Summary
In questo protocollo, vengono descritti metodi per lo svolgimento di consanguineità croci e per valutare il successo di quelle croci, per la formica Vollenhovia emeryi. Questi protocolli sono importanti per esperimenti volti a comprendere le basi genetiche dei sistemi di determinazione del sesso in imenotteri.
Abstract
Le componenti genetiche e molecolari della cascata della determinazione del sesso sono stati studiati estesamente nell'ape da miele, mellifera di Apis, un organismo di modello dell'ordine dei Hymenoptera. Tuttavia, piccolo è conosciuto circa i meccanismi di determinazione del sesso trovati altri taxa dell'ordine dei Hymenoptera non-modello, quali le formiche. A causa della natura complessa dei cicli di vita che si sono evoluti in specie dell'ordine dei Hymenoptera, è difficile da mantenere e condurre incroci sperimentali tra questi organismi in laboratorio. Qui, descriviamo i metodi per lo svolgimento di consanguineità croci e per valutare il successo di quelle croci in formica Vollenhovia emeryi. Indurre la consanguineità in laboratorio utilizzando V. emeryi, è relativamente semplice a causa della biologia unica della specie. In particolare, questa specie produce androgenetica maschi e femminile coevoluzione polimorfismo di ala, che semplifica l'identificazione dei fenotipi in incroci genetici per mostre. Inoltre, valutare il successo di consanguineità è semplice come i maschi possono essere prodotte continuamente di consanguineità croci, mentre maschi normali appaiono solo durante la stagione riproduttiva ben definita nel campo. Il nostro protocollo consentono utilizzando V. emeryi come un modello per studiare la base genetica e molecolare del sistema di determinazione del sesso nella specie di formiche.
Introduction
Taxa eusociali artropodi, come le formiche e le API, hanno evoluto un sistema di sesso-determinazione di haplodiploid in cui gli individui che sono eterozigoti alla determinazione del sesso complementare uno o più loci (CSD) diventano femmine, mentre quelli che sono omo - o hemizygous diventare maschi (Figura 1A)1.
Componenti genetiche e molecolari coinvolti nella cascata di determinazione del sesso sono state ben studiate nell'ape da miele, mellifera di Apis, un modello dell'ordine dei Hymenoptera organismo2,3,4. Genomica comparativa le indagini recenti suggeriscono che le formiche e le API da miele condividono molti presunti omologhi nella via di determinazione del sesso, come ad esempio il gene di determinazione del sesso iniziale, csd5. Tuttavia, la prova per la conservazione funzionale di questi omologhi di manca ancora in formiche.
Per risolvere questo problema, linee di consanguineità devono essere sviluppate come essi sono essenziali per la mappatura genetica e gli studi molecolari. Tuttavia, è difficile da mantenere e condurre incroci sperimentali tra questi organismi in laboratorio a causa della natura complessa dei cicli di vita che si sono evoluti.
Qui, usiamo Vollenhovia emeryi come modello per studiare le basi genetiche e molecolari del sistema di determinazione del sesso in formiche6,7. Le linee di consanguineità di questa specie sono state sviluppate in precedenza per il mapping del sollevatore di loci di carattere ereditario quantitativo (QTL) per tratti relazionati alla determinazione del sesso per la prima volta in formiche6. Inoltre, la cascata molecolare di determinazione del sesso è stato indagato7. Questa specie si è evoluto un sistema di riproduzione insolita che impiega sia gynogenesis e androgenesis (Figura 1B)8,9. La maggior parte delle nuove regine e i maschi sono clonally prodotte dai genomi materni e paterni, rispettivamente. Inoltre, i lavoratori e alcune regine sono prodotti sessualmente8. Questo sistema di riproduzione è particolarmente adatto per studi genetici, perché le croci di consanguineità prodotte utilizzando sessualmente produssero regine ed i maschi sono geneticamente equivalenti a un reincrocio classico. Dato che sessualmente prodotte regine differiscono morfologicamente da queens prodotta da genomi materno10 (Figura 1B), lo svolgimento e la valutazione di consanguineità croci è notevolmente semplificata utilizzando questo metodo.
In questo articolo, i metodi per la creazione di colonie di laboratorio per test di attraversamento, applicazione di consanguineità attraversa utilizzando coppie di pieno-sib e valutare il successo di quelle traverse mediante genotipizzazione dei membri della Colonia e la dissezione della prole maschio gli organi genitali sono descritti in V. emeryi.
Indipendentemente dal sistema di riproduzione impiegato, applicazione di consanguineità croci è spesso il primo passo essenziale in qualsiasi indagine di sistemi di determinazione del sesso negli imenotteri. Ad esempio in Cardiocondyla obscurior, la quasi completa assenza di maschi diploidi dopo 10 generazioni di pieno-sib accoppiamento in laboratorio dimostra assenza di CSD locus11. È possibile prevedere il numero di loci CSD dal rapporto tra maschi prodotta in consanguineità croci6,12,13.
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Protocol
1. raccolta e manutenzione delle colonie di V. Emeryi nel laboratorio di campo
Nota: Nidi di V. emeryi si trovano in putrefazione decadente caduti foreste secondarie branchesin albero in tutto il Giappone e registri. Questa specie presenta due tipi di colonie, vale a dire, (1) colonie producendo solo regine dalle ali lunghe e (2) le colonie producono principalmente breve-alato regine oltre al piccolo numero di regine dalle ali lunghe8,14. In questo protocollo, abbiamo raccolto quest'ultimo tipo di colonie nella Prefettura di Ishikawa, Giappone.
- Raccogliere V. emeryi colonie durante l'inizio dell'estate.
Nota: Per ottenere un numero sufficiente di individui sessuali durante la stagione riproduttiva, le colonie che contengono più di 300 individui sono preferite. - Trasferire gli esemplari di formica dai rami raccolti per un nido di gesso artificiale con una copertura di vetro utilizzando un aspiratore (Figura 2, sinistra).
- Mantenere colonie nel nido artificiale a 25 ° C in un ciclo di luce/buio di 16:8 h. Fornire l'acqua del rubinetto con una spruzzetta per bagnare l'intonaco.
- Aggiungere circa 100 mg di polvere secca Grillo avvolta in carta stagnola e una punta di acqua zucchero di canna (20 µ l punta) ogni altro giorno fino a quando emergono nuove coevoluzione (F1 alato-regine e F1 maschi).
2. sperimentale laboratorio croci
Nota: Nuovi coevoluzione iniziano ad emergere dalla tarda estate all'autunno (Figura 3). Long-alato regine sono prodotte sessualmente, e breve-alato regine sono prodotti clonally ed hanno il genoma materno (Figura 1). Utilizzare lungo-alato regine e maschi per consanguineità croci.
- Per fermare le persone da spostare, inserire colonie in camera un ambiente costante a 4 ° C per 15 min.
- Rimuovere la metà gambe di 30 lavoratori utilizzando pinze sotto un microscopio stereoscopico e trasferirli nel nuovo nido intonaco più piccolo (Figura 2, destra) per consanguineità croci.
Nota: Le gambe vengono rimossi per distinguere i lavoratori presenti da parte dei lavoratori che saranno prodotte dalle croci successivi incroci. - Aggiungere 3-4 larve o pupe in un nido di gesso contenente i lavoratori.
Nota: I lavoratori mostrano attività esplorativa della colonia di regine-meno di0 F. Larve o pupe possono efficacemente attrarre questi lavoratori e coevoluzione di nuovi al centro della Colonia durante test di incrocio. Di conseguenza, conservare le condizioni della Colonia sperimentale vicino alla colonia normale. - Trasferire una regina dalle ali lunghe e un uomo in un nido di gesso preparato nel passaggio 2.3 per consanguineità croci.
- Mantenere colonie a 25 ° C in un ciclo luce/buio 16:8 h con cibo e acqua fornita come descritto al punto 1.3 fino a quando la Regina perde le sue ali e deporre le uova.
Nota: Questo richiede una settimana a un mese. - Verificare la Colonia sperimentale ogni giorno sotto un microscopio stereoscopico. Dopo esecuzione di consanguineità attraversa tra la prole di1 F, uova possono essere osservate sotto un microscopio stereoscopico.
- Dopo la F1 Regina inizia a deporre le uova, togliere i maschi di F1 e larve o pupe aggiunti nel passaggio 2.3 dal nido per evitare il mescolamento della generazione1 F (maschi e femmine utilizzate per consanguineità croci) e la generazione di2 F (prole prodotto da incroci di consanguineità).
Nota: Se ci sono pochi maschi nella Colonia, è possibile indurre consanguineità croci utilizzando un maschio e 1-3 queens nella stessa colonia sperimentale. - Mantenere colonie sotto il conditionsas stesso descritto al punto 1.3, fino a quando emergono prole2 F.
Nota: Trasferimento F1 Regina e prole2 F in nuovo nido intonaco più grande (Figura 2, sinistra) per la conservazione a lungo termine di Colonia.
3. valutazione del successo di Inbreeding
- Estrazione del DNA e la genotipizzazione della generazione parentale (F0)
- Rimuovere una gamba di una regina di0 F usando il forcipe e trasferire la gamba in una microprovetta 1,5 mL contenente 100 µ l di agente di chelazione.
- Microscopio stereoscopico, sezionare un addome femminile in piatto di vetro riempito con 300 µ l di acqua ultrapura usando il forcipe e isolare la spermateca contenenti lo sperma dai maschi accoppiati.
- Togliere il tessuto della spermateca e isolare lo sperma dal tessuto della femmina mediante spilli entomologici.
Nota: Per facilitare l'estrazione dello sperma dalla spermateca, conservare esemplari femminili in 100% EtOH per più di un giorno prima della dissezione. - Usando una micropipetta, trasferire lo sperma in una microprovetta 1,5 mL contenente 100 µ l di agente di chelazione.
- Incubare i campioni della Regina0 F e spermatozoi preparati al punto 3.1.1 e 3.1.3, rispettivamente, a 95 ° C per 20 min. Flash Centrifugare la provetta e conservare a 4 ° C.
- Genotipo tutti i campioni usando il metodo descritto altrove4.
- Estrazione del DNA dalla coppia di formiche utilizzate per consanguineità Croci (F1)
- Dopo conferma la produzione di uova da sib accoppiato Regina1 F, è possibile estrarre il DNA della Regina usando le sue ali di capannone o una metà gamba e genotipo con stesso metodo descritto nella sezione 3.1 sopra.
- Estrarre il DNA di F1 maschio utilizzando una gamba e genotipo li utilizzando stesso metodo descritto nella sezione 3.1 sopra.
Nota: I campioni possono essere conservati in 100% EtOH prima dell'estrazione del DNA e DNA nell'agente di chelazione può essere conservato per due mesi a 4 ° C.
- Valutazione della fertilità maschile nei maschi prodotta da consanguineità croci
Nota: I maschi diploidi prodotti da incroci di consanguineità sono spesso sterili.- La dissezione interni organi riproduttivi in un piatto di vetro con 400 µ l di soluzione di PBS usando il forcipe.
- Rimuovere PBS e aggiungere 4% paraformaldeide (PFA) utilizzando una micropipetta.
- Difficoltà il tessuto incubando in PFA per 30 min a temperatura ambiente (15-25 ° C).
- Lavare il tessuto 5 volte con 400 µ l di PBS utilizzando una micropipetta.
- Diluire la soluzione (DAPI) 6-diamidino-2-phenylindole a 1 µ g/mL in PBS, 4'.
- Rimuovere PBS e aggiungere circa 300 µ l di questa soluzione diluita di colorazione DAPI al tessuto.
- Incubare per 15 minuti sotto condizione di buio a temperatura ambiente (15-25 ° C).
- Lavare il tessuto 5 volte con 400 µ l di PBS e trasferimento del tessuto sul centro di vetro diapositiva usando il forcipe.
- Montare del tessuto sul montaggio Media contenente falloidina TRITC tetrametilrodamina-coniugati.
- Osservare i campioni utilizzando 20x o 63 X lenti dell'obiettivo del microscopio a scansione confocale del laser.
- È possibile utilizzare un laser di eccitazione 405 nm e un rivelatore ibrido a 410-530 nm per il rilevamento di DAPI.
- È possibile utilizzare un laser di eccitazione 561 nm e un rivelatore ibrido a 565-650 nm per il rilevamento di TRITC.
- Utilizzare una velocità di scansione di 400 Hz (400 linee/s) a una risoluzione a 1024 × 1024 pixel.
- Catturare immagini utilizzando una piattaforma software.
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Representative Results
Analisi del microsatellite utilizzando F0 e F1 generazioni è emerso che la consanguineità croci sono state prodotte con successo (Figura 4)6. Come risultato di consanguineità croci, regine accoppiate sono state ottenute entro un mese di stabilire colonie incrocio sperimentale. Un quarto (27,1 ± 8,91% SD) di tutta la prole (F2) dalle croci di consanguineità era maschio, mentre il resto era donna (lavoratori e una regina)6. La mappatura QTL utilizzando la prole da consanguineità croci ha dimostrato che maschi prodotti da consanguineità croci erano diploidi e omozigotica alle due CSD loci (CSD1 e CSD2 nella Figura 5), mentre le femmine (lavoratori) prodotte da consanguineità croci erano diploidi e eterozigoti a almeno a un CSD locus6.
Dissezione di maschi aploidi ha rivelato testicoli e lo sperma, come previsto (Figura 6A-6C). Tuttavia, nei maschi diploidi, gli spermatozoi sono stati mai osservati, suggerendo che i maschi prodotti in consanguineità croci sono sterili in V. emeryi6. Inoltre, i testicoli dei maschi diploidi non riuscirono a sviluppare (Figura 6-6E).
Figura 1 . Tipico sistema riproduttivo in (A) degli imenotteri ed il sistema riproduttivo atipico che coinvolge androgenesis e gynogenesis in (B) V. emeryi. In genere, le femmine (lavoratori e queens) si sviluppano da uova fecondate diploide, e i maschi sviluppano da uova non fertilizzate aploide, che contiene la metà del genoma materno (A). In V. emeryi, lavoratori sterili e qualche long-alato regine (LWO) si sviluppano da uova fecondate diploide, mentre breve-alato regine (SWQ) sviluppano con genomi materni quasi completi da uova non fecondate diploide (gynogenesis). I maschi non ereditano mai genomi materni ma sono cloni dei loro padri (androgenesis) (B). Questa figura è stata modificata da [Miyakawa et al 2018]7. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Sperimentale messa a punto di colonie di V. emeryi . Dopo la raccolta di campi, colonie sono trasferiti in un nido artificiale intonaco e tenute in laboratorio. Un nido di gesso grande (a sinistra) è preparato per mantenere colonie raccolti, considerando che un più piccolo nido di gesso (a destra) è preparato per consanguineità sperimentale croci. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Nuovo V. emeryi coevoluzione emergono durante la stagione riproduttiva. Maturo e ben-fedcolonies tendono a produrre regine long-alato (LWO) con il genoma parentale oltre a breve-alato regine (SWQ) che portano solo il genoma materno (Figura 1B). Foto per gentile concessione di Mr. Taku Shimada. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Progettazione di consanguineità croci e genotipi del microsatellite F0 e generazioni1 F. Con 11 marcatori microsatellite sviluppate in precedenti studi6,8,9, femmine e maschi della generazione parentale (F0) ha mostrato diversi genotipi. I genotipi di femmine e maschi utilizzati per gli incroci sperimentali (F1) ereditato i genotipi parentali e paterni, rispettivamente, che indica che le femmine sono state attraversate con successo con i loro fratelli, con cui le femmine condiviso metà loro genomi. I numeri indicano le lunghezze dei prodotti PCR del microsatellite locus L-5, che è uno degli indicatori utilizzati per la genotipizzazione6,8,9,10. Questa figura è stata illustrata in base ai dati da [Miyakawa e Mikheyev 2015]6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Modelli di allele due loci di CSD (CSD1 e CSD2) nella prole prodotta da consanguineità croci. Percentuale di maschi diploidi (25% circa) e la mappatura QTL utilizzando prole prodotta da sib-accoppiato queens suggeriscono l'esistenza di due loci CSD in V. emeryi. Le femmine sono eterozigoti in almeno uno dei due loci CSD, mentre i maschi sono omozigoti a tutti i loci. Genotipi sono rappresentati da lettere dell'alfabeto. Questa figura è stata modificata da [Miyakawa et al 2018]7. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 . Organi riproduttivi interni maschili di androgenetica maschi aploidi e diploidi in V. emeryi. Morfologie dei testicoli e altri organi riproduttivi interni dissecato fuori dai maschi aploidi androgenetica (A). Sperma (tessuto fibroso) potrebbe essere visto in testicoli dei maschi aploidi (B e C). Colore blu segna i nuclei macchiati di DAPI e contrassegni di colore rosso-F-actina macchiato da falloidina TRITC tetrametilrodamina-coniugati in B, C ed E. (a) ghiandole accessorie; (t) testicoli; (v) vaso deferente; (g) gli organi genitali esterni. Morfologie degli organi riproduttivi interni dissecato fuori dai maschi diploidi (D). Testicoli e lo sperma dei maschi diploidi sono stati mai osservato (D ed E, N >> 30). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo articolo viene illustrato protocolli che possono essere utilizzati per indurre la consanguineità croci e valutare l'avvenimento di inincroci avvenuti nella formica V. emeryi. Negli esperimenti, genotipizzazione degli individui utilizzati per gli incroci è necessaria garantire che la consanguineità Croci hanno avuto successo. Tuttavia, l'efficacia di questi test di incrocio è chiaramente evidente come maschi diploidi possono essere prodotta durante tutto l'anno, mentre i maschi aploidi possono essere prodotto solo in autunno sia il campo e il laboratorio6. Sib-accoppiato regine iniziano a produrre prole maschio subito dopo l'incrocio. Sono state osservate differenze fenotipiche morfologiche tra i maschi aploidi e diploidi in V. emeryi6,7. Tuttavia, diploide maschio V. emeryi quasi invariabilmente non riescono a sviluppare i testicoli. In assenza di marcatori genetici per il test il relatedness genetico di coppie utilizzate per l'attraversamento di test, il potenziale riproduttivo della prole maschio può essere utilizzato per dedurre se si è verificato consanguineità. Tuttavia, dovrebbe essere notato che i maschi prodotti in consanguineità croci non sono sempre sterili in altre specie dell'ordine dei Hymenoptera15,16,17.
Il primo passo fondamentale nel successo del protocollo è il mantenimento delle colonie ben nutriti, come nutrirli dopo la raccolta di campi aumenterà la probabilità di ottenere un numero sufficiente di coevoluzione per croci. In V. emeryi, è stata segnalata una correlazione positiva tra la nutrizione e la produzione di regine dalle ali lunghe, che sono le regine utilizzate per la consanguineità croci10. In insetti sociali, piccole colonie o colonie in cattiva salute, tendono a non produrre nuovi coevoluzione18. È pertanto importante raccogliere maturi colonie dal campo e di fornire loro adeguate quantità di cibo nutriente per esperimenti utilizzando nuove coevoluzione.
Il secondo passaggio critico è di mantenere i lavoratori, riproduttiva e poche larve o pupe insieme durante le prove di attraversamento e di mantenere la colonia di incrocio sperimentale presso lo stesso stato come quello di una colonia normale fino a incrocio è completato (per una settimana a un mese). È difficile mantenere colonie che devono essere utilizzati per l'attraversamento di test senza lavoratori per più di 3 giorni perché i maschi non sono in grado di alimentarsi da soli e devono essere alimentati dai lavoratori. In tali condizioni innaturali, il tasso di successo di consanguineità croci era estremamente basso6.
Ci sono due limitazioni per quanto riguarda l'applicazione di questi protocolli per altre specie di formica. In primo luogo, gli spunti per l'induzione di croci sono specie-specifici. È relativamente facile per indurre laboratorio croci in V. emeryi dal intra-Colonia accoppiamento senza volo si verifica in natura. Tuttavia, molte specie di formiche sono evoluti rituali di accoppiamento che coinvolgono i voli nuziali durante il quale nuovo compagno di regine e maschi durante o dopo il volo19. È pertanto importante delucidare i trigger che inducono la traversata in ogni specie in un ambiente di laboratorio. Ad esempio, nella formica parassita Acromyrmex ameliae, lo stimolo principale per l'attivazione di voli nuziali sembra essere luce20. La seconda limitazione è, in alcuni casi, i maschi diploidi prodotti da consanguineità croci non possono essere raccolti come sono inviable o uccisi dagli operai, perché essi non funzionano e/o non hanno o basso potenziale riproduttivo, e quindi sono un costo importante per la Colonia della specie obiettivo21,22,23. Fortunatamente, diploide V. emeryi maschi non vengono uccisi dai lavoratori e vivono fino a quando non muoiono naturalmente, che suggerisce che non si sono incontrati frequentemente in natura e una strategia per escludere i maschi diploidi dalle colonie non si è evoluta in questa specie.
Rispetto ad altre specie di formiche che impiegano arrhenotokous partenogenesi per riprodurre (Figura 1A), possiamo supporre che ci sono alcuni vantaggi per la produzione di croci di consanguineità sperimentale utilizzando V. emeryi di androgenesis come la Croci di consanguineità sono geneticamente equivalenti a un reincrocio classico. Infatti, il sistema ci ha permesso di progettare esperimenti per studiare i geni di determinazione del sesso, meccanismi molecolari ed eseguire studi funzionali in questa specie6,7.
In sintesi, metodi per condurre la consanguineità attraversa e per valutare il successo della risultante croci sono state descritte in V. emeryi. Questi protocolli sono essenziali per gli esperimenti direzionati a comprendere le basi genetiche e molecolari di sistemi di determinazione del sesso negli imenotteri.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il signor Taku Shimada, il delegato di AntRoom, Tokyo, Giappone, per averci fornito una sua fotografia di V. emeryi coevoluzione. Questo progetto è stato finanziato dalla società Giappone per la promozione della scienza (JSPS) Research Fellowship per giovani scienziati (16J00011) e concessione degli aiuti per giovani scienziati (B)(16K18626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plaster powder | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Charcoal, Activated, Powder | Wako | 033-02117,037-02115 | |
| Slide glass | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Dry Cricket diet | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Brown shuger | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Styrene Square-Shaped Case | AS ONE | Any size | Size varies by number of ants |
| Incbator | Any brand can be used | ||
| Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1B | TAITEC | 0014035-000 | |
| 1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottom | WATSON | 131-715CS | |
| Ethanol (99.5) | Wako | 054-07225 | |
| Stereoscopic microscope | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Forseps | DUMONT | 0108-5-PO | |
| Chelex 100 sodium form | SIGMA | 11139-85-8 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| -Cellstain- DAPI solution | Dojindo Molecular Technologies | D523 | |
| ABI 3100xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8 | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica HyDTM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Directly contact the constructor formore informations. |
References
- Mable, B. K., Otto, S. P. The evolution of life cycles with haploid and diploid phases. BioEssays. 20 (6), 453-462 (1998).
- Beye, M., Hasselmann, M., Fondrk, M. K., Page, R. E., Omholt, S. W. The gene csd is the primary signal for sexual development in the honeybee and encodes an SR-type protein. Cell. 114 (4), 419-429 (2003).
- Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454 (7203), 519-522 (2008).
- Nissen, I., Müller, M., Beye, M. The Am-tra2 gene is an essential regulator of female splice regulation at two levels of the sex determination hierarchy of the honeybee. Genetics. 192 (3), 1015-1026 (2012).
- Schmieder, S., Colinet, D., Poirié, M. Tracing back the nascence of a new sex-determination pathway to the ancestor of bees and ants. Nature Communications. 3, 895 (2012).
- Miyakawa, M. O., Mikheyev, A. S. QTL Mapping of Sex Determination Loci Supports an Ancient Pathway in Ants and Honey Bees. PLoS Genetics. 11 (11), (2015).
- Miyakawa, M. O., Tsuchida, K., Miyakawa, H. The doublesex gene integrates multi-locus complementary sex determination signals in the Japanese ant, Vollenhovia emeryi. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 94, 42-49 (2018).
- Ohkawara, K., Nakayama, M., Satoh, A., Trindl, A., Heinze, J. Clonal reproduction and genetic caste differences in a queen-polymorphic ant, Vollenhovia emeryi. Biology letters. 2 (3), 359-363 (2006).
- Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. Clonal reproduction by males of the ant Vollenhovia emeryi (Wheeler). Entomological Science. 11 (2), 167-172 (2008).
- Okamoto, M., Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. Sexual and asexual reproduction of queens in a myrmicine ant, Vollenhovia emeryi (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecological News. 21, 13-17 (2015).
- Schrempf, A., Aron, S., Heinze, J. Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating. Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).
- De Boer, J. G., Ode, P. J., Rendahl, A. K., Vet, L. E. M., Whitfield, J. B., Heimpel, G. E. Experimental support for Multiple-locus complementary sex determination in the parasitoid Cotesia vestalis. Genetics. 180 (3), 1525-1535 (2008).
- Paladino, L. C., et al. Complementary sex determination in the parasitic wasp Diachasmimorpha longicaudata. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. No gene flow between wing forms and clonal reproduction by males in the long-winged form of the ant Vollenhovia emeryi. Insectes Sociaux. 58 (2), 163-168 (2011).
- Cowan, D. P., Stahlhut, J. K. Functionally reproductive diploid and haploid males in an inbreeding hymenopteran with complementary sex determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (28), 10374-10379 (2004).
- Armitage, S., Boomsma, J., Baer, B. Diploid male production in a leaf-cutting ant. Ecological Entomology. 35 (2), 175-182 (2010).
- Krieger, M. J. B., Ross, K. G., Chang, C. W. Y., Keller, L. Frequency and origin of triploidy in the fire ant Solenopsis invicta. Heredity. 82, February 1998 142-150 (1999).
- Seeley, T. D., Mikheyev, A. S. Reproductive decisions by honey bee colonies: Tuning investment in male production in relation to success in energy acquisition. Insectes Sociaux. 50 (2), 134-138 (2003).
- Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Harvard University Press. http://www.amazon.co.uk/Ants-Bert-H?lldobler/dp/3540520929 (1990).
- da Souza, D. J., Marques Ramos Ribeiro, M., Mello, A., Lino-Neto, J., Cotta Dângelo, R. A., Della Lucia, T. M. C. A laboratory observation of nuptial flight and mating behaviour of the parasite ant Acromyrmex ameliae (Hymenoptera: Formicidae). Italian Journal of Zoology. 78 (3), 405-408 (2011).
- Woyke, J. What happens to diploid drone larvae in a honeybee colony. Journal of Apicultural Research. 2 (2), 73-75 (1963).
- Schmidt, A. M., Linksvayer, T. A., Boomsma, J. J., Pedersen, J. S. No benefit in diversity? The effect of genetic variation on survival and disease resistance in a polygynous social insect. Ecological Entomology. 36 (6), 751-759 (2011).
- Schrempf, a, Aron, S., Heinze, J. Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating. Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).
