu olan hastalarda, farklı sistemik bozukluklar ayarında eşlik eden kardiyak ve böbrek disfonksiyon ile karakterize bir durum , sepsis23 gibi. Endotoksin, kardiyak miyositlerin bozulmasına neden olduğu bilinmektedir, ancak tam patofizyolojik mekanizma büyük ölçüde belirsiz. Öte yandan, endotoksisite yerel ve sistemik yaralanmanın çeşitli yolları nedeniyle böbrek fonksiyon bozukluğu neden olduğu gösterilmiştir, böbrek kan akımı bozuklukları neden, glomerüler filtrasyon hızı, ve tübüler fonksiyon22.

Ancak, EA 'nın birkaç kısıtlaması vurgulanmalıdır. EA sonucu devam eden bir antibiyotik tedavisinin etkisi şu anda iyi kurulmadı24. Ayrıca, kanıtlar, kritik hasta hastalarda tek noktalı erken EA ölçümü, yararlı iken, güvenli bir şekilde septik şok mortalite tahmin etmez, bile 0,6 birimleri15daha büyük olduğunu göstermektedir. Sayısı ve zamanlaması Şu anda belirsiz olmasına rağmen seri tekrarlanan değerlendirmeler gerekebilir. Diğer yazarlar endotoksemi dalgalanmaları üzerinde duruldu, bir artan günlük değişkenlik çok organ disfonksiyon daha yüksek bir derece ile ilişkili olabilir varsayımda25. Son olarak, kabul edilecek ek bir teknik sınırlama, endotoksin aktivitesinin ölçüldüğü göreli ölçek (0 ila 1 adet, 0,01 minimum algılanabilir artışlarla). Bu son derece yüksek sonuçlar kaçınılmaz olarak maksimum seviye etrafında Plato yapar, böylece hastaların bu alt grubunda farklılaşmaları yapmak (EA > 0,9 birimleri) araştırmak daha zor.

Sonuç olarak, endotoksin düzeylerinin klinik sonuçlarla izlenmesinde potansiyel etkisini değerlendirmek için daha fazla çalışmada ihtiyaç duyulurken, EA Şu anda hızlı, basit ve hassas bir test olarak kullanılabilir, bu da yoğun bakım sürecinin karar verme sürecini kolaylaştırabilir. kritik hasta septik hastalarda klinisyenler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Estor SpA, derginin yayın ve video üretim ücretinin maliyetini ele aldı. Yazarlar, ifşa etmek için ilgi çatışması yok.

