Summary
ونقدم هنا بروتوكول المجربة والمختبرة لتنقية بلاستيدات الخضراء البروتين استيراد المجمعات (مجمع عرة TOC) باستخدام علامة الحنفية. البروتوكول والعزل تقارب خطوة واحدة يحتمل أن يمكن تطبيقها على أي البروتين ويستخدمها الكتلي التعرف على شركاء جدد من التفاعل.
Abstract
نشوء حيوي بلاستيدات الخضراء يتطلب استيراد الآلاف من البروتينات المرمزة بنواة إلى البلاستيديه. استيراد هذه البروتينات يعتمد على ترانسلوكون الخارجي (TOC) وأغشية بلاستيدات الخضراء (عرة) الداخلية. جدول المحتويات والتشنج المجمعات مولتيميريك وربما تحتوي على مكونات غير معروفة حتى الآن. أحد الأهداف الرئيسية في هذا المجال وضع قائمة جرد كاملة لمكونات جدول المحتويات والتشنج. لعزل مجمعات عرة جدول المحتويات، وتحديد مكونات جديدة، مستقبلات بريبروتين TOC159 وقد تم تعديل ن لا شفاء منه بإضافة علامة تنقية (وات) تقارب جنبا إلى جنب أسفر عن الحنفية-TOC159. اضغط العلامة مصممة لتنقية تقارب متسلسلة خطوتين (وبالتالي "تقارب جنبا إلى جنب"). علامة برنامج المشورة التقنية المستخدمة في هذه الدراسات تتكون من الطرفي ن مفتش ملزمة المجال المستمدة من البروتين المكوّرات العنقودية الذهبية (بروتا) يتبع طريق ببتيد كالمودولين-الملزمة (الجمارك). بين هذه العلامات تقارب اثنين، أحفر التبغ الانقسام حوزتي الفيروس (TEV) وقد أدرج الموقع. ولذلك، يمكن استخدامها حوزتي TEV شطف لطيف من المجمعات التي تحتوي على TOC159 بعد ملزم الخرز مفتش. في البروتوكول المعروضة هنا، تم حذف الخطوة تنقية كالمودولين-تقارب الثانية. البروتوكول تنقية يبدأ مع إعداد و solubilization مجموع الأغشية الخلوية. بعد المنظفات-العلاج وهي المحتضنة بروتينات الغشاء solubilized مع الخرز مفتش إيمونويسوليشن المجمعات التي تحتوي على TOC159 اضغط. عند الربط والغسيل واسعة النطاق، المشقوق الصنبور-TOC159 التي تحتوي على مجمعات وأفرج عنه من الخرز مفتش حوزتي TEV حيث يتم إزالة المجال س المذهبة مفتش ملزمة باستخدام. الغربية النشاف من عزلة يمكن استخدامها المجمعات التي تحتوي على TOC159 للتأكد من وجود بروتينات جدول المحتويات والتشنج المعروفة أو المشتبه فيها. الأهم من ذلك، المجمعات التي تحتوي على TOC159 قد استخدمت بنجاح لتحديد مكونات جديدة من المجمعات جدول المحتويات والتشنج من الطيف الكتلي. يسمح البروتوكول الذي نقدم يحتمل أن كفاءة عزل أي بروتين غشاء زمنياً المعقدة التي ستستعملها الكتلي للتعرف على مكونات غير معروفة حتى الآن.
