Summary
हम यहां chloroplast प्रोटीन आयात परिसरों की शुद्धि के लिए एक सिद्ध और परीक्षण प्रोटोकॉल वर्तमान (TOC-टिक जटिल) नल-टैग का उपयोग कर । एक कदम संबध-अलगाव प्रोटोकॉल संभावित रूप से किसी भी प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है और जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा नए संवाद भागीदारों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा ।
Abstract
Chloroplast उत्पत्ति नाभिक के हजारों plastid में इनकोडिंग प्रोटीन के आयात की आवश्यकता है । इन प्रोटीन का आयात बाहरी (TOC) और भीतरी (टिक) chloroplast झिल्ली पर translocon पर निर्भर करता है । TOC और टिक परिसरों multimeric और शायद अभी तक अज्ञात घटक होते हैं । क्षेत्र में मुख्य लक्ष्यों में से एक TOC और टिक घटकों की पूरी सूची स्थापित करने के लिए है । TOC के अलगाव के लिए-टिक परिसरों और नए घटकों की पहचान के लिए, प्रोटीन रिसेप्टर TOC159 के साथ मिलकर समानता शुद्धि (ठोकर) टैग नल TOC159 में जिसके परिणामस्वरूप के अलावा द्वारा एन-टर्मिनली संशोधित किया गया है । नल-टैग दो अनुक्रमिक संबध शुद्धि चरणों के लिए डिज़ाइन किया गया है (इसलिए "मिलकर संबध") । नल-टैग इन अध्ययनों में प्रयुक्त एक N-टर्मिनल आईजीजी-बाध्यकारी डोमेन Staphylococcus aureus प्रोटीन ए (ProtA) से व्युत्पंन एक calmodulin-बाध्यकारी पेप्टाइड (CBP) के बाद होते हैं । इन दो अपनत्व टैग के बीच, एक तंबाकू खोदना वायरस (टेव) को छेड़ो दरार साइट शामिल किया गया है । इसलिए टेव को आईजीजी मोतियों से बाँधने के बाद TOC159-युक्त कॉम्प्लेक्सों के कोमल रेफरेंस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में द्वितीय Calmodulin-संबधी शुद्धिकरण चरण का लोप किया गया. शुद्धि प्रोटोकॉल की तैयारी और कुल सेलुलर झिल्ली के solubilization के साथ शुरू होता है । डिटर्जेंट-उपचार के बाद, solubilized झिल्ली प्रोटीन नल-TOC159 युक्त परिसरों के immunoisolation के लिए आईजीजी मोतियों के साथ मशीन हैं । बाध्यकारी और व्यापक धुलाई पर, नल-परिसरों युक्त TOC159 और आईजीजी मोतियों से जारी टेव को छेड़ने जिससे एस. aureus आईजीजी-बाइंडिंग डोमेन हटा दिया जाता है । पृथक TOC159-युक्त परिसरों के पश्चिमी सोख्ता ज्ञात या संदिग्ध TOC और टिक प्रोटीन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इससे भी महत्वपूर्ण बात, TOC159 युक्त परिसरों सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है TOC और जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा टिक परिसरों के नए घटकों की पहचान । प्रोटोकॉल है कि हम वर्तमान संभावित किसी भी झिल्ली के कुशल अलगाव-बाध्य प्रोटीन जटिल मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा अभी तक अज्ञात घटकों की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा अनुमति देता है ।
Introduction
पौधे प्रकाश संश्लेषण और photoautotrophic वृद्धि1के लिए chloroplasts पर निर्भर करते हैं । chloroplast प्रोटीन के विशाल बहुमत नाभिक में इनकोडिंग, cytosol में संश्लेषित और लिफाफा झिल्ली2में टिक और TOC परिसरों के माध्यम से chloroplast में आयात कर रहे हैं । TOC परिसर के मुख्य Toc75 प्रोटीन का आयोजन चैनल और दो रिसेप्टर GTPases Toc33 और Toc1593,4,5शामिल हैं । TOC159 chloroplasts की उत्पत्ति के लिए आवश्यक है और प्रकाश संश्लेषण के बड़े पैमाने पर संचय-जुड़े प्रोटीन6मध्यस्थता । टिक जटिल TIC20 प्रोटीन का आयोजन चैनल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से TIC110 और TIC407,8के होते हैं । हाल ही में, भीतरी लिफाफा झिल्ली पर एक 1MD प्रोटीन translocation परिसर अलग था और पहले अज्ञात9घटक निहित, जिनमें से एक TIC56 था । हमने हाल ही में TIC56-TOC159 संबध शुद्धिकरण प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए 1 एमडीएस परिसर का सह-पृथकीकरण कर रखा है । डेटा "विहित" TOC/टिक परिसरों और 1 एमडीए परिसर10के बीच एक संरचनात्मक ओवरलैप संकेत दिया । KOC1 के रूप में पहले से अज्ञात घटक भी TOC और टिक परिसरों के नए संवाद भागीदारों के रूप में पहचाने गए नल का उपयोग-विधि यहां वर्णित10,11।
इस प्रकार, नल टैग शुद्धि प्रोटीन परिसरों के अलगाव और बाद में जन spectrometric विश्लेषण12द्वारा बातचीत भागीदारों की पहचान के लिए एक कुशल तरीका है । टैग ठोकर दो आईजीजी बाध्यकारी एक calmodulin-बाध्यकारी पेप्टाइड (CBP) से एक तंबाकू खोदना वायरस (टेव) को छेड़ो दरार साइट से अलग दोहराता होते हैं । मूल विधि, एक आईजीजी-अपनत्व शुद्धि टेव दरार और बाद में calmodulin-संबध के बाद कदम से मिलकर क्रोमैटोग्राफी बड़े और उच्च शुद्ध प्रोटीन के मूल शुद्धि की अनुमति दी परिसर13,14 . हमने प्रक्रिया को सरलीकृत किया है और यह दर्शाया है कि TOC159-युक्त प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को भी केवल आईजीजी-संबधी शुद्धिकरण कदम का उपयोग करके शुद्ध किया जा सकता है टेव-क्लीवेज के लिए15. हमारे अनुभव में, calmodulin की चूक-अपनत्व कदम उच्च पैदावार के परिणामस्वरूप और इसलिए कम बहुतायत प्रोटीन के लिए उपयुक्त हो सकता है ।
संक्षेप में, हम स्थिर ट्रांसजेनिक A. थालियाना नल एक्सप्रेस-TOC159 ppi2 (TOC159 KO उत्परिवर्ती) पृष्ठभूमि में इंजीनियर और यह TOC-टिक परिसरों की शुद्धि के लिए एक विश्वसनीय स्रोत के रूप में स्थापित किया । TOC के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल-टिक जटिल एक डिटर्जेंट मुक्त बफर में संयंत्र सामग्री के homogenization के साथ शुरू होता है । केंद्रापसारक के बाद, supernatant खारिज कर दिया है । कुल झिल्ली अंश युक्त गोली एक डिटर्जेंट-बफर युक्त का उपयोग कर solubilized है । एक अल्ट्रा-केंद्रापसारक कदम के बाद, solubilized TOC युक्त supernatant-टिक परिसरों आईजीजी-समानता शुद्धि के लिए राल के लिए लागू किया जाता है । कई धुलाई कदम के बाद, रेफरेंस एक टेव को छेड़ने वाले बफर का उपयोग करके किया जाता है ताकि चुनिंदा आईजीजी-बाइंडिंग डोमेन के बहाव को सट सके और धीरे से देशी TOC159-युक्त परिसरों को रिलीज किया जा सके । टेव eluate पश्चिमी सोख्ता या मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा सीधे विश्लेषण किया जा सकता है TOC15910,11,15के संपर्क भागीदारों की पहचान । विधि भी TOC15915के बाद अनुवाद संशोधन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । भविष्य में, मूल TOC159-युक्त परिसरों cryoelectron माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर संरचनात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
1. Arabidopsis संयंत्रों की तैयारी
- Murashige और Skoog (एमएस) 1% सुक्रोज के साथ विटामिन सहित मध्यम की आधी ताकत के 1 एल तैयार है और पोटेशियम हीड्राकसीड (KOH) के साथ ५.७ के लिए पीएच समायोजित करें । १२० डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए phytoagar और आटोक्लेव के ०.८% जोड़ें ।
- पेट्री प्लेट (व्यास १४.५ सेमी, ऊंचाई 3 सेमी) प्रति MS मध्यम के ७५ मिलीलीटर डालो और 1 एच के लिए solidification की अनुमति देते हैं ।
- एक १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब करने के लिए Arabidopsis थालियाना बीज के 30 मिलीग्राम जोड़ें, और सतह ७०% के साथ बंध्याकरण (वी/v) ०.०५% (वी/वी) ट्राइटन X-१०० के लिए 5 मिनट के लिए, १००% (वी/v) इथेनॉल के लिए 10 मिनट से युक्त इथेनॉल निकालें ।
- बीज को सुखाने के लिए बाँझ फिल्टर कागज के लिए स्थानांतरण । एक एमएस प्लेट पर समान रूप से निष्फल बीज छिड़क (प्रत्येक जीनोटाइप की आवश्यकता है कम से 8-10 प्लेट्स), और सील सर्जिकल टेप के साथ प्रत्येक प्लेट ।
- बीज अंकुरण को सिंक्रनाइज़ करने के लिए अंधेरे में दो दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट्स की मशीन । निम्नलिखित प्रकाश चक्र के साथ एक विकास कक्ष में स्थानांतरित करें: 8 एच के १२० µmol एम− 2 एस− 1 लाइट, और 22-20 डिग्री पर अंधेरे के 16 ज.
2. HsIgG Agarose मोतियों की तैयारी
- सस्पेंड CNBr-सक्रिय agarose मोती (4 जी) 1 मिमी एचसीएल के १०० मिलीलीटर में और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
- एक sintered ग्लास फिल्टर में agarose मोती स्थानांतरण, १०० मिमी एचसीएल और दोहराने 2-3 बार के १०० मिलीलीटर के साथ वैक्यूम के तहत धो लो ।
नोट: 4 डिग्री सेल्सियस के लिए धो समाधान शांत । - ठंड १०० मिमी एचसीएल के 1 मिलीलीटर में agarose मोती resuspend और एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । १०० mM एचसीएल के 3 एमएल के साथ sintered ग्लास फिल्टर को धो लें और लिक्विड को उसी ट्यूब पर ट्रांसफर कर दें ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० × जी पर स्पिन और एक पिपेट के साथ supernatant हटा दें ।
नोट: ट्यूब नहीं कर सकते । - युग्मन बफर (तालिका 1) के ५० मिलीलीटर में मोतियों को फिर से स्थगित; संक्षेप में मिक्स, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० × जी में स्पिन ।
- भंग ५० lyophilized होमो sapiens आईजीजी की मिलीग्राम (एच एस-आईजीजी) युग्मन बफर के 10 मिलीलीटर में, agarose मोती धीरे मिश्रण, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात रोटरी शेखर में गर्मी ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० × जी पर स्पिन और एक पिपेट के साथ supernatant हटा दें ।
- आईजीजी-agarose मोती धो युग्मन बफर के ५० मिलीलीटर के साथ और स्पिन ४०० × g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस ।
- आईजीजी-agarose मोती अवरुद्ध बफर के ५० मिलीलीटर के साथ resuspend (तालिका 1) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० × जी में स्पिन । एक बार दोहराएं ।
- आईजीजी-agarose मोती अवरुद्ध बफर के ५० मिलीलीटर में resuspend, आर टी पर 2 ज के लिए मिश्रण घुमाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० × जी में स्पिन ।
- supernatant निकालें और NaCl युग्मन बफर (तालिका 1) के २०० मिलीलीटर में आईजीजी-agarose मोती resuspend ।
- किसी भी बचे हुए क्रॉस-लिंकिंग CNBr समूहों को अवरोधित करने के लिए, आईजीजी-agarose मोतियों को ०.१ मीटर glycine-HCl, pH २.८ की १०० मिलीलीटर से धोएं । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० × जी पर स्पिन और supernatant हटा दें । ०.२ मीटर glycine-एचसीएल, पीएच २.८, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० × जी पर स्पिन और supernatant को दूर करने के साथ धो लें । अंत में, ultrapure पानी की २०० मिलीलीटर के साथ आईजीजी-agarose मोतियों को धो लें ।
- ultrapure पानी की २०० मिलीलीटर के साथ आईजीजी-agarose मोतियों को धोएं और फिर पंजाब के बफर की २०० मिलीलीटर (तालिका 1) ।
- ०.०१% नण य3 (सोडियम azide) और 4 ° c पर स्टोर के साथ पंजाब के 20 मिलीलीटर बफर के आईजीजी-agarose मोतियों को फिर से सस्पेंड करें ।
3. अलगाव और झिल्ली अंश का Solubilization
- एक ठंडी मोर्टार और रेत के साथ मूसल का उपयोग कर तरल नाइट्रोजन में तीन सप्ताह पुराने a. थालियाना अंकुर के 10 ग्राम पीस ।
- ठंड पीस बफर के 20 मिलीलीटर जोड़ें (टेबल 1) जमीन ऊतक के 10 ग्राम के लिए, अच्छी तरह से मिश्रण है, और बर्फ पर गल ।
- एक 50 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में त्वरित निस्पंदन सामग्री की दो परतों के माध्यम से homogenate फिल्टर । छानने से पहले बफर पीसने के साथ जल्दी निस्पंदन सामग्री सोख ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर १,५०० × जी में 10 मिनट के लिए निस्पंदन और एक ठंडा ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए supernatant हस्तांतरण, एक ही कदम एक और समय को दोहराने और supernatant इकट्ठा । बाद में विश्लेषण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर "कुल अंश" और स्टोर के एक २०० µ एल नमूना बरकरार
- ठंड ३८.५० मिलीलीटर ultracentrifuge ट्यूबों के लिए supernatant स्थानांतरण और कोल्ड पीस बफर के साथ ३५ मिलीलीटर ऊपर ऊपर । एक ultracentrifuge में 4 डिग्री सेल्सियस पर १००,००० × जी में 1 घंटे के लिए केंद्रापसारक ।
- एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए supernatant स्थानांतरण । "घुलनशील अंश" का एक २०० µ एल नमूना बनाए रखने और बाद में विश्लेषण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
- पुनः निलंबित हरी गोली एक गिलास teflon homogenizer का उपयोग कर, बफर पीसने में । एक ultracentrifuge में 4 डिग्री सेल्सियस पर १००,००० × जी में 1 घंटे के लिए केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
- एक गिलास teflon homogenizer का उपयोग 1x पीस बफर की १८.७५ मिलीलीटर में हरी गोली resuspend और ९.३७५ एमएल 1x पीस बफर के जोड़ें ।
- 4x solubilisation समाधान (1 तालिका) के ९.३७५ मिलीलीटर जोड़ें (TX-१०० डिटर्जेंट युक्त) के लिए ३७.५ मिलीलीटर और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक "घूर्णन शेखर" पर गर्मी दे ।
- एक ultracentrifuge में 4 डिग्री सेल्सियस पर १००,००० × जी में 1 घंटे के लिए केंद्रापसारक । एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए supernatant स्थानांतरण । supernatant (भविष्य "लोड अंश") और बाद में विश्लेषण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर के एक २०० µ एल नमूना रखें ।
- बफर पीस के ३७.५ मिलीलीटर में गोली resuspend । -८० ° c में अघुलनशील भाग और स्टोर का नमूना बरकरार रखें
4. Immunoprecipitation
- Equilibrate १०० पैक आईजीजी के µ एल-बफर में agarose राल एक (तालिका 1) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए १०० × जी में स्पिन ।
- supernatant निकालें और १०० µ एल में बफर एक 4 डिग्री सेल्सियस पर आईजीजी-agarose राल resuspend ।
- solubilized झिल्ली के ३७.५ मिलीलीटर को धोया आईजीजी-agarose राल हस्तांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में एक घूर्णन शेखर पर रात भर गर्मी ।
- तलछट आईजीजी-agarose राल पर १०० × 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और एक पिपेट के साथ supernatant को दूर । "के माध्यम से प्रवाह" के एक २०० µ एल नमूना बनाए रखने और बाद में विश्लेषण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
- आईजीजी-agarose बफर एक और एक घूर्णन शेखर पर 10 मिनट के लिए मशीन के ३७.५ मिलीलीटर में राल धो लो ।
- तलछट आईजीजी-agarose राल में १०० × g पर 5 मिनट के लिए 4 ° c, एक पिपेट के साथ supernatant निकालें, एक 15 मिलीलीटर के लिए बफर एक पीसने के 5 मिलीलीटर ट्यूब और १०० × जी, 4 ° c, 5 मिनट में केंद्रापसारक जोड़ें एक २०० µ एल नमूना बनाए रखने के "1 धो" और स्टोर पर-८० ° c बाद के विश्लेषण के लिए ।
- 5 मिलीलीटर धोने कदम तीन बार बफर A के साथ दोहराएं ।
- अवरोधकों के बिना पिछले दो धोने कदम बाहर ले (NaF, छेड़ने अवरोधक और PMSF)
नोट: अवरोधकों अब इस स्तर पर की आवश्यकता है और लागत को कम करने के लिए लोप कर रहे हैं । पिछले धुलाई कदम "अंतिम धोने (W6)" और बाद में विश्लेषण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर के एक २०० µ एल नमूना बरकरार रखें । - एक ३५ µm फिल्टर के साथ एक ५०० µ एल स्पिन कॉलम को आईजीजी-agarose राल हस्तांतरण और µ रेफरेंस बफर के ३०० टेव एल के साथ दो बार मोतियों को धोने (तालिका 1) AcTEV के लिए (equilibration युक्त नहीं) । स्पिन कॉलम को बंद करें ।
- AcTEV के ५० यूनिट (10 µ एल) युक्त टेव रेफरेंस बफर के ३०० µ एल जोड़ें । एक ट्यूब में राल को जोड़ने से पहले मिश्रण तैयार करें ।
- एक thermomixer में मोतियों के साथ स्पिन कॉलम में एक 16 डिग्री सेल्सियस, 2 घंटे के लिए ३५० rpm के कॉलम धीरे कई बार हर 30 मिनट में पलटना ।
- स्पिन कॉलम खोलें, यह एक नया साफ १.५ मिलीलीटर ट्यूब में जगह है और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए १०० × जी में स्पिन eluate इकट्ठा करने के लिए ।
- शुष्क (उदाहरण के लिए) 10% (v/v) eluted नमूना (~ 25 µ एल) एक केंद्रापसारक वाष्पीकरण में और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री या अंय विश्लेषण के लिए उपयोग के लिए ।
- Aliquot शेष eluate (~ २७५ µ एल) ग्यारह १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में विभाजित (25 µ एल प्रत्येक), एक केंद्रापसारक वाष्पीकरण में सूखी, और दुकान पर-८० ° c ।
- विश्लेषण प्रक्रिया के रूप में अच्छी तरह के रूप में मानक एसडीएस द्वारा eluates-immunoblotting द्वारा पीछा पृष्ठ भर में बनाए रखा । नमूना तैयारी के लिए, कुल (T) की हाला ५० µ g, भार (L), के माध्यम से प्रवाह (FT), वाश 1 (W1) और २०० µ L वाश 6 (W6) द्वारा क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल निष्कर्षण16.
- 2x एसडीएस के 10 µ एल जोड़ें-पृष्ठ लोड हो रहा है बफर (तालिका 1) के लिए उपजी नमूनों और 25 µ एल के eluted सूखे नमूने । भंवर और एक गर्मी ब्लॉक में ९५ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए फोड़ा ।
- अलगाव प्रक्रिया की दक्षता का निर्धारण करने के लिए एंटी TOC159 एंटीबॉडी का उपयोग कर immunoblotting द्वारा कुल (टी), लोड (एल), प्रवाह के माध्यम से (फुट), धो 1 (W1), धो 6 (W6) और रेफरेंस (ई) का विश्लेषण करें ।
Representative Results
हम यहां ट्रांसजेनिक a. थालियाना संयंत्रों से एक नल टैग chloroplast लिफाफा प्रोटीन परिसर की शुद्धि के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया । के रूप में चित्रा 1एमें दिखाया गया है, पौधों 35S: ंतप-TOC159 के निर्माण के लिए इस परिसर को अलग करते थे, जबकि पौधों 35S: ंतप निर्माण एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया व्यक्त किया गया । चित्रा 1 बी नल की शुद्धि के विस्तृत कदम से पता चलता है-TOC159 प्रोटीन परिसरों मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पीछा करने के लिए बातचीत प्रोटीन की पहचान की अनुमति । immunoblot विश्लेषण (चित्रा 2, दाईं ओर) की पुष्टि करता है कि पृथक नल-TOC159 TOC75 और TOC परिसर के TOC33 के साथ सूचना का आदान प्रदान । chloroplast बाहरी झिल्ली कळेनासे KOC1 ज्ञात करने के लिए phosphorylate TOC159 भी सह नल के साथ अलग-TOC159 परिसर (चित्रा 2बी, दाईं ओर) । TIC110 की उपस्थिति से पता चलता है कि अलग नल-TOC159 जटिल भी टिक परिसर के घटकों में शामिल हैं । प्रोटीन आयात करने के लिए एक plastoglobule प्रोटीन असंबंधित के खिलाफ उठाया FBN1A एंटीबॉडी नल-TOC159 परिसर में संक्रमण के अभाव का संकेत नहीं पहचानता था । नकारात्मक नियंत्रण में, immunoprecipitated ंतप प्रोटीन सह नहीं था TOC के किसी के साथ अलग-टिक प्रोटीन (चित्रा 2, वाम पक्ष) और नल की विशिष्टता-TOC159 शुद्धि की पुष्टि ।
चित्रा 1 . योजना का निर्माण एवं संबध शुद्धिकरण कार्यविधि । (क). 35S: ंतप-TOC159 का निर्माण, एंकोडिंग ंतप-TOC159 Arabidopsis थालियाना मेंछुरा व्यक्त किया गया था । नकारात्मक नियंत्रण संयंत्रों 35S व्यक्त: ंतप निर्माण, नल-अकेले टैग एंकोडिंग । (ख). चरण वार संबध शुद्धिकरण प्रोटोकॉल झिल्ली अलगाव और solubilization के होते हैं, आईजीजी agarose इंयूनो-शुद्धि, बहाकर, टेव को छेड़ो दरार और रेफरेंस । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 . TOC159 प्रोटीन के साथ मिलकर समानता शुद्धि । N-टर्मिनली नल-टैग की गईं TOC159 ंतप-TOC15:ppi2 Arabidopsis पौधों और नल से शुद्ध प्रोटीन का दोहन से शुद्ध किया गया था: WT पौधों एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । कुल प्रोटीन अर्क (टी), solubilized झिल्ली प्रोटीन = लोड अंश (एल), (फुट) के माध्यम से प्रवाह, पहला और आखिरी वॉश अंशों (W1 और W6) और टेव eluate के 10% पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया गया । झिल्ली TOC159 (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950), और FBN1A (AT4G04020) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ जांच की थी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| बफ़र्स की तालिका | ||
| युग्मन बफर | NaHCO३ समायोजित करने के लिए पीएच ८.५ ०.१ एम ना2सह3 के साथ पीएच समायोजित |
१०० एमएम |
| बफ़र ब्लॉक कर रहा है | Tris – एचसीएल एचसीएल के साथ पीएच 8 को एडजस्ट करें । |
१०० एमएम |
| पंजाबियों बफर | ना2HPO4 KH२PO4 Nacl KCl एचसीएल के साथ पीएच ७.३ को एडजस्ट करें । |
४.३ एमएम १.४ एमएम १३७ २.७ |
| NaCl युग्मन बफर | युग्मन बफर Nacl |
1 मीटर |
| 2x पीस बफर | Tris-एचसीएल, एचसीएल के साथ पीएच ७.५ । Nacl NaF PMSF संयंत्र को छेड़ो अवरोधक कॉकटेल |
१०० एमएम २०० एमएम 5 मिमी 1 मिमी ०.२०% |
| 4x solubilisation समाधान | ग्लिसरॉल ट्राइटन-X100 |
४०% 3 |
| बफ़र A | 2x पीस बफर 1x पीस बफर 4x solubilisation समाधान |
१०० एमएल ५० एमएल 25 मिलीलीटर 25 |
| टेव रेफरेंस बफर | Tris-एचसीएल, एचसीएल के साथ पीएच 8 EDTA, एचसीएल के साथ पीएच 8 Nacl ग्लिसरॉल ट्राइटन-X100 डीटीटी |
50mm ०.५ एमएम १०० एमएम 10 ०.७५% 1 मिमी |
| 2x एसडीएस-पृष्ठ लोड हो रहा है बफर | एचसीएल के साथ Tris-एचसीएल का पीएच ६.८ Sds ग्लिसरॉल Bromophenol नीला डीटीटी |
०.१ मीटर 4 20 ०.२०% ०.२ मीटर |
तालिका 1. बफर व्यंजनों ।
Discussion
हम प्रदर्शन किया है कि एक कदम टैग शुद्धीकरण नल Arabidopsis TOC की शुद्धि के लिए एक विशिष्ट और कुशल विधि-टिक जटिल है । हालांकि नल टैग दो क्रमिक शुद्धिकरण कदम (आईजीजी-टेव के बाद calmodulin संबध शुद्धि द्वारा पीछा-दरार) की अनुमति होगी, हम मानते है कि कई मामलों में पहले संबध कदम टेव को छेड़ो दरार के बाद पर्याप्त होगा । हमारा लक्ष्य, TOC159, कम प्रचुर मात्रा में है और दूसरा calmodulin के शामिल किए जाने-संबध कदम जरूरत से ज्यादा प्रोटीन उपज है जो यह हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल से छोड़कर के लिए मुख्य कारण था कम । टेव-अपने आप में रेफरेंस एक अति विशिष्ट और कोमल शुद्धि कदम है कि केवल नल के साथ जुड़े संपर्क भागीदारों के साथ टैग लक्ष्य जारी करेंगे, जबकि आईजीजी राल के लिए गैर विशेष रूप से चिपके प्रोटीन दूषित वहां रह जाएगा । इस प्रकार, आईजीजी-संबध कदम के साथ संयोजन में, हमारे और शायद कई दूसरों के प्रयोजनों के लिए एक पर्याप्त कुशल शोधन में टेव रेफरेंस परिणाम ।
ध्यान रखा जाना चाहिए कि नल टैग का निर्माण vivo मेंपूरी तरह कार्यात्मक है । नल-टैगिंग संभावित प्रोटीन गतिविधि, स्थिरता या स्थानीयकरण पर बचके प्रभाव हो सकता है । TOC159 तीन डोमेन, एन टर्मिनल अंलीय डोमेन, केंद्रीय GTP-बाध्यकारी डोमेन और सी-टर्मिनल झिल्ली डोमेन, कि लंगर बाहरी chloroplast झिल्ली2में TOC159 के होते हैं । झिल्ली प्रविष्टि के साथ संभावित हस्तक्षेप से बचने के लिए, हम नल-टैग से जुड़े N-TOC159 के टर्मिनस । एन के लिए फ्यूजन-टर्मिनस नियम से अपवाद नहीं बल्कि है । कई प्रोटीन एन टर्मिनल लक्ष्यीकरण जानकारी शामिल है और इसलिए सी पर टैग द्वारा किया जाना चाहिए-टर्मिनस । हम TOC159 ppi2 उत्परिवर्ती के पूरक द्वारा vivo में कार्यात्मक है कि आश्वासन दिया (एक albino उत्परिवर्ती कमी TOC159) नल-TOC159 के साथ । हरे, जंगली प्रकार phenotype के बचाव संकेत दिया कि नल-TOC15915कार्यात्मक था ।
शुद्धि प्रोटोकॉल TOC159 के नए संपर्क भागीदारों, कि KOC1 और TIC5610,11शामिल की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । कुल में, 30 प्रोटीन के आसपास के परिसर का सुझाव है कि नए संपर्क भागीदारों अलग हो जाएगा और निकट भविष्य में विशेषता के साथ जुड़े थे । जब तक हम अत्यधिक नल-जटिल शुद्धिकरण के लिए टैग की सिफारिश, हम अभी भी कहना है कि एक यहां प्रस्तुत करने के लिए अतिरिक्त संस्करण मौजूद है और कुछ अनुप्रयोगों के लिए बहुत उपयोगी हो सकता है पसंद है ।
Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी रुचि नहीं घोषित करते हैं ।
Acknowledgments
काम स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (31003A_156998 और 31003A_176191) और Neuchâtel विश्वविद्यालय द्वारा अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaHCO3 | PanReac AppliChem | A0384 | |
| Tris | Biosolve | 0020092391BS | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7909 | |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | A2946 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | A2942 | |
| NaF | Sigma | S1509 | Toxic |
| PMSF | PanReac AppliChem | A0999 | Toxic |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | A0970 | |
| Triton X100 | Roche | 10789704001 | |
| Glycine | PanReac AppliChem | A1067 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043 | |
| Dithiothreitol (DTT) | PanReac AppliChem | A1101 | |
| SDS | PanReac AppliChem | A0675 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| HCl | VWR | 20252-290 | Corrosive |
| Sucrose | PanReac AppliChem | A3935 | |
| Murashige and Skoog medium with vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| Phytoagar | Duchefa Biochemie | P1003 | |
| Petri plate | Greiner Bio-one | 639102 | |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706 | |
| Ethanol | Fisher chemical | E/0600DF/15 | |
| Filter paper | Whatman | 10311804 | |
| Surgical tape | 3M | 1530-1 | |
| CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B) | GE Healthcare | 17-0430-01 | |
| Sintered glass filter | DURAN | 2515703 | |
| Centrifuge tube 50 mL | TPP | 91050 | |
| Purified immunoglobulin G (HsIgG) | MP Biomedicals | 855908 | |
| Rotating shaker | IKA | 4016000 | |
| NaN3 (sodium azide) | Sigma | 71290 | Toxic |
| Quick filtration material (Miracloth) | Merk-Millipore | 475855 | |
| Ultracentrifube XNP-80 | Beckman Coulter | A99839 | |
| Rotor SW 32 Ti | Beckman Coulter | 369650 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass teflon homogenizer (Potter) | Wheaton | 357426 | |
| Spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M1003 | |
| Filter 35µm for spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M513515 | |
| AcTEV | Invitrogen | 12575-015 | |
| Centrifugal evaporator (Speed Vac) | Eppendorf | 5305000100 | |
| FBN1A(PGL35) antibody | AgriSera | AS06 116 | RRID:AB_2247012 |
| Sand, Fontainebleau | VWR | 27460.295 |
References
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