Summary
Her præsenterer vi en gennemprøvet og testet protokol til rensning af grønkorn protein import komplekser (TOC-TIC kompleks) ved hjælp af tryk-tag. Et-trins affinitet-isolation protokollen kan potentielt anvendes til enhver protein og bruges til at identificere nye interaktion partnere ved massespektrometri.
Abstract
Grønkorn Biogenese kræver import af tusindvis af kerne-kodet proteiner i plastid. Import af disse proteiner, afhænger af translocon på den ydre (TOC) og indre (TIC) grønkorn membraner. Indholdsfortegnelsen og TIC komplekser er multimeriske og indeholder sandsynligvis endnu ukendt komponenter. En af de vigtigste mål i feltet er den komplette fortegnelse over indholdsfortegnelsen og TIC komponenter. Til isolering af TOC-TIC komplekser og identifikation af nye komponenter ændret den preprotein receptor TOC159 har været N-terminalt ved tilsætning af tandem affinitet rensning (TAP) tag resulterer i TAP-TOC159. TAP-tag er designet til to sekventielle affinitet rensning trin (dermed "tandem affinitet"). TAP-tag bruges i disse undersøgelser består af en N-terminale IgG-bindende domæne afledt af Staphylococcus aureus Protein en (ProtA) efterfulgt af en calmodulin-bindende peptid (CBP). Mellem disse to affinitet tags, en tobak etch virus (TEV) protease kavalergang websted er medtaget. Derfor, TEV protease kan bruges til blid eluering af TOC159-holdige komplekser efter binding til IgG perler. I protokollen præsenteres her, var det andet Calmodulin-affinity rensning skridt udeladt. Rensning-protokollen starter med forberedelse og oploesning af samlede cellemembraner. Efter vaskemiddel-behandling inkuberes solubilized Membranproteiner med IgG perler for immunoisolation af TAP-TOC159-holdige komplekser. Bindende og omfattende vask, er TAP-TOC159 indeholdende komplekser kløvet og frigivet fra IgG perlerne ved hjælp af TEV protease hvorved S. aureus IgG-bindende domæne er fjernet. Western blotting af den isolerede TOC159-holdige komplekser kan bruges til at bekræfte tilstedeværelsen af kendt eller formodet TOC og TIC proteiner. Endnu vigtigere, har de TOC159-holdige komplekser været anvendt med succes til at identificere nye komponenter til indholdsfortegnelsen og TIC komplekser af massespektrometri. Den protokol, som vi præsenterer potentielt giver effektiv isolering af enhver membran-bundet protein kompleks skal bruges til identifikation af endnu ukendte komponenter af massespektrometri.
Introduction
Planter afhænger grønkorn for fotosyntese og photoautotrophic vækst1. Langt størstedelen af grønkorn proteiner er kodet i kernen, syntetiseret i cytosol og importeres til chlorplasttransitpeptidsekvensen via TIC og TOC komplekser i kuvert membraner2. Kernen i indholdsfortegnelsen kompleks består af Toc75 protein-ledende kanal og to receptor GTPases Toc33 og Toc1593,4,5. TOC159 er afgørende for Biogenese af grønkorn og formidler en massiv ophobning af fotosyntese-associerede proteiner6. TIC-komplekset består af det TIC20 protein-ledende kanal samt TIC110 og TIC407,8. For nylig en 1MD protein translokation kompleks på den inderste kuvert membran blev isoleret og indeholdt tidligere uidentificerede komponenter9, hvoraf den ene var TIC56. Vi isoleret for nylig Co TIC56 af de 1 MDa komplekse ved hjælp af tryk-TOC159 affinitet rensning protokollen. Dataene, der er angivet en strukturel overlapning mellem de "canonical" TOC/TIC komplekser og 1 MDa komplekse10. Tidligere blev ukendt komponenter som KOC1 også identificeret som nye interaktion partnere af de TOC og TIC komplekser ved hjælp af tryk-metoden beskrevet her10,11.
Således er TAP-tag rensning en effektiv metode til isolering af proteinkomplekser og identifikation af interagerende partnere med efterfølgende massespektrometrisk analyse12. Tryk på tag består af to IgG bindende gentager adskilt fra en calmodulin-bindende peptid (CBP) af en tobak etch virus (TEV) protease kavalergang site. Den oprindelige metode, bestående af en IgG-affinitet rensning skridt efterfulgt af TEV kavalergang og efterfølgende calmodulin-affinitet kromatografi tilladt indfødte rensning af store og meget ren protein komplekser13,14 . Vi har forenklet proceduren og demonstreret proteinkomplekser TOC159-holdige også renset, effektivt ved hjælp af kun den IgG-affinitet rensning skridt efterfulgt af TEV-kavalergang til eluering15. Vores erfaring, udeladelsen af trinnet calmodulin-affinitet resulterede i højere udbytter og kan derfor være hensigtsmæssigt for lav overflod proteiner.
Kort sagt, vi udviklet stabile transgene A. thaliana linjer udtryk for TAP-TOC159 i ppi2 (toc159 KO mutant) baggrund og etablerede det som en pålidelig kilde til rensning af TOC-TIC komplekser. Protokol for isolation af TOC-TIC komplekse begynder med homogenisering af plantemateriale i et vaskemiddel-fri buffer. Efter centrifugering, er supernatanten kasseret. Den pellet, der indeholder den samlede membran fraktion er oploeses ved hjælp af et vaskemiddel-holdige buffer. Efter en ultra-centrifugering skridt anvendes supernatant indeholdende solubilized TOC-TIC komplekser til IgG-harpiks til affinitet rensning. Efter flere vaske trin, eluering udføres ved hjælp af en TEV protease-holdige buffer til selektivt kløver nedstrøms af IgG-bindende domæner og forsigtigt frigøre indfødte TOC159-holdige komplekser. TEV eluatet kan analyseres direkte ved Western blotting eller massespektrometri til at identificere interaktion partnere TOC15910,11,15. Metoden er også blevet brugt til at identificere posttranslationelle modifikationer af TOC15915. I fremtiden kan indfødte TOC159-holdige komplekser bruges til strukturelle undersøgelser ved hjælp af cryoelectron mikroskopi.
Protocol
1. forberedelse af Arabidopsis planter
- Forberede 1 L med halv styrke på Murashige og Skoog (MS) medium herunder vitaminer med 1% saccharose og ph indstilles til 5.7 med kaliumhydroxid (KOH). Tilføje 0,8% af phytoagar og autoklave i 20 min. ved 120 ° C.
- Hæld 75 mL af MS medium pr. Petri plade (diameter 14,5 cm, højde 3 cm) og tillade størkning for 1 h.
- Tilføje 30 mg Arabidopsis thaliana frø til en 1,5 mL mikrofuge rør, og overfladen sterilisere med 70% (v/v) ethanol indeholdende 0,05% (v/v) Triton X-100 i 5 min, efterfulgt af 100% (v/v) ethanol i 10 min. Fjern ethanol.
- Overføre frøene til sterile filtrerpapir for tørring. Drys de steriliserede frø jævnt på en MS tallerken (hver genotype kræver mindst 8-10 plader), og forsegle hver plade med kirurgisk tape.
- Inkuber plader ved 4 ° C i to dage i mørke til at synkronisere frø spiring. Overførsel til en vækst kammer med følgende lys cyklus: 8 af 120 µmol m−2 s1 lys, og 16 h af mørke på 22-20 ° C.
2. forberedelse af HsIgG Agarosen perler
- Suspendere CNBr-aktiveret Agarosen perler (4 g) i 100 mL af 1 mM HCl og Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur.
- Overføre Agarosen perler i et sintret glas filter, vaskes under vakuum med 100 mL 100 mm HCl og Gentag 2 - 3 gange.
Bemærk: Precool vaskeopløsning til 4 ° C. - Resuspend Agarosen perler i 1 mL koldt 100 mM HCl og overførsel til en 50 mL konisk centrifugeglas. Vask filteret sintret glas med 3 mL af 100 mM HCl og væsken overføres til det samme rør.
- Spin på 400 × g i 5 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten med en pipette.
Bemærk: Ikke dekanteres røret. - Resuspend perlerne i 50 mL af kobling buffer (tabel 1); Bland kortvarigt, og derefter dreje på 400 × g i 5 min. ved 4 ° C.
- 50 mg af frysetørrede Homo sapiens IgG (Hs-IgG) opløses i 10 mL af kobling buffer, bland Agarosen perler forsigtigt, og Inkuber i Rotationsapparat natten over ved 4 ° C.
- Spin på 400 × g i 5 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten med en pipette.
- Vaske IgG-Agarosen perler med 50 mL af kobling buffer og spin på 400 × g i 5 min. ved 4 ° C.
- Resuspend IgG-Agarosen perler med 50 mL blokerende buffer (tabel 1) og spin på 400 × g i 5 min. ved 4 ° C. Gentag én gang.
- Resuspend IgG-Agarosen perler i 50 mL blokerende buffer, rotere blanding for 2 h i RT og spin på 400 × g i 5 min. ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten og resuspend IgG-Agarosen perler i 200 mL NaCl kobling buffer (tabel 1).
- For at blokere enhver resterende tværbindingsmidler CNBr grupper, vaske IgG-Agarosen perler med 100 mL 0,1 M Glycin-HCl, pH 2.8. Spin på 400 × g i 5 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten. Vask med 0,2 M Glycin-HCl, pH 2.8, spin på 400 × g i 5 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten. Endelig, vaske IgG-Agarosen perler med 200 mL i ultrarent vand.
- Vask IgG-Agarosen perler med 200 mL i ultrarent vand og derefter 200 mL PBS buffer (tabel 1).
- Resuspend IgG-Agarosen perler i 20 mL PBS buffer med 0,01% NaN3 (natriumazid) og opbevares ved 4 ° C.
3. isolering og oploesning af membran brøkdel
- Grind 10 g af tre uger gamle A. thaliana stiklinger i flydende kvælstof ved hjælp af en kold morter og støder med sand.
- Der tilsættes 20 mL af kolde slibning buffer (tabel 1) til 10 g jorden væv, bland godt og tø på is.
- Filtrer homogenatet igennem to lag af hurtig filtrering materiale i en konisk 50mL-centrifugerør. Sættetid hurtig filtrering materiale med slibning buffer inden filtrering.
- Centrifuge filtratet i 10 min på 1500 × g på 4 ° C og overførsel supernatanten til en kølet 50 mL konisk centrifugeglas, Gentag de samme trin en gang mere og indsamle supernatanten. Bevare en 200 µL prøve af den "samlede fraktion" og opbevares ved-80 ° C til senere analyse
- Overføre supernatanten til kolde 38.50 mL ultracentrifuge rør og top op til 35 mL med kolde slibning buffer. Der centrifugeres i 1 h på 100.000 × g ved 4 ° C i en ultracentrifuge.
- Overføre supernatanten til en 50 mL konisk centrifugeglas. Bevare en 200 µL prøve af "vandopløselige fraktion" og butikken ved-80 ° C til senere analyse.
- Re suspendere den grønne pellet ved hjælp af et glas teflon homogeniseringsapparat, i slibning buffer. Der centrifugeres i 1 h på 100.000 × g ved 4 ° C i en ultracentrifuge og supernatanten.
- Resuspenderes grøn i 18,75 mL 1 x slibning Buffer ved hjælp af et glas teflon homogeniseringsapparat og tilføje 9.375 mL 1 x slibning buffer.
- Tilføj 9.375 mL af 4 x solubilisation løsning (tabel 1) (som indeholder TX-100 vaskemiddel) for at give 37,5 mL og Inkuber i 30 min. på en "roterende shaker" ved 4 ° C.
- Der centrifugeres i 1 h på 100.000 × g ved 4 ° C i en ultracentrifuge. Overføre supernatanten til en 50 mL konisk centrifugeglas. Bevare en 200 µL prøve af supernatanten (fremtid "load brøkdel") og opbevares ved-80 ° C til senere analyse.
- Resuspenderes i 37,5 mL slibning buffer. Bevare prøven af uopløselige del og butikken ved-80 ° C
4. Immunoprecipitation
- Reagensglasset 100 µL af pakket IgG-Agarosen harpiks i Buffer A (tabel 1) og spin på 100 × g i 5 min. ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten og resuspend IgG-Agarosen harpiks i 100 µL af Buffer A ved 4 ° C.
- Ionbyttermaterialet vasket IgG-Agarosen solubilized membraner 37,5 ml, og der inkuberes natten over på en roterende shaker i et 50 mL konisk centrifugeglas på 4 ° C.
- Sediment IgG-Agarosen harpiks på 100 × g i 5 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten med en pipette. Bevare en 200 µL prøve af "flow gennem" og opbevares ved-80 ° C til senere analyse.
- Vask IgG-Agarosen harpiks i 37,5 mL Buffer A og inkuberes i 10 min på en roterende shaker.
- Sediment IgG-Agarosen harpiks på 100 × g i 5 min. ved 4 ° C, Fjern supernatanten med en pipette, tilsættes 5 mL af slibning Buffer A til en 15 mL centrifugeglas, og der centrifugeres ved 100 × g, 4 ° C, 5 min. Bevar en 200 µL prøve af "Vask 1" og opbevares ved-80 ° C til senere analyse.
- Gentag de 5 mL vaske trin tre gange med Buffer A.
- Udføre de to sidste vask skridt uden hæmmere (NaF, Protease inhibitor og PMSF)
Bemærk: Hæmmere er ikke længere påkrævet på dette stadium og undladt at reducere omkostningerne. Bevare en 200 µL prøve sidste vask skridt "sidste vask (W6)" og butikken ved-80 ° C til senere analyse. - IgG-Agarosen ionbyttermaterialet til en 500 µL spin kolonne med et 35 µm filter og vaske perlerne to gange med 300 µL af TEV eluering buffer (tabel 1) (ikke indeholdende AcTEV) for ækvilibrering. Lukke kolonnen spin.
- Tilsæt 300 µL af TEV eluering buffer indeholdende 50 enheder (10 µL) af AcTEV. Forbered mix i en tube før du tilføjer til harpiks.
- Inkuber kolonnen spin med perler i en thermomixer ved 16 ° C, 350 rpm i 2 h. invertere kolonnen forsigtigt flere gange hvert 30 min.
- Åbn kolonnen spin, placere den i en ny ren 1,5 mL rør og spin på 100 × g i 5 min. ved 4 ° C til Eluatet opsamles.
- Tør (for eksempel) 10% (v/v) af den eluted prøve (~ 25 µL) i en centrifugal fordamper og anvendelse for massespektrometri eller andre yderligere analyse.
- Alikvot resterende eluatet (~ 275 µL) opdelt i til elleve 1,5 mL centrifugeres rør (25 µL hver), tørre i en centrifugal fordamper, og opbevares ved-80 ° C.
- Analysere prøverne opbevares hele proceduren samt eluater af standard SDS-PAGE efterfulgt af immunoblotting. For prøveforberedelse, bundfald 50 µg af samlede (T), last (L), Flow gennem (FT), vask 1 (W1) og 200 µL af vask 6 (W6) af chloroform/methanol udvinding16.
- Tilsæt 10 µL af 2 x SDS-PAGE loading bufferen (tabel 1) til de udfældede prøver og 25 µL af elueret tørrede prøve. Vortex og kog i 10 min. ved 95 ° C i en varme blok.
- Analysere samlede (T), last (L), Flow gennem (FT), vask 1 (W1), vaske 6 (W6) og eluering (E) af immunoblotting ved hjælp af anti-TOC159 antistoffer til at bestemme effektiviteten af proceduren isolation.
Representative Results
Vi har her beskrevet en protokol til rensning af en TAP-mærket grønkorn kuvert proteinkompleks fra transgene A. thaliana planter. Som vist i figur 1A, planter at udtrykke 35S:NTAP-TOC159 konstruktion blev brugt til at isolere dette kompleks, mens planter at udtrykke 35S:NTAP konstruktion blev brugt som et kontrolelement. Figur 1 B viser detaljerede trin i rensning af TAP-TOC159 proteinkomplekser efterfulgt af massespektrometri tillade identifikation af interagerende proteiner. Immunblot analyse (figur 2, højre side) bekræfter, at isolerede TAP-TOC159 interagerer med TOC75 og TOC33 af TOC-komplekset. Grønkorn ydre membran kinase KOC1 kendt for at phosphorylate TOC159 også co isoleret med tryk-TOC159 kompleks (figur 2B, højre side). Tilstedeværelsen af TIC110 afslører, at isolerede TAP-TOC159 komplekset indeholder også komponenter af TIC-komplekset. FBN1A antistof rejst mod en plastoglobule protein relateret til protein import kunne ikke genkende den TAP-TOC159 kompleks der angiver mangel af forureninger. I den negative kontrol, immunoprecipitated NTAP protein Co isolere ikke med nogen af TOC-TIC proteiner (figur 2, venstre side) og bekræfter specificitet af TAP-TOC159 rensning.
Figur 1 . Ordningen af konstruktioner og affinitet rensning procedure. (A). I 35S:NTAP-TOC159 konstruktion, kodning NTAP-TOC159 var stabilt udtrykt i Arabidopsis thaliana. Negativ kontrol planter udtrykt 35S:NTAP konstruktion, kodning TAP-mærket alene. B. skridt klog affinitet rensning protokollen består af membran isolation og oploesning, IgG Agarosen immuno-rensning, vasker, TEV protease kavalergang og eluering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Tandem affinitet rensning af TOC159 proteinet. N-terminalt TAP-mærket TOC159 blev renset fra NTAP-TOC15:ppi2 Arabidopsis planter og TAP protein renset fra TAP: WT planter blev brugt som en negativ kontrol. Total protein ekstrakter (T), solubilized Membranproteiner = belastning brøkdel (L), flow gennem (FT), første og sidste vask fraktioner (W1 og W6) og 10% TEV eluat blev analyseret af Western blotting. Membranen blev aftestede med antistoffer mod TOC159 (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950), og FBN1A (AT4G04020). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Tabel over buffere | ||
| Kobling Buffer | NaHCO3 Justere pH 8,5 justere pH med 0,1 M Na2CO3 |
100 mM |
| Blokerende Buffer | Tris-HCl Justere pH 8 med HCl. |
100 mM |
| PBS Buffer | Na2HPO4 KH2PO4 NaCl KCl Justere pH 7.3 med HCl. |
4.3 mM 1,4 mM 137 2.7 |
| NaCl kobling Buffer | Kobling buffer NaCl |
1 M |
| 2 x slibning Buffer | Tris-HCl, pH 7,5 med HCl. NaCl NaF PMSF Plante protease hæmmer cocktail |
100 mM 200 mM 5 mM 1 mM 0,20% |
| 4 x opløsning løsning | Glycerol Triton-X100 |
40% 3% |
| Buffer A | 2 x slibning Buffer 1 x slibning Buffer 4 x opløsning løsning |
100 ml 50 ml 25 ml 25% |
| TEV eluering Buffer | Tris-HCl, pH 8 med HCl EDTA, pH 8 med HCl NaCl Glycerol Triton-X100 DTT |
50 mM 0,5 mM 100 mM 10% 0,75% 1 mM |
| 2 x SDS-PAGE lastning Buffer | Tris-HCl pH 6,8 med HCl SDS Glycerol Bromophenol blå DTT |
0,1 M 4% 20% 0,20% 0,2 M |
Tabel 1. Buffer opskrifter.
Discussion
Vi viste, at et enkelt skridt TAP tag rensning er en særlig og effektiv metode til rensning af Arabidopsis TOC-TIC kompleks. Selvom TAP-tag tillader to successive rensning trin (IgG-efterfulgt af calmodulin affinitet rensning efter TEV protease-spaltning), mener vi, at det første affinity skridt efterfulgt af TEV protease kavalergang i mange tilfælde vil være tilstrækkeligt. Vores mål, TOC159, er lav rigelige og inddragelse af andet trin af calmodulin-affinitet overdrevent formindsket protein udbyttet, som var den vigtigste grund til at udelukke det fra vores nuværende protokol. TEV-eluering i sig selv er en meget specifikke og skånsom rensning trin, der kun vil frigive TAP-mærket målet med tilhørende interaktion partnere, mens forurener proteiner stikker ikke-specifikt til harpiks, IgG vil forblive der. Således, i kombination med trinnet IgG-affinitet, TEV eluering resulterer i en tilstrækkeligt effektiv rensning for vores og formentlig mange andre formål.
Pleje skal tages, TAP-mærket konstruktionen er fuldt funktionel in vivo. TAP-tagging kunne have potentielt skadelige virkninger på protein aktivitet, stabilitet eller lokalisering. TOC159 består af tre domæner, N-terminale sure domæne, centrale GTP-bindende domæne og C-terminale membran domæne, der forankrer TOC159 i ydre grønkorn membran2. For at undgå potentiel interferens med membran indsættelse, smeltet vi TAP-tag til N-terminus af TOC159. Fusion til N-terminus er snarere undtagelsen end reglen. Mange proteiner indeholder N-terminale målretning oplysninger og bør derfor ved markeret på C-terminus. Vi forsikrede, at TOC159 er funktionelle i vivo af komplementering af ppi2 mutant (en albino mutant mangler TOC159) med TAP-TOC159. Redning af grønne vildtype fænotype angivet, TAP-TOC159 var funktionelle15.
Rensning-protokol blev brugt til at identificere nye interaktion partnere af TOC159, der indeholdt KOC1 og TIC5610,11. I alt var ca. 30 proteiner forbundet med komplekse tyder på, at nye interaktion partnere bliver isoleret og karakteriseret i den nærmeste fremtid. Mens vi varmt anbefale TAP-tag til komplekse rensning, vil vi stadig gerne påpege, at yderligere versioner til den præsenteres her findes og kan være meget nyttigt for nogle programmer.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Arbejdet var støttet af tilskud fra den schweiziske National Science Foundation (31003A_156998 og 31003A_176191) og University Neuchâtel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaHCO3 | PanReac AppliChem | A0384 | |
| Tris | Biosolve | 0020092391BS | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7909 | |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | A2946 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | A2942 | |
| NaF | Sigma | S1509 | Toxic |
| PMSF | PanReac AppliChem | A0999 | Toxic |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | A0970 | |
| Triton X100 | Roche | 10789704001 | |
| Glycine | PanReac AppliChem | A1067 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043 | |
| Dithiothreitol (DTT) | PanReac AppliChem | A1101 | |
| SDS | PanReac AppliChem | A0675 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| HCl | VWR | 20252-290 | Corrosive |
| Sucrose | PanReac AppliChem | A3935 | |
| Murashige and Skoog medium with vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| Phytoagar | Duchefa Biochemie | P1003 | |
| Petri plate | Greiner Bio-one | 639102 | |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706 | |
| Ethanol | Fisher chemical | E/0600DF/15 | |
| Filter paper | Whatman | 10311804 | |
| Surgical tape | 3M | 1530-1 | |
| CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B) | GE Healthcare | 17-0430-01 | |
| Sintered glass filter | DURAN | 2515703 | |
| Centrifuge tube 50 mL | TPP | 91050 | |
| Purified immunoglobulin G (HsIgG) | MP Biomedicals | 855908 | |
| Rotating shaker | IKA | 4016000 | |
| NaN3 (sodium azide) | Sigma | 71290 | Toxic |
| Quick filtration material (Miracloth) | Merk-Millipore | 475855 | |
| Ultracentrifube XNP-80 | Beckman Coulter | A99839 | |
| Rotor SW 32 Ti | Beckman Coulter | 369650 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass teflon homogenizer (Potter) | Wheaton | 357426 | |
| Spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M1003 | |
| Filter 35µm for spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M513515 | |
| AcTEV | Invitrogen | 12575-015 | |
| Centrifugal evaporator (Speed Vac) | Eppendorf | 5305000100 | |
| FBN1A(PGL35) antibody | AgriSera | AS06 116 | RRID:AB_2247012 |
| Sand, Fontainebleau | VWR | 27460.295 |
References
- Jarvis, P., López-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Kessler, F., Schnell, D. Chloroplast biogenesis: diversity and regulation of the protein import apparatus. Current opinion in cell biology. 21 (4), 494-500 (2009).
- Schnell, D. J., Kessler, F., Blobel, G. Isolation of components of the chloroplast protein import machinery. Science. 266 (5187), 1007-1012 (1994).
- Kessler, F., Blobel, G., Patel, H. A., Schnell, D. J. Identification of two GTP-binding proteins in the chloroplast protein import machinery. Science. 266 (5187), 1035-1039 (1994).
- Jarvis, P., et al. An Arabidopsis mutant defective in the plastid general protein import apparatus. Science. 282 (5386), 100-103 (1998).
- Bauer, J., et al. Essential role of the G-domain in targeting of the protein import receptor atToc159 to the chloroplast outer membrane. The Journal of cell biology. 159 (5), 845-854 (2002).
- Kovacs-Bogdan, E., Soll, J., Bolter, B. Protein import into chloroplasts: the Tic complex and its regulation. Biochimica et biophysica acta. 1803 (6), 740-747 (2010).
- Nakai, M. The TIC complex uncovered: The alternative view on the molecular mechanism of protein translocation across the inner envelope membrane of chloroplasts. Biochimica et biophysica acta. 1847 (9), 957-967 (2015).
- Kikuchi, S., et al. Uncovering the protein translocon at the chloroplast inner envelope membrane. Science. 339 (6119), 571-574 (2013).
- Kohler, D., et al. Characterization of chloroplast protein import without Tic56, a component of the 1-megadalton translocon at the inner envelope membrane of chloroplasts. Plant physiology. 167 (3), 972-990 (2015).
- Zufferey, M., et al. The novel chloroplast outer membrane kinase KOC1 is a required component of the plastid protein import machinery. The Journal of biological chemistry. 292 (17), 6952-6964 (2017).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Rohila, J. S., Chen, M., Cerny, R., Fromm, M. E. Improved tandem affinity purification tag and methods for isolation of protein heterocomplexes from plants. The Plant journal. 38 (1), 172-181 (2004).
- Rohila, J. S., et al. Protein-protein interactions of tandem affinity purified protein kinases from rice. PloS one. 4 (8), 6685 (2009).
- Agne, B., et al. The acidic A-domain of Arabidopsis TOC159 occurs as a hyperphosphorylated protein. Plant physiology. 153 (3), 1016-1030 (2010).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