Acknowledgments

Biz Paolo Braganò ve Lisa Mathiasen, Ph.D. tahlil protokol metodolojisi gözden geçirilmesi için teşekkür ederiz. Dario Winterton, MD Ingilizce dil yeterlilik için el yazması gözden önemli yardım sağladı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EAA kit Spectral Medical Inc. EAAST-20 Package with 20 tests + 1 quality control
Smart Line TL Berthold EAASL Luminometer
Incubator shaker GRANT ES-20 Mini-incubator shaker
Vortexer VWR 444-2790 Vortex instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nature Reviews Immunology. 4, (7), 499-511 (2004).
  2. Takeda, K. Evolution and integration of innate immune recognition systems: the Toll-like receptors. Journal of Endotoxin Research. 11, (1), 51-55 (2005).
  3. Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11, (1), 19-22 (1999).
  4. Natanson, C., et al. Endotoxin and tumor necrosis factor challenges in dogs simulate the cardiovascular profile of human septic shock. The Journal of Experimental Medicine. 169, (3), 823-832 (1989).
  5. Suffredini, A. F., et al. The cardiovascular response of normal humans to the administration of endotoxin. The New England Journal of Medicine. 321, (5), 280-287 (1989).
  6. Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA: The Journal of the American Medical Association. 315, (8), 801-810 (2016).
  7. Gupta, S., et al. Culture-Negative Severe Sepsis: Nationwide Trends and Outcomes. Chest. 150, (6), 1251-1259 (2016).
  8. Ikeda, T., Ikeda, K., Suda, S., Ueno, T. Usefulness of the endotoxin activity assay as a biomarker to assess the severity of endotoxemia in critically ill patients. Innate Immunity. 20, (8), 881-887 (2014).
  9. Dellinger, R. P., et al. Effect of Targeted Polymyxin B Hemoperfusion on 28-Day Mortality in Patients With Septic Shock and Elevated Endotoxin Level. The EUPHRATES Randomized Clinical Trial. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 320, (14), 1455-1463 (2018).
  10. Marshall, J. C., et al. Diagnostic and prognostic implications of endotoxemia in critical illness: results of the MEDIC study. The Journal of Infectious Diseases. 190, (3), 527-534 (2004).
  11. Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica. 19, (1), 186-197 (1968).
  12. Marshall, J. C., et al. Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence. Critical Care. 6, (4), London, England. 342-348 (2002).
  13. Grimaldi, D., et al. High Level of Endotoxemia Following Out-of-Hospital Cardiac Arrest Is Associated With Severity and Duration of Postcardiac Arrest Shock. Critical Care Medicine. 43, (12), 2597-2604 (2015).
  14. Klein, D. J., et al. The EUPHRATES trial (Evaluating the Use of Polymyxin B Hemoperfusion in a Randomized controlled trial of Adults Treated for Endotoxemia and Septic shock): study protocol for a randomized controlled trial. Trials. 15, 218 (2014).
  15. Bottiroli, M., et al. Prevalence and clinical significance of early high Endotoxin Activity in septic shock: An observational study. Journal of Critical Care. 41, 124-129 (2017).
  16. Kaukonen, K. M., Bailey, M., Suzuki, S., Pilcher, D., Bellomo, R. Mortality related to severe sepsis and septic shock among critically ill patients in Australia and New Zealand. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311, (13), 1308-1316 (2014).
  17. Biagioni, E., et al. Endotoxin activity levels as a prediction tool for risk of deterioration in patients with sepsis not admitted to the intensive care unit: a pilot observational study. Journal of Critical Care. 28, (5), 612-617 (2013).
  18. Roth, R. I., Levin, F. C., Levin, J. Optimization of detection of bacterial endotoxin in plasma with the Limulus test. The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 116, (2), 153-161 (1990).
  19. Yaguchi, A., Yuzawa, J., Klein, D. J., Takeda, M., Harada, T. Combining intermediate levels of the Endotoxin Activity Assay (EA) with other biomarkers in the assessment of patients with sepsis: results of an observational study. Critical Care. 16, (3), London, England. (2012).
  20. Earley, Z. M., et al. Burn Injury Alters the Intestinal Microbiome and Increases Gut Permeability and Bacterial Translocation. PLoS One. 10, (7), (2015).
  21. Munster, A. M., Smith-Meek, M., Dickerson, C., Translocation Winchurch, R. A. Incidental phenomenon or true pathology? Annals of Surgery. 218, (3), 321 (1993).
  22. Clementi, A., Virzì, G. M., Brocca, A., Ronco, C. The Role of Endotoxin in the Setting of Cardiorenal Syndrome Type 5. Cardiorenal Medicine. 7, (4), 276-283 (2017).
  23. Virzì, G. M., et al. Cardiorenal Syndrome Type 5 in Sepsis: Role of Endotoxin. in Cell Death Pathways and Inflammation. Kidney and Blood Pressure Research. 41, (6), 1008-1015 (2016).
  24. Mignon, F., Piagnerelli, M., Van Nuffelen, M., Vincent, J. L. Effect of empiric antibiotic treatment on plasma endotoxin activity in septic patients. Infection. 42, (3), 521-528 (2014).
  25. Klein, D. J., et al. Daily variation in endotoxin levels is associated with increased organ failure in critically ill patients. Shock. 28, (5), 524-529 (2007).
Eleştirel hasta hastalarda tam kan endotoksemi tespiti için endotoksin aktivite assay
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Pinciroli, R., Checchi, S., Bottiroli, M., Monti, G., Casella, G., Fumagalli, R. Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients. J. Vis. Exp. (148), e58507, doi:10.3791/58507 (2019).More

Pinciroli, R., Checchi, S., Bottiroli, M., Monti, G., Casella, G., Fumagalli, R. Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients. J. Vis. Exp. (148), e58507, doi:10.3791/58507 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter