Summary
אנו כאן מציגים פרוטוקול מוכחת ונבדק ולטיהור כלורופלסט מתחמי ייבוא חלבון (TOC-טיק מרוכב) בעזרת הברז-התג. פרוטוקול זיקה-בידוד בשלב אחד פוטנציאלי ניתן להחיל על כל חלבון, ניתן להשתמש כדי לזהות אינטראקציה עם שותפים חדשים באמצעות ספקטרומטר מסה.
Abstract
כלורופלסט להן דורש הייבוא של אלפי חלבונים גרעין מקודד לתוך פלסטידה. הייבוא של חלבונים אלה תלוי translocon החיצוני (TOC), ממברנות הפנימי של כלורופלסט (טיק). מתחמי תוכן עניינים, טיק multimeric, כנראה מכילים רכיבים לא ידוע עדיין. אחת המטרות העיקריות בתחום היא להקים את מצאי מלאה של רכיבי תוכן עניינים, טיק. עבור הבידוד של מתחמי תוכן עניינים-טיק וזיהוי של רכיבים חדשים, הקולטן preprotein ש-toc159 היה שונה N-סופני על ידי הוספת התג זיקה טנדם טיהור (ברז) וכתוצאה מכך ברז-TOC159. הברז-התג מיועד שני צעדים טיהור זיקה רציפים (ומכאן "טנדם זיקה"). הברז-התג בשימוש במחקרים אלה מורכב תחום N-מסוף IgG מחייב נגזר Staphylococcus aureus חלבון (ProtA) ולאחר מכן על-ידי פפטיד מחייב קלמודולין (CBP). בין אלה תגי קירבה שני, טבק לחרוט וירוס (אס) פרוטאז המחשוף האתר היה כלול. לכן, פרוטאז אס יכול לשמש עבור עדין • תנאי של מתחמי המכילות TOC159 לאחר קשירה IgG חרוזים. בפרוטוקול המובאת כאן, השלב השני של טיהור קלמודולין-זיקה הושמט. פרוטוקול טיהור מתחילה עם הכנה, solubilization של ממברנות הסלולר הכולל. לאחר הטיפול-דטרגנט, החלבונים ממברנה solubilized מודגרת עם חרוזי IgG immunoisolation של מתחמי ברז TOC159-המכילים. על הכריכה, כביסה נרחב, מתחמי המכיל ברז-TOC159 ביקע, שוחררו החרוזים IgG באמצעות את פרוטאז אס לפיו יוסר התחום S. aureus IgG מחייב. המערבי סופג של מבודדים מתחמי המכילות TOC159 יכול לשמש כדי לאשר הנוכחות של חלבונים TOC, טיק ידוע או חשודים. חשוב מכך, מתחמי המכילות TOC159 ששימשו בהצלחה כדי לזהות רכיבים חדשים של מתחמי תוכן עניינים, טיק ספקטרומטר מסה. פרוטוקול זה אנו מציגים באופן פוטנציאלי מאפשר הבידוד יעיל של כל חלבון ממברנה מכורך מורכבים כדי לשמש לצורך זיהוי הרכיבים עדיין לא ידוע באמצעות ספקטרומטר מסה.
Introduction
הצמחים תלויים מהכלורופלסט על פוטוסינתזה ועל -הגדילה photoautotrophic1. הרוב המכריע של כלורופלסט חלבונים מקודד בגרעין, מסונתז ציטוזול, המיובאים של כלורופלסט דרך מתחמי טיק ו TOC ממברנות המעטפה2. הליבה של תוכן העניינים מורכבים מורכב בערוץ מוליכי חלבון Toc75 ואת שני קולטן GTPases Toc33 Toc1593,4,5. TOC159 חיוני להן של מהכלורופלסט, ומתווך הצטברות גדולה של חלבונים הקשורים הפוטוסינתזה6. המתחם טיק כולל הערוץ מוליכי חלבון TIC20, כמו גם7,TIC110, TIC408. לאחרונה, התקה חלבון 1MD מורכבים-קרום המעטפה הפנימית היה מבודד, הכיל רכיבים לא מזוהה בעבר9, שאחד מהם היה TIC56. לאחרונה במשותף בודדנו TIC56 של מורכבות באמצעות פרוטוקול טיהור זיקה ברז-TOC159 מד א 1. הנתונים הצביעו על חפיפה מבנית בין את מתחמי TOC/טיק "קנונית" 1 מד א מורכב10. בעבר לא ידוע רכיבים כגון KOC1 אותרו גם כמתואר שותפים חדשים האינטראקציה של מתחמי תוכן עניינים, טיק בשיטת הברז-פה10,11.
לכן, הטיהור ברז-תג הוא שיטה יעילה עבור הבידוד של חלבון מתחמי וזיהוי של שותפים אינטראקציה באמצעות ניתוח spectrometric המוני הבאים12. התג הברז מורכב משני IgG מחייב חזרה מפפטיד מחייב קלמודולין (CBP) המופרדים של טבק לחרוט וירוס (אס) פרוטאז המחשוף באתר. השיטה המקורית, המורכב שלב טיהור IgG-זיקה ואחריו אס המחשוף, קלמודולין עוקבות-כרומטוגרפיית זיקה מותר הטיהור מקורית של חלבון טהור מאוד וגדולים מתחמי13,14 . אנחנו פשוטה ההליך, הדגימו כי מתחמי חלבון המכיל TOC159 אפשר גם לטהר ביעילות באמצעות רק IgG-זיקה טיהור השלב ואחריו אס-המחשוף • תנאי15. מניסיוננו, העדרו של השלב קלמודולין-זיקה, גרמו תשואות גבוהות, ולכן עשויים להיות מתאימים חלבונים נמוכה שפע.
בקיצור, אנחנו מהונדס מהונדס יציב לבנה א קווים ביטוי ברז-TOC159 ppi2 (toc159 KO מוטציה) רקע והקימו זה כמקור אמין לטיהור של מתחמי תוכן עניינים-טיק. הפרוטוקול עבור הבידוד של המתחם TOC-טיק מתחיל עם המגון החומר הצמח במאגר ללא חומרי ניקוי. לאחר צנטריפוגה, תגובת שיקוע נמחקת. גלולה המכילה את השבר הממברנה הכולל הוא solubilized באמצעות מאגר המכיל חומרי ניקוי. לאחר שלב אולטרה-צנטריפוגה, תגובת שיקוע המכיל solubilized מתחמי תוכן עניינים-טיק מוחל IgG-השרף לטיהור זיקה. לאחר מספר הכביסה שלבים, • תנאי מתבצעת באמצעות מאגר המכיל פרוטאז אס כדי באופן סלקטיבי קליב במורד הזרם IgG-איגוד קבוצות המחשבים ובעדינות לשחרר מכלולים המכילים TOC159 מקורי. ניתן לנתח את eluate אס ישירות על-ידי המערב סופג או ספקטרומטר מסה כדי לזהות השותפים האינטראקציה של TOC15910,11,15. השיטה גם שימש כדי לזהות שינויים post-translational של TOC15915. בעתיד, מתחמי המכילות TOC159 מקורי עשוי לשמש ללימודי מבניים באמצעות מיקרוסקופ cryoelectron.
Protocol
1. הכנת הצמחים תודרנית
- להכנת 1 ליטר של חצי כוח של Murashige ו- Skoog (MS) ויטמינים כולל בינוני עם 1% סוכרוז ולהתאים את ה-pH ל 5.7 עם אשלגן הידרוקסידי (KOH). להוסיף 0.8% phytoagar והחיטוי במשך 20 דקות על 120 מעלות צלזיוס.
- יוצקים 75 מ ל MS בינוני לכל צלחת פטרי (קוטר 14.5 ס"מ, גובה 3 ס מ) ולאפשר את התמצקות לשעה.
- להוסיף 30 מ"ג של זרעים תודרנית לבנה צינור microfuge 1.5 mL, משטח לחטא עם אתנול 70% (v/v) המכילה 0.05% (v/v) טריטון X-100 במשך 5 דקות, ואחריו 100% אתנול (v/v) במשך 10 דקות להסיר את האתנול.
- להעביר את הזרעים נייר סינון סטרילי לייבוש. מפזרים את הזרעים סטיריליים באופן שווה על גבי צלחת MS (גנוטיפ לכל דורש לפחות 8-10 צלחות), חותם כל צלחת עם הדבקה.
- דגירה הלוחות ב 4 מעלות צלזיוס למשך יומיים בחושך כדי לסנכרן את נביטת הזרעים. העברה לתא צמיחה עם מחזור אור הבאים: 8 שעות של 120 µmol מ'−2 s− 1 אור, ו- h 16 של אפל ב 22-20 º C.
2. הכנת חרוזים HsIgG Agarose
- להשעות agarose ברומיד מופעל חרוזים (4 גרם) ב- 100 מ של 1 מ מ HCl, תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- להעביר את החרוזים agarose לתוך מסנן זכוכית sintered, לשטוף תחת ואקום עם 100 מ של 100 מ מ HCl וחזור על 2 - 3 פעמים.
הערה: Precool הפתרון שטיפת 4 ° C. - Resuspend את agarose חרוזים ב 1 מ"ל של קר 100 מ מ HCl ואת העברת שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ. שטוף את המסנן sintered זכוכית עם 3 מ ל 100 מ מ HCl, להעביר את הנוזל הצינור אותו.
- ספין-× 400 g עבור 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה.
הערה: לא decant את הצינור. - Resuspend את החרוזים ב 50 מ של צימוד מאגר (טבלה 1); מערבבים בקצרה, ואז לסובב ב × 400 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
- להמיס 50 מ"ג של הומו ספיינס lyophilized IgG (Hs-IgG) 10 מ"ל צימוד המאגר, לערבב בעדינות את החרוזים agarose, דגירה שייקר רוטרי בן לילה ב 4 º C.
- ספין-× 400 g עבור 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה.
- לשטוף את החרוזים IgG-agarose עם 50 מ של צימוד מאגר ומסתובב ב × 400 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
- Resuspend את החרוזים IgG-agarose עם 50 מ של מאגר חסימה (טבלה 1) ומסתובב ב × 400 g למשך 5 דקות ב 4 º C. חזור על פעם אחת.
- Resuspend איג-agarose חרוזים ב 50 מ של מאגר חסימה, לסובב את התערובת על 2 h ב- RT ו ספין-× 400 g עבור 5 דקות ב 4 º C.
- הסר את תגובת שיקוע, resuspend את החרוזים IgG-agarose ב- 200 מ של NaCl צימוד מאגר (טבלה 1).
- כדי לחסום כל הקבוצות ברומיד cross-linking הנותרים, לשטוף את החרוזים IgG-agarose עם 100 מ של 0.1 M גליצין-HCl, pH 2.8. ספין-× 400 g עבור 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע. לשטוף עם 0.2 מ' גליצין-HCl, pH 2.8, ספין-× 400 g עבור 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע. לבסוף, יש לשטוף את החרוזים IgG-agarose עם 200 מ של מים הנדסה גנטית.
- לשטוף את החרוזים IgG-agarose עם 200 מ של מים הנדסה גנטית, ולאחר מכן 200 מ ל מאגר PBS (טבלה 1).
- Resuspend את החרוזים IgG-agarose ב- 20 מ של PBS מאגר עם נאן 0.01%3 (אזיד הנתרן) ולאחסן ב 4 º C.
3. בידוד, Solubilization של השבר ממברנה
- לטחון 10 גרם של בן שלושה שבועות שתילים לבנה א בחנקן נוזלי באמצעות ומכתש קר עם חול.
- הוסף 20 מ של טחינת מאגר (טבלה 1) 10 גרם של רקמת הקרקע הקרה, מערבבים היטב, להפשיר על קרח.
- לסנן את homogenate באמצעות שתי שכבות של חומר סינון מהיר לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ. משרים את חומר סינון מהיר עם טחינת מאגר לפני הסינון.
- צנטריפוגה פילטרט של 10 דקות ב × 1,500 גרם 4 ° C, העברת תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה חרוט צוננת 50 מ ל, לחזור על אותו שלב פעם נוספת ולאסוף את תגובת שיקוע. שומרים על מדגם µL 200 של "השבר הכולל" ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס לניתוח בשלב מאוחר יותר
- להעביר את תגובת שיקוע mL 38.50 קר ultracentrifuge צינורות, טופ עד 35 מ עם מאגר שחיקה קר. צנטריפוגה עבור h 1 × 100,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס ultracentrifuge.
- להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ. שומרים על מדגם µL 200 של "שבר מסיסים", חנות ב-80 מעלות צלזיוס לניתוח בשלב מאוחר יותר.
- מחדש להשעות בגדר ירוקים באמצעות מהמגן טפלון זכוכית, במאגר שחיקה. צנטריפוגה עבור h 1 × 100,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס ב ultracentrifuge ולמחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend בגדר ירוק ב- 18.75 מ ל 1 x טחינת המאגר באמצעות מהמגן טפלון זכוכית ולהוסיף 9.375 מ ל 1 x טחינת מאגר.
- להוסיף מ 9.375 ל- 4 פתרון x solubilisation (טבלה 1) (מכיל הנוזל TX-100) לתת 37.5 מ ל, תקופת דגירה של 30 דקות על "מטרף מסתובב"-4 מעלות צלזיוס.
- צנטריפוגה עבור h 1 × 100,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס ultracentrifuge. להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ. שומרים על מדגם 200 µL של תגובת שיקוע (העתיד "טען שבר"), חנות ב-80 מעלות צלזיוס לניתוח בשלב מאוחר יותר.
- Resuspend בגדר ב- 37.5 מ של שחיקה מאגר. שומרים על המדגם של חלק לא מסיסים וחנות ב-80 מעלות צלזיוס
4. Immunoprecipitation
- Equilibrate µL 100 של שרף IgG-agarose ארוזים במאגר A (טבלה 1) ומסתובב ב × 100 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
- הסר את תגובת שיקוע, resuspend שרף IgG-agarose ב µL 100 מאגר A-4 מעלות צלזיוס.
- להעביר את השרף IgG-agarose שטף mL 37.5 של ממברנות solubilized, דגירה בן לילה על מטרף מסתובבת בשפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ ל- 4 מעלות צלזיוס.
- משקעים IgG-agarose שרף ב × 100 g למשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה. שומרים על מדגם µL 200 של הזרם"דרך" ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס לניתוח בשלב מאוחר יותר.
- רוחצים את השרף IgG-agarose ב- 37.5 מ של מאגר A את תקופת דגירה של 10 דקות על מטרף מסתובב.
- משקעים שרף IgG-agarose ב × 100 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, להסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה הוסף 5 מ של שחיקה מאגר של שפופרת צנטריפוגה 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב 100 × g, 4 ° C, 5 דק שמור מדגם µL 200 של"כביסה 1", לאחסן ב- 80 ° C לניתוח בשלב מאוחר יותר.
- חזור על 5 mL שטיפה שלב שלוש פעמים עם מאגר א
- לבצע אחרונה שני השלבים כביסה בלי מעכבי (NaF, מעכבי פרוטאז ו- PMSF)
הערה: מעכבי כבר לא נדרש בשלב זה, מושמט כדי להפחית את העלות. שומרים על מדגם 200 µL שעבר כביסה שלב "הסופי (W6)"רחיצת ואת החנות ב-80 מעלות צלזיוס לניתוח בשלב מאוחר יותר. - להעביר את השרף IgG-agarose עמודה ספין 500 µL עם מסנן מיקרומטר 35 ולשטוף את החרוזים פעמיים עם 300 µL אס • תנאי מאגר (טבלה 1) (לא כולל AcTEV) עבור equilibration. סגור את העמודה ספין.
- להוסיף 300 µL אס • תנאי מאגר המכיל 50 יחידות (10 µL) של AcTEV. מכינים את תערובת צינור לפני הוספת השרף.
- דגירה העמודה ספין עם חרוזים ב thermomixer ב 16 ° C, 350 סל"ד עבור ה 2 היפוך העמודה בעדינות מספר פעמים בכל 30 דקות.
- פתח את העמודה ספין, מניחים אותה צינור נקי 1.5 mL החדש ומסתובב ב × 100 g למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את eluate.
- יבש (למשל) 10% (v/v) מדגם eluted (~ 25 µL) במפזר צנטריפוגלי והשימוש ספקטרומטר מסה או אחרים ניתוח נוסף.
- Aliquot eluate הנותרים (~ 275 µL) מחולק ל 11 צנטריפוגה 1.5 mL צינורות (25 µL כל), נייבש המאייד צנטריפוגלי, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
- לנתח את הדגימות נשמרים לאורך כל ההליך, כמו גם את eluates על ידי תקן מרחביות-דף ואחריו immunoblotting. בשביל הכנת הדוגמא, µg 50 precipitate של הכולל (T), עומס (L), הזרימה (FT), לשטוף 1 (W1) ו- µL 200 של שטיפת 6 (W6) על ידי מיצוי כלורופורם/מתנול16.
- להוסיף 10 µL של 2 x מרחביות-דף טעינת מאגר (טבלה 1) כדי הדגימות precipitated µL 25 eluted דגימת יבשים. מערבולת ומרתיחים במשך 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום.
- ניתוח הכולל (T), עומס (L), הזרימה (FT), שטיפת 1 (W1), לשטוף 6 (W6) • תנאי (E) על ידי immunoblotting באמצעות נוגדנים anti-TOC159 כדי לקבוע את היעילות של ההליך בידוד.
Representative Results
אנו כאן המתואר פרוטוקול לטיהור של חלבון מעטפת כלורופלסט מתויג הברז מורכב מ הטרנסגניים לבנה א צמחים. כפי שמוצג באיור 1א, צמחים לבטא את 35S:NTAP-TOC159 לבנות שימשו כדי לבודד את מתחם זה בעוד צמחים לבטא הבונה 35S:NTAP שימשו פקד. איור 1 B מציג את השלבים המפורטים של הטיהור של ברז-TOC159 חלבון מתחמי ואחריו ספקטרומטר מסה כדי לאפשר זיהוי חלבונים אינטראקציה. הניתוח immunoblot (איור 2, בצד ימין) מאשרת כי הברז מבודד-TOC159 אינטראקציה עם TOC75 ו- TOC33 של המתחם תוכן עניינים. קינאז הממברנה החיצונית כלורופלסט KOC1 ידוע phosphorylate TOC159 גם שותף מבודדת עם ברז-TOC159 קומפלקס (איור 2B, בצד ימין). הנוכחות של TIC110 מגלה כי המתחם מבודד ברז-TOC159 מכיל גם מרכיבי הקומפלקס טיק. הנוגדן FBN1A שהועלו נגד חלבון plastoglobule שאינן קשורות ייבוא חלבון לא זיהה המתחם ברז-TOC159 המציין היעדר מציג. בפקד שלילית, immunoprecipitated NTAP חלבון לא לבודד במשותף עם כל אחד החלבונים TOC-טיק (איור 2, צד שמאל) ומבטיחה יחודיות של הטיהור ברז-TOC159.
איור 1 . ערכה של המבנים ושל הליך טיהור אהדה. (א). 35S:NTAP-TOC159 לבנות, קידוד NTAP-TOC159 היה stably לידי ביטוי תודרנית לבנה. בקרה שלילית צמחים הביע הבונה 35S:NTAP, קידוד את הברז-תג לבד. (ב)-פרוטוקול טיהור צעד נבון זיקה מורכב שוטף בידוד, solubilization, IgG agarose חיסונית-טיהור, קרום, המחשוף פרוטאז אס ו • תנאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . טנדם טיהור זיקה של החלבון TOC159. N-סופני מתויג ברז TOC159 היה טהור של NTAP-TOC15:ppi2 תודרנית צמחים וברז חלבון מטוהרים מצמחים ברז: WT שימש פקד שלילי. סה כ חלבון תמציות (T), solubilized קרום חלבונים = עומס שבר (L), הזרימה (FT), הראשונה והאחרונה רוחצים שברים (W1 וגם W6) את 10% eluate אס נותחו על ידי סופג המערבי. הקרום נבדקה עם הנוגדנים נגד TOC159 (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950), ו- FBN1A (AT4G04020). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| טבלה של מאגרי | ||
| מאגר צימוד | NaHCO3 להתאים את ה-pH 8.5 להתאים pH עם 0.1 M נה2CO3 |
100 מ מ |
| חסימת מאגר | טריס-HCl להתאים את ה-pH 8 עם HCl. |
100 מ מ |
| מאגר PBS | נה2HPO4 ח'2PO4 NaCl אשלגן כלורי להתאים את ה-pH 7.3 עם HCl. |
4.3 mM 1.4 מ מ 137 2.7 |
| NaCl צימוד מאגר | מאגר צימוד NaCl |
1 מ' |
| 2 X טחינת מאגר | טריס-HCl, pH 7.5 עם HCl. NaCl NaF PMSF קוקטייל מעכב פרוטאז צמח |
100 מ מ 200 מ מ 5 מ מ 1 מ מ 0.20% |
| 4 X solubilisation פתרון | גליצרול טריטון-X100 |
40% 3% |
| מאגר A | 2 X טחינת מאגר 1 X טחינת מאגר 4 X solubilisation פתרון |
100 מ 50 מ 25 מ 25% |
| • תנאי אס מאגר | טריס-HCl, pH 8 עם HCl EDTA, pH 8 עם HCl NaCl גליצרול טריטון-X100 DTT |
50 מ מ 0.5 מ מ 100 מ מ 10% 0.75% 1 מ מ |
| 2 x הטעינה מרחביות-דף מאגר | טריס-HCl pH 6.8 עם HCl למען חברה דמוקרטית גליצרול Bromophenol כחול DTT |
0.1 M 4% 20% 0.20% 0.2 מ' |
טבלה 1. מאגר מתכונים.
Discussion
להדגים כי צעד אחד טיהור תג הקשה היא שיטה יעילה וספציפית ולטיהור המתחם TOC-טיק תודרנית . למרות הברז-התג יאפשר שני צעדים טיהור רצופים (IgG-ואחריו קלמודולין טיהור זיקה לאחר אס פרוטאז-המחשוף), אנו מאמינים כי במקרים רבים הצעד זיקה הראשון ואחריהם אס פרוטאז מחשוף יהיה מספיק. המטרה שלנו, TOC159, הוא נמוך שופע ונחלשו ההכללה של השלב השני קלמודולין-זיקה יתר על המידה את התשואה חלבון אשר היה הסיבה העיקרית למעט זה של הפרוטוקול הנוכחי שלנו. • כשלעצמו אס-תנאי היא צעד מאוד מסוימת, עדינה טיהור זה רק תשחרר המטרה מתויג ברז יחד עם שותפים המשויך אינטראקציה בזמן שמזהם את החלבונים הלא ספציפית נדבקות השרף IgG יישארו שם. וכך, בשילוב עם הצעד IgG-זיקה, • תנאי אס התוצאה הוא לטיהור מספיק יעיל למטרות שלנו, כנראה רבים אחרים.
חייבים להקפיד כי הבונה מתויג ברז היא מתפקדת במלואה בתוך vivo. תיוג סטפס יכול להיות פוטנציאל מהשפעות פעילות החלבון, יציבות או לוקליזציה. TOC159 כוללת שלושה תחומים, תחום חומצי N-מסוף, תחום GTP-איגוד מרכזי, בתחום ממברנה ג-טרמינל, זה עוגנים TOC159 הממברנה החיצונית כלורופלסט2. כדי למנוע הפרעה פוטנציאל ממברנה הכניסה, אנחנו התמזגו הברז-תג קצה אמיני של TOC159. פיוז'ן אל קצה אמיני הוא מעדיף את החריג יותר מהכלל. חלבונים רבים מכילים מידע מיקוד של N-מסוף ו לכן צריך מתויג מאת-קצה קרבוקסילי. אנחנו הבטיח כי TOC159 הוא פונקציונלי ויוו מאת קומפלמנטציה למוטציה ppi2 (חסר TOC159 מוטציה לבקן) עם ברז-TOC159. החילוץ של הירוקה, פראי סוג פנוטיפ ציינו כי הברז-TOC159 היה פונקציונלי15.
פרוטוקול טיהור שימש כדי לזהות שותפים חדשים האינטראקציה של TOC159, אשר כללה10,KOC1, TIC5611. בסך הכל, כ-30 חלבונים היו קשורים עם המתחם מציע את האינטראקציה חדש שותפים? כן, מאופיין בעתיד הקרוב. בעוד אנו ממליצים בחום את הברז-התג לטיהור מורכבים, ברצוננו עדיין כי גירסאות נוספות לזו המוצגת כאן קיים וכי יכול להיות מאוד שימושי עבור יישומים מסוימים.
Disclosures
המחברים מצהירים אין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
העבודה נתמכה על ידי מענקים שוויצרי הקרן הלאומית למדע (31003A_156998 ו- 31003A_176191) על ידי האוניברסיטה של העיר נוישאטל.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaHCO3 | PanReac AppliChem | A0384 | |
| Tris | Biosolve | 0020092391BS | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7909 | |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | A2946 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | A2942 | |
| NaF | Sigma | S1509 | Toxic |
| PMSF | PanReac AppliChem | A0999 | Toxic |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | A0970 | |
| Triton X100 | Roche | 10789704001 | |
| Glycine | PanReac AppliChem | A1067 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043 | |
| Dithiothreitol (DTT) | PanReac AppliChem | A1101 | |
| SDS | PanReac AppliChem | A0675 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| HCl | VWR | 20252-290 | Corrosive |
| Sucrose | PanReac AppliChem | A3935 | |
| Murashige and Skoog medium with vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| Phytoagar | Duchefa Biochemie | P1003 | |
| Petri plate | Greiner Bio-one | 639102 | |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706 | |
| Ethanol | Fisher chemical | E/0600DF/15 | |
| Filter paper | Whatman | 10311804 | |
| Surgical tape | 3M | 1530-1 | |
| CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B) | GE Healthcare | 17-0430-01 | |
| Sintered glass filter | DURAN | 2515703 | |
| Centrifuge tube 50 mL | TPP | 91050 | |
| Purified immunoglobulin G (HsIgG) | MP Biomedicals | 855908 | |
| Rotating shaker | IKA | 4016000 | |
| NaN3 (sodium azide) | Sigma | 71290 | Toxic |
| Quick filtration material (Miracloth) | Merk-Millipore | 475855 | |
| Ultracentrifube XNP-80 | Beckman Coulter | A99839 | |
| Rotor SW 32 Ti | Beckman Coulter | 369650 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass teflon homogenizer (Potter) | Wheaton | 357426 | |
| Spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M1003 | |
| Filter 35µm for spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M513515 | |
| AcTEV | Invitrogen | 12575-015 | |
| Centrifugal evaporator (Speed Vac) | Eppendorf | 5305000100 | |
| FBN1A(PGL35) antibody | AgriSera | AS06 116 | RRID:AB_2247012 |
| Sand, Fontainebleau | VWR | 27460.295 |
References
- Jarvis, P., López-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Kessler, F., Schnell, D. Chloroplast biogenesis: diversity and regulation of the protein import apparatus. Current opinion in cell biology. 21 (4), 494-500 (2009).
- Schnell, D. J., Kessler, F., Blobel, G. Isolation of components of the chloroplast protein import machinery. Science. 266 (5187), 1007-1012 (1994).
- Kessler, F., Blobel, G., Patel, H. A., Schnell, D. J. Identification of two GTP-binding proteins in the chloroplast protein import machinery. Science. 266 (5187), 1035-1039 (1994).
- Jarvis, P., et al. An Arabidopsis mutant defective in the plastid general protein import apparatus. Science. 282 (5386), 100-103 (1998).
- Bauer, J., et al. Essential role of the G-domain in targeting of the protein import receptor atToc159 to the chloroplast outer membrane. The Journal of cell biology. 159 (5), 845-854 (2002).
- Kovacs-Bogdan, E., Soll, J., Bolter, B. Protein import into chloroplasts: the Tic complex and its regulation. Biochimica et biophysica acta. 1803 (6), 740-747 (2010).
- Nakai, M. The TIC complex uncovered: The alternative view on the molecular mechanism of protein translocation across the inner envelope membrane of chloroplasts. Biochimica et biophysica acta. 1847 (9), 957-967 (2015).
- Kikuchi, S., et al. Uncovering the protein translocon at the chloroplast inner envelope membrane. Science. 339 (6119), 571-574 (2013).
- Kohler, D., et al. Characterization of chloroplast protein import without Tic56, a component of the 1-megadalton translocon at the inner envelope membrane of chloroplasts. Plant physiology. 167 (3), 972-990 (2015).
- Zufferey, M., et al. The novel chloroplast outer membrane kinase KOC1 is a required component of the plastid protein import machinery. The Journal of biological chemistry. 292 (17), 6952-6964 (2017).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Rohila, J. S., Chen, M., Cerny, R., Fromm, M. E. Improved tandem affinity purification tag and methods for isolation of protein heterocomplexes from plants. The Plant journal. 38 (1), 172-181 (2004).
- Rohila, J. S., et al. Protein-protein interactions of tandem affinity purified protein kinases from rice. PloS one. 4 (8), 6685 (2009).
- Agne, B., et al. The acidic A-domain of Arabidopsis TOC159 occurs as a hyperphosphorylated protein. Plant physiology. 153 (3), 1016-1030 (2010).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