Introduction
النباتات تعتمد على المعايشة لعملية التمثيل الضوئي والنمو فوتواوتوتروفيك1. الغالبية العظمى من البروتينات بلاستيدات الخضراء هي مرمزة في النواة وتوليفها في سيتوسول واستيرادها بلاستيدات الخضراء عن طريق المجمعات عرة وجدول المحتويات في الأغشية مغلف2. ويتألف جوهر جدول المحتويات المعقدة القناة البروتين-إجراء Toc75 وهما مستقبلات Toc33 جتباسيس Toc1593،،من45. TOC159 ضروري لنشوء حيوي للمعايشة ويتوسط التراكم الهائل من البروتينات المرتبطة بعملية التمثيل الضوئي6. ويتكون المجمع عرة قناة البروتين-إجراء TIC20، فضلا عن7،TIC110 و TIC408. مؤخرا، بروتين 1MD إزفاء معقدة في الغشاء المغلف الداخلية كانت معزولة ويتضمن عناصر مجهولة سابقا9، كان أحدها TIC56. مؤخرا نحن معزولة شارك TIC56 من 1 نجمة داود الحمراء معقدة استخدام بروتوكول تنقية تقارب الصنبور-TOC159. وتشير البيانات إلى تداخل هيكلي بين المجمعات جدول المحتويات/تيك "المتعارف عليه" و مجمع جمعية نجمة داود الحمراء 110. سابقا كما تم تحديد المكونات غير معروفة مثل KOC1 كشركاء جدد في التفاعل من المجمعات جدول المحتويات والتشنج استخدام الصنبور-الأسلوب الموصوفة هنا10،11.
وهكذا، تنقية الحنفية العلامة طريقة فعالة لعزل البروتين المجمعات وتحديد الشركاء المتفاعلة ب التحليل الشامل والمطيافيه اللاحقة12. علامة الحنفية يتألف اثنان يكرر ملزمة مفتش يفصلها عن ببتيد كالمودولين-الملزمة (الجمارك) التبغ أحفر الفيروس (TEV) مبطلات الانقسام والموقع. الأسلوب الأصلي، تتألف من خطوة تنقية تقارب مفتش متبوعاً بانشقاق TEV واللوني اللاحقة كالمودولين-تقارب يسمح بتنقية أصلية كبيرة ونقية عالية البروتين المجمعات13،14 . لدينا تبسيط الإجراءات وأثبتت أن مجمعات البروتين التي تحتوي على TOC159 يمكن أيضا أن تنقية كفاءة استخدام فقط الخطوة تنقية تقارب مفتش تليها الانقسام TEV شطف15. في تجربتنا، إغفال الخطوة كالمودولين-تقارب أدت إلى زيادة الغلات ولذلك قد يكون مناسباً للبروتينات وفرة منخفضة.
وباختصار، نحن المهندسة وراثيا مستقرة التمويل (أ) خطوط معربا عن الصنبور--TOC159 في ppi2 (toc159 كو المسخ) الخلفية والمنشأة فإنه كمصدر موثوق لتطهير المجمعات عرة جدول المحتويات. البروتوكول المتعلق بعزل المجمع عرة TOC يبدأ بتجانس المواد النباتية في منطقة عازلة خالية من المنظفات. بعد الطرد المركزي، يتم تجاهل المادة طافية. هو solubilized بيليه الذي يحتوي على الكسر غشاء مجموع استخدام المخزن مؤقت الذي يحتوي على مواد التنظيف. بعد خطوة فائقة-الطرد المركزي، يتم تطبيق المادة طافية المحتوية على سولوبيليزيد جدول المحتويات-تيك المجمعات على راتنج مفتش لانجذاب تطهير. بعد عدة خطوات الغسيل، شطف يجري استخدام المخزن مؤقت الإجمالية المحتوية على مبطلات لانتقائية تنشق المصب من المجالات الملزمة مفتش ولطف الإصدار الأصلي المجمعات التي تحتوي على TOC159. يمكن تحليل النذرة TEV مباشرة بواسطة النشاف الغربية أو الكتلي تحديد الشركاء التفاعل TOC15910،،من1115. كما استخدمت الطريقة لتحديد التعديلات بوستترانسلاشونال TOC15915. في المستقبل، قد تستخدم المجمعات الأصلية التي تحتوي على TOC159 لدراسات الهيكلية باستخدام الفحص المجهري كريويليكترون.
Protocol
1-إعداد النباتات نبات
- تحضير 1 لتر من نصف قوة من الفيتامينات بما في ذلك المتوسط Murashige وسكوغ (مللي ثانية) مع السكروز 1% وضبط درجة الحموضة إلى 5.7 مع هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH). إضافة 0.8 في المائة من فيتواجار والاوتوكلاف لمدة 20 دقيقة على 120 درجة مئوية.
- من أجل 75 مل من مرض التصلب العصبي المتعدد المتوسطة كل لوح بيتري (قطر 14.5 سم، ارتفاع 3 سم) والسماح التجميد ح 1.
- إضافة 30 ملغ بذور نبات التمويل إلى 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب، وتعقيم السطح مع الإيثانول 70% (v/v) التي تحتوي على 0.05% (v/v) X-100 تريتون لمدة 5 دقائق، متبوعاً بنسبة 100% إزالة الإيثانول (v/v) للحد الأدنى 10 في الإيثانول.
- نقل البذور عقيمة ورق الترشيح للتجفيف. رش بذور معقمة بالتساوي على صفيحة مرض التصلب العصبي المتعدد (يتطلب كل الوراثي لوحات على الأقل 8-10)، وختم كل لوحة مع الشريط الجراحي.
- احتضان لوحات عند 4 درجة مئوية لمدة يومين في الظلام لمزامنة إنبات البذور. نقل إلى دائرة نمو مع دورة الخفيفة التالية: 8 ح 120 µmol م2 ق1 الخفيفة، وح 16 من الظلام في 22-20 درجة مئوية.
2- إعداد حبات هسيج [اغروس]
- تعليق الخرز [اغروس] تنشيط كنبر (ز 4) في 100 مل من HCl 1 مم، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نقل الخرز [اغروس] إلى مرشح زجاج متكلس، وتغسل تحت الفراغ مع 100 مل من 100 ملم HCl وكرر 2-3 مرات.
ملاحظة: بريكول الحل أغسل إلى 4 درجات مئوية. - ريسوسبيند الخرز [اغروس] في 1 مل من HCl الباردة 100 مم ونقل إلى أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي. يجب غسل الفلتر الزجاج متكلس مع 3 مل من HCl 100 مم ونقل السائل إلى الأنبوب نفسه.
- تدور في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية مع ماصة.
ملاحظة: لا صب الأنبوبة. - ريسوسبيند الخرز في 50 مل من اقتران المخزن المؤقت (الجدول 1)؛ مزيج بإيجاز ومن ثم تدور في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- حل 50 مغ مفتش هومو العاقل المجففة بالتبريد (Hs-IgG) في 10 مل من المخزن المؤقت لاقتران، ومزيج الخرز [اغروس] بلطف واحتضانها في شاكر الروتاري بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- تدور في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية مع ماصة.
- أغسل حبات مفتش-[اغروس] مع 50 مل من اقتران المخزن المؤقت وتدور في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- ريسوسبيند الخرز مفتش-[اغروس] مع 50 مل من المخزن المؤقت حظر (الجدول 1) وتدور في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. كرر مرة واحدة.
- ريسوسبيند الخرز مفتش-[اغروس] في 50 مل من المخزن المؤقت لحظر، وتدوير الخليط ح 2 في الرايت وتدور في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخرز مفتش-[اغروس] في 200 مل من كلوريد الصوديوم اقتران المخزن المؤقت (الجدول 1).
- لمنع أي مجموعات كنبر كروسلينكينج المتبقية، يغسل الخرز مفتش-[اغروس] مع 100 مل من 0.1 م جليكاين-HCl، 2.8 درجة الحموضة. تدور في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية. يغسل مع 0.2 م جليكاين-HCl، الأس الهيدروجيني 2.8، تدور في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية. وأخيراً، تغسل حبات مفتش-[اغروس] مع 200 مل الماء عالي النقاوة.
- أغسل حبات مفتش-[اغروس] مع 200 مل الماء عالي النقاوة ومن ثم 200 مل من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني (الجدول 1).
- ريسوسبيند الخرز مفتش-[اغروس] في 20 مل من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني مع 0.01 ٪ نان3 (أزيد الصوديوم) وتخزينها في 4 درجات مئوية.
3-العزلة و Solubilization في كسر الغشاء
- طحن 10 غم من ثلاثة أسابيع من العمر التمويل ألف شتلة في النتروجين السائل باستخدام مدافع الهاون الباردة ومدقة مع الرمال.
- إضافة 20 مل البرد طحن المخزن المؤقت (الجدول 1) إلى 10 جرام أنسجة الأرضية ومزيج جيد، وذوبان الجليد على الجليد.
- تصفية هوموجيناتي من خلال طبقتين من مادة الترشيح السريع في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي. امتصاص المواد الترشيح السريع مع طحن المخزن المؤقت قبل الترشيح.
- أجهزة الطرد المركزي فيلتراتي لمدة 10 دقيقة في × 1,500 ز 4 درجات مئوية ونقل المادة طافية إلى أنبوب الطرد مركزي مخروطية مثلجة 50 مل، كرر نفس الخطوة مرة أخرى وجمع المادة طافية. الاحتفاظ بعينه 200 ميليلتر في "كسر مجموع" وتخزينها في-80 درجة مئوية لتحليلها في وقت لاحق
- نقل المادة طافية على أنابيب ultracentrifuge مل 38.50 الباردة وأعلى يصل إلى 35 مل مع المخزن المؤقت لطحن الباردة. أجهزة الطرد المركزي ح 1 في 100,000 × ز في 4 درجات مئوية في أولتراسينتريفوجي.
- نقل المادة طافية إلى أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي. الاحتفاظ بعينه ميليلتر 200 "كسر القابلة للذوبان" ومخزن في-80 درجة مئوية لتحليلها في وقت لاحق.
- إعادة تعليق بيليه الخضراء باستخدام الخالطون تفلون زجاج، في المخزن المؤقت الطحن. الطرد المركزي ح 1 في 100,000 × ز في 4 درجات مئوية في أولتراسينتريفوجي وتجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه الخضراء في 18.75 مل 1 × طحن المخزن المؤقت باستخدام الخالطون تفلون زجاج وإضافة مل 9.375 1 × طحن المخزن المؤقت.
- إضافة مل 9.375 4 إلى حل x solubilisation (التي تحتوي على مواد التنظيف TX-100) (الجدول 1) إلى إعطاء 37.5 مل واحتضان لمدة 30 دقيقة على "شاكر الدورية" في 4 درجات مئوية.
- أجهزة الطرد المركزي ح 1 في 100,000 × ز في 4 درجات مئوية في أولتراسينتريفوجي. نقل المادة طافية إلى أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي. الاحتفاظ بعينه 200 ميليلتر (المستقبل "تحميل جزء") المادة طافية ومخزن في-80 درجة مئوية لتحليلها في وقت لاحق.
- ريسوسبيند بيليه في 37.5 مل من طحن المخزن المؤقت. الاحتفاظ عينة لجزء غير قابل للذوبان ومخزن في-80 درجة مئوية
4-إيمونوبريسيبيتيشن
- حجته 100 ميليلتر من راتنج مفتش-[اغروس] وجبات في المخزن المؤقت A (الجدول 1) وتدور في 100 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند الراتنج مفتش-[اغروس] في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت A عند 4 درجة مئوية.
- نقل الراتنج مفتش-[اغروس] غسلها لمل 37.5 الأغشية سولوبيليزيد واحتضان بين عشية وضحاها على شاكر تناوب في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي في 4 درجات مئوية.
- الترسبات [اغروس]-مفتش الراتنج في 100 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية مع ماصة. الاحتفاظ بعينه ميليلتر 200 "التدفق من خلال" وتخزينها في-80 درجة مئوية لتحليلها في وقت لاحق.
- أغسل الراتنج مفتش-[اغروس] في 37.5 مل من المخزن المؤقت A واحتضانها لمدة 10 دقيقة على شاكر تناوب.
- الرواسب الراتنج مفتش-[اغروس] في 100 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، إزالة المادة طافية مع ماصة، إضافة 5 مل من طحن المخزن المؤقت A إلى 15 مل أنبوبة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 100 × ز، 4 درجة مئوية، 5 دقيقة الاحتفاظ 200 عينة ميليلتر من "الغسيل 1" وتخزينها في-80 درجة مئوية لتحليلها في وقت لاحق.
- كرر 5 مل الغسيل الخطوة ثلاث مرات مع مخزن مؤقت أ
- القيام بخطوات الغسيل الأخيرتين دون مثبطات (NaF، مثبط البروتياز وبمسف)
ملاحظة: مثبطات لم يعد المطلوب في هذه المرحلة وتم حذفها لتقليل التكلفة. الاحتفاظ بعينه 200 ميليلتر الماضي الغسيل خطوة "النهائي يغسل (W6)" ومخزن في-80 درجة مئوية لتحليلها في وقت لاحق. - نقل الراتنج مفتش-[اغروس] إلى عمود دوران 500 ميليلتر مع عامل تصفية 35 ميكرون وتغسل الخرز مرتين مع 300 ميليلتر TEV شطف المخزن المؤقت (الجدول 1) (لا تحتوي على أكتيف) للموازنة. إغلاق عمود الدوران.
- إضافة 300 ميليلتر من TEV شطف العازلة التي تحتوي على 50 وحدة (10 ميليلتر) من أكتيف. تحضير هذا المزيج في أنبوب قبل إضافة إلى الراتنج.
- احتضان عمود الدوران مع الخرز في ثيرموميكسير في 16 درجة مئوية، 350 دورة في الدقيقة ل 2 حاء عكس العمود بلطف عدة مرات كل 30 دقيقة.
- فتح عمود الدوران، ووضعه في أنبوب مل 1.5 نظيفة جديدة وتدور في 100 × ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية لجمع النذرة.
- الجاف (على سبيل المثال) 10% (v/v) من عينة التيد (~ 25 ميليلتر) في مبخر الطرد مركزي واستخدام الطيف الكتلي أو غيرها المزيد من التحليل.
- الكوة النذرة المتبقية (~ 275 ميليلتر) مقسمة إلى إلى أحد عشر 1.5 مل أجهزة الطرد المركزي أنابيب (25 ميليلتر في كل)، جاف في مبخر الطرد مركزي، وتخزينها في-80 درجة مئوية.
- تحليل العينات الاحتفاظ بها طوال هذا الإجراء، فضلا عن الواتس بمعيار يليه الحزب الديمقراطي الصربي صفحة إيمونوبلوتينج. لإعداد نموذج، متعجل 50 ميكروغرام من مجموع (T)، يغسل تحميل (L)، التدفق من خلال (قدم)، 1 (W1) و 200 ميليلتر للغسيل 6 (W6) ب استخراج الميثانول كلوروفورم/16.
- إضافة 10 ميليلتر من 2 × تحميل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المخزن المؤقت (الجدول 1) إلى العينات سرع و 25 ميليلتر من العينة المجففة التيد. دوامة ويغلي لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية في كتلة حرارة.
- تحليل مجموع (T)، تحميل (L)، والتدفق من خلال (قدم)، يغسل 1 (W1)، يغسل 6 (W6) وشطف (ه) التي إيمونوبلوتينج باستخدام الأجسام المضادة TOC159 المضادة لتحديد كفاءة إجراءات العزل.
Representative Results
ونحن هنا وصف بروتوكول لتنقية البروتين المغلف معلم الحنفية بلاستيدات الخضراء المعقدة من المعدلة وراثيا (أ) التمويل النباتات. كما هو مبين في الشكل 1ألف، محطات الإعراب عن 35S:NTAP--بناء TOC159 كانت تستخدم لعزل هذا المجمع بينما النباتات المعبرة في بناء 35S:NTAP واستخدمت كعنصر تحكم. الشكل 1 ب يبين الخطوات التفصيلية لتنقية TOC159 الاستفادة من البروتين المجمعات تليها الكتلي للسماح بتحديد البروتينات المتفاعلة. ويؤكد التحليل إيمونوبلوت (الشكل 2، يمين) أن TOC159 الصنبور معزولة يتفاعل مع TOC75 و TOC33 من مجمع جدول المحتويات. كيناز الغشاء الخارجي بلاستيدات الخضراء KOC1 المعروف فوسفوريلاتي TOC159 كما شارك معزولة مع المجمع الصنبور-TOC159 (الشكل 2بمن الجانب الأيمن). ويكشف وجود TIC110 أن المجمع الصنبور-TOC159 معزولة يحتوي أيضا على مكونات المجمع عرة. جسم FBN1A التي أثيرت ضد بروتين بلاستوجلوبولي لا علاقة لها باستيراد البروتين لا تعترف بالمجمع TOC159 الاستفادة مما يشير إلى عدم وجود التلوث. في عنصر تحكم السلبية، إيمونوبريسيبيتاتيد نتاب البروتين عزل لا يشترك مع أي من البروتينات عرة جدول المحتويات (الشكل 2، الجانب الأيسر) ويؤكد الطابع الخاص لتنقية TOC159 الصنبور.
الشكل 1 . مخطط بنيات وإجراءات تنقية تقارب- (أ). 35S:NTAP-TOC159 كان بناء، ترميز TOC159 نتاب ستابلي المعرب عنها في نبات التمويل. وأعرب محطات مراقبة سلبية في بناء 35S:NTAP، ترميز علامة برنامج المشورة التقنية وحدها. (ب)-البروتوكول خطوة تقارب الحكمة تنقية يتكون من غشاء يغسل العزلة وسولوبيليزيشن، مفتش [اغروس] تنقية المناعية، والانقسام حوزتي TEV وشطف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . تنقية تقارب جنبا إلى جنب للبروتين TOC159. N-لا شفاء منه TOC159 معلم الحنفية تمت تنقيته من نتاب-TOC15:نبات ppi2 النباتات والاستفادة من البروتين تنقيته من النباتات الصنبور: WT استخدمت كعنصر سلبي. مجموع البروتين بروتينات الغشاء مقتطفات (T)، solubilized = تحميل جزء (L)، تدفق من خلال (قدم)، أولاً وأخيراً وغسل الكسور (W1 و W6) وحللت 10% النذرة TEV من النشاف الغربية. وكان سبر الغشاء مع الأجسام المضادة ضد TOC159 (AT4G02510)، TOC75 (AT3G46740)، TOC33 (AT1G02280)، KOC1 (AT4G32250)، TIC110 (AT1G06950)، و FBN1A (AT4G04020). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| جدول المخازن المؤقتة | ||
| المخزن المؤقت لاقتران | ناكو3 ضبط للأس الهيدروجيني 8.5 ضبط الأس الهيدروجيني 0.1 م Na2CO3 |
100 مم |
| حجب المخزن المؤقت | تريس – HCl ضبط على درجة الحموضة 8 مع HCl. |
100 مم |
| المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني | غ2هبو4 PO42خ كلوريد الصوديوم بوكل ضبط على درجة الحموضة 7.3 مع HCl. |
4.3 مم 1.4 مم 137 2.7 |
| كلوريد الصوديوم اقتران المخزن المؤقت | المخزن المؤقت لاقتران كلوريد الصوديوم |
م 1 |
| 2 × طحن المخزن المؤقت | تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5 مع HCl. كلوريد الصوديوم NaF بمسف كوكتيل مثبط البروتياز النبات |
100 مم 200 ملم 5 مم 1 مم 0.20% |
| 4 X سولوبيليسيشن الحل | الجلسرين X100 تريتون |
40% 3% |
| المخزن المؤقت A | 2 × طحن المخزن المؤقت 1 × طحن المخزن المؤقت 4 X سولوبيليسيشن الحل |
100 مل 50 مل 25 مل 25% |
| TEV شطف المخزن المؤقت | تريس-HCl، درجة الحموضة 8 مع قائمة توافق الأجهزة يدتا، درجة الحموضة 8 مع قائمة توافق الأجهزة كلوريد الصوديوم الجلسرين X100 تريتون DTT |
50 مم 0.5 مم 100 مم 10 ٪ 0.75 في المائة 1 مم |
| 2 × تحميل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المخزن المؤقت | تريس-HCl الأس الهيدروجيني 6.8 مع HCl الحزب الديمقراطي الصربي الجلسرين أزرق بروموفينول DTT |
0.1 M 4 في المائة 20% 0.20% 0.2 M |
الجدول 1. وصفات المخزن المؤقت.
Discussion
أظهرنا أن خطوة واحدة تنقية العلامة الصنبور طريقة محددة وفعالة لتنقية المجمع عرة TOC نبات . على الرغم من أن علامة الحنفية سيسمح خطوتين تنقية المتعاقبة (مفتش-تليها كالمودولين انجذاب تطهير بعد TEV البروتياز-الانقسام)، ونعتقد أن تقارب خطوة أولى تليها TEV حوزتي الانقسام ستكون كافية في العديد من الحالات. أن هدفنا، TOC159، هو منخفض وفيرة وإدراج الخطوة الثانية كالمودولين-تقارب مفرطة تناقص الغلة البروتين الذي كان السبب الرئيسي لاستبعاد أنه لدينا هذا البروتوكول. TEV-شطف في حد ذاته هو خطوة محددة جداً ولطيف وتنقية ستفرج فقط المستهدفة الصنبور معلم جنبا إلى جنب مع الشركاء المرتبطين بها التفاعل بينما تلويث البروتينات في التمسك بعدم التحديد الراتنج مفتش ستبقى هناك. وهكذا، في تركيبة مع خطوة تقارب مفتش، يؤدي شطف TEV على تنقية فعالة بما فيه الكفاية لأغراض لدينا وربما العديد من الآخرين.
يجب الحرص أن بناء معلم الحنفية تعمل بكامل طاقتها في فيفو. يمكن أن يكون وضع علامات على الاستفادة من الآثار الضارة المحتملة على نشاط البروتين أو الاستقرار أو التعريب. TOC159 تتألف من ثلاثة مجالات، المجال الطرفي ن الحمضية، والمركزي أنشئ ملزمة المجال والمجال غشاء ج-الطرفية، المراسي TOC159 في الغشاء الخارجي بلاستيدات الخضراء2. لتجنب التداخل المحتمل مع الإدراج غشاء، نحن تنصهر علامة الحنفية إلى N-محطة TOC159. الانصهار إلى N-المحطة هو الاستثناء بدلاً من القاعدة. العديد من البروتينات تحتوي على معلومات تستهدف الطرفي ن، وينبغي لذلك معلم في ج-المحطة. أكد لنا أن TOC159 الوظيفية في فيفو بالتكامل للمسخ ppi2 (المسخ ألبينو تفتقر إلى TOC159) مع الاستفادة من TOC159. إنقاذ الأخضر، أوضحت البرية نوع النمط الظاهري أن الحنفية-TOC159 الفنية15.
وكان استخدام البروتوكول تنقية التعرف على شركاء جدد من التفاعل من TOC159، التي شملت10،KOC1 و TIC5611. وفي المجموع، ترتبط البروتينات حوالي 30 مع المجمع مما يوحي بأن التفاعل الجديدة سيتم عزل الشركاء وتتميز في المستقبل القريب. بينما نوصي بشدة علامة برنامج المشورة التقنية لتنقية معقدة، لا تزال نود أن نشير إلى أن إصدارات إضافية لتلك المقدمة هنا موجودة، وقد يكون من المفيد جداً لبعض التطبيقات.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح.
Acknowledgments
وكان دعم العمل من المنح المقدمة من "مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية" (31003A_156998 و 31003A_176191)، وجامعة نيوشاتيل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaHCO3 | PanReac AppliChem | A0384 | |
| Tris | Biosolve | 0020092391BS | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7909 | |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | A2946 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | A2942 | |
| NaF | Sigma | S1509 | Toxic |
| PMSF | PanReac AppliChem | A0999 | Toxic |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | A0970 | |
| Triton X100 | Roche | 10789704001 | |
| Glycine | PanReac AppliChem | A1067 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043 | |
| Dithiothreitol (DTT) | PanReac AppliChem | A1101 | |
| SDS | PanReac AppliChem | A0675 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| HCl | VWR | 20252-290 | Corrosive |
| Sucrose | PanReac AppliChem | A3935 | |
| Murashige and Skoog medium with vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| Phytoagar | Duchefa Biochemie | P1003 | |
| Petri plate | Greiner Bio-one | 639102 | |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706 | |
| Ethanol | Fisher chemical | E/0600DF/15 | |
| Filter paper | Whatman | 10311804 | |
| Surgical tape | 3M | 1530-1 | |
| CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B) | GE Healthcare | 17-0430-01 | |
| Sintered glass filter | DURAN | 2515703 | |
| Centrifuge tube 50 mL | TPP | 91050 | |
| Purified immunoglobulin G (HsIgG) | MP Biomedicals | 855908 | |
| Rotating shaker | IKA | 4016000 | |
| NaN3 (sodium azide) | Sigma | 71290 | Toxic |
| Quick filtration material (Miracloth) | Merk-Millipore | 475855 | |
| Ultracentrifube XNP-80 | Beckman Coulter | A99839 | |
| Rotor SW 32 Ti | Beckman Coulter | 369650 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass teflon homogenizer (Potter) | Wheaton | 357426 | |
| Spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M1003 | |
| Filter 35µm for spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M513515 | |
| AcTEV | Invitrogen | 12575-015 | |
| Centrifugal evaporator (Speed Vac) | Eppendorf | 5305000100 | |
| FBN1A(PGL35) antibody | AgriSera | AS06 116 | RRID:AB_2247012 |
| Sand, Fontainebleau | VWR | 27460.295 |
References
- Jarvis, P., López-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Kessler, F., Schnell, D. Chloroplast biogenesis: diversity and regulation of the protein import apparatus. Current opinion in cell biology. 21 (4), 494-500 (2009).
- Schnell, D. J., Kessler, F., Blobel, G. Isolation of components of the chloroplast protein import machinery. Science. 266 (5187), 1007-1012 (1994).
- Kessler, F., Blobel, G., Patel, H. A., Schnell, D. J. Identification of two GTP-binding proteins in the chloroplast protein import machinery. Science. 266 (5187), 1035-1039 (1994).
- Jarvis, P., et al. An Arabidopsis mutant defective in the plastid general protein import apparatus. Science. 282 (5386), 100-103 (1998).
- Bauer, J., et al. Essential role of the G-domain in targeting of the protein import receptor atToc159 to the chloroplast outer membrane. The Journal of cell biology. 159 (5), 845-854 (2002).
- Kovacs-Bogdan, E., Soll, J., Bolter, B. Protein import into chloroplasts: the Tic complex and its regulation. Biochimica et biophysica acta. 1803 (6), 740-747 (2010).
- Nakai, M. The TIC complex uncovered: The alternative view on the molecular mechanism of protein translocation across the inner envelope membrane of chloroplasts. Biochimica et biophysica acta. 1847 (9), 957-967 (2015).
- Kikuchi, S., et al. Uncovering the protein translocon at the chloroplast inner envelope membrane. Science. 339 (6119), 571-574 (2013).
- Kohler, D., et al. Characterization of chloroplast protein import without Tic56, a component of the 1-megadalton translocon at the inner envelope membrane of chloroplasts. Plant physiology. 167 (3), 972-990 (2015).
- Zufferey, M., et al. The novel chloroplast outer membrane kinase KOC1 is a required component of the plastid protein import machinery. The Journal of biological chemistry. 292 (17), 6952-6964 (2017).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Rohila, J. S., Chen, M., Cerny, R., Fromm, M. E. Improved tandem affinity purification tag and methods for isolation of protein heterocomplexes from plants. The Plant journal. 38 (1), 172-181 (2004).
- Rohila, J. S., et al. Protein-protein interactions of tandem affinity purified protein kinases from rice. PloS one. 4 (8), 6685 (2009).
- Agne, B., et al. The acidic A-domain of Arabidopsis TOC159 occurs as a hyperphosphorylated protein. Plant physiology. 153 (3), 1016-1030 (2010).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
