हम यहां chloroplast प्रोटीन आयात परिसरों की शुद्धि के लिए एक सिद्ध और परीक्षण प्रोटोकॉल वर्तमान (TOC-टिक जटिल) नल-टैग का उपयोग कर । एक कदम संबध-अलगाव प्रोटोकॉल संभावित रूप से किसी भी प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है और जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा नए संवाद भागीदारों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा ।
Chloroplast उत्पत्ति नाभिक के हजारों plastid में इनकोडिंग प्रोटीन के आयात की आवश्यकता है । इन प्रोटीन का आयात बाहरी (TOC) और भीतरी (टिक) chloroplast झिल्ली पर translocon पर निर्भर करता है । TOC और टिक परिसरों multimeric और शायद अभी तक अज्ञात घटक होते हैं । क्षेत्र में मुख्य लक्ष्यों में से एक TOC और टिक घटकों की पूरी सूची स्थापित करने के लिए है । TOC के अलगाव के लिए-टिक परिसरों और नए घटकों की पहचान के लिए, प्रोटीन रिसेप्टर TOC159 के साथ मिलकर समानता शुद्धि (ठोकर) टैग नल TOC159 में जिसके परिणामस्वरूप के अलावा द्वारा एन-टर्मिनली संशोधित किया गया है । नल-टैग दो अनुक्रमिक संबध शुद्धि चरणों के लिए डिज़ाइन किया गया है (इसलिए “मिलकर संबध”) । नल-टैग इन अध्ययनों में प्रयुक्त एक N-टर्मिनल आईजीजी-बाध्यकारी डोमेन Staphylococcus aureus प्रोटीन ए (ProtA) से व्युत्पंन एक calmodulin-बाध्यकारी पेप्टाइड (CBP) के बाद होते हैं । इन दो अपनत्व टैग के बीच, एक तंबाकू खोदना वायरस (टेव) को छेड़ो दरार साइट शामिल किया गया है । इसलिए टेव को आईजीजी मोतियों से बाँधने के बाद TOC159-युक्त कॉम्प्लेक्सों के कोमल रेफरेंस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में द्वितीय Calmodulin-संबधी शुद्धिकरण चरण का लोप किया गया. शुद्धि प्रोटोकॉल की तैयारी और कुल सेलुलर झिल्ली के solubilization के साथ शुरू होता है । डिटर्जेंट-उपचार के बाद, solubilized झिल्ली प्रोटीन नल-TOC159 युक्त परिसरों के immunoisolation के लिए आईजीजी मोतियों के साथ मशीन हैं । बाध्यकारी और व्यापक धुलाई पर, नल-परिसरों युक्त TOC159 और आईजीजी मोतियों से जारी टेव को छेड़ने जिससे एस. aureus आईजीजी-बाइंडिंग डोमेन हटा दिया जाता है । पृथक TOC159-युक्त परिसरों के पश्चिमी सोख्ता ज्ञात या संदिग्ध TOC और टिक प्रोटीन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इससे भी महत्वपूर्ण बात, TOC159 युक्त परिसरों सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है TOC और जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा टिक परिसरों के नए घटकों की पहचान । प्रोटोकॉल है कि हम वर्तमान संभावित किसी भी झिल्ली के कुशल अलगाव-बाध्य प्रोटीन जटिल मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा अभी तक अज्ञात घटकों की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा अनुमति देता है ।
पौधे प्रकाश संश्लेषण और photoautotrophic वृद्धि1के लिए chloroplasts पर निर्भर करते हैं । chloroplast प्रोटीन के विशाल बहुमत नाभिक में इनकोडिंग, cytosol में संश्लेषित और लिफाफा झिल्ली2में टिक और TOC परिसरों के माध्यम से chloroplast में आयात कर रहे हैं । TOC परिसर के मुख्य Toc75 प्रोटीन का आयोजन चैनल और दो रिसेप्टर GTPases Toc33 और Toc1593,4,5शामिल हैं । TOC159 chloroplasts की उत्पत्ति के लिए आवश्यक है और प्रकाश संश्लेषण के बड़े पैमाने पर संचय-जुड़े प्रोटीन6मध्यस्थता । टिक जटिल TIC20 प्रोटीन का आयोजन चैनल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से TIC110 और TIC407,8के होते हैं । हाल ही में, भीतरी लिफाफा झिल्ली पर एक 1MD प्रोटीन translocation परिसर अलग था और पहले अज्ञात9घटक निहित, जिनमें से एक TIC56 था । हमने हाल ही में TIC56-TOC159 संबध शुद्धिकरण प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए 1 एमडीएस परिसर का सह-पृथकीकरण कर रखा है । डेटा “विहित” TOC/टिक परिसरों और 1 एमडीए परिसर10के बीच एक संरचनात्मक ओवरलैप संकेत दिया । KOC1 के रूप में पहले से अज्ञात घटक भी TOC और टिक परिसरों के नए संवाद भागीदारों के रूप में पहचाने गए नल का उपयोग-विधि यहां वर्णित10,11।
इस प्रकार, नल टैग शुद्धि प्रोटीन परिसरों के अलगाव और बाद में जन spectrometric विश्लेषण12द्वारा बातचीत भागीदारों की पहचान के लिए एक कुशल तरीका है । टैग ठोकर दो आईजीजी बाध्यकारी एक calmodulin-बाध्यकारी पेप्टाइड (CBP) से एक तंबाकू खोदना वायरस (टेव) को छेड़ो दरार साइट से अलग दोहराता होते हैं । मूल विधि, एक आईजीजी-अपनत्व शुद्धि टेव दरार और बाद में calmodulin-संबध के बाद कदम से मिलकर क्रोमैटोग्राफी बड़े और उच्च शुद्ध प्रोटीन के मूल शुद्धि की अनुमति दी परिसर13,14 . हमने प्रक्रिया को सरलीकृत किया है और यह दर्शाया है कि TOC159-युक्त प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को भी केवल आईजीजी-संबधी शुद्धिकरण कदम का उपयोग करके शुद्ध किया जा सकता है टेव-क्लीवेज के लिए15. हमारे अनुभव में, calmodulin की चूक-अपनत्व कदम उच्च पैदावार के परिणामस्वरूप और इसलिए कम बहुतायत प्रोटीन के लिए उपयुक्त हो सकता है ।
संक्षेप में, हम स्थिर ट्रांसजेनिक A. थालियाना नल एक्सप्रेस-TOC159 ppi2 (TOC159 KO उत्परिवर्ती) पृष्ठभूमि में इंजीनियर और यह TOC-टिक परिसरों की शुद्धि के लिए एक विश्वसनीय स्रोत के रूप में स्थापित किया । TOC के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल-टिक जटिल एक डिटर्जेंट मुक्त बफर में संयंत्र सामग्री के homogenization के साथ शुरू होता है । केंद्रापसारक के बाद, supernatant खारिज कर दिया है । कुल झिल्ली अंश युक्त गोली एक डिटर्जेंट-बफर युक्त का उपयोग कर solubilized है । एक अल्ट्रा-केंद्रापसारक कदम के बाद, solubilized TOC युक्त supernatant-टिक परिसरों आईजीजी-समानता शुद्धि के लिए राल के लिए लागू किया जाता है । कई धुलाई कदम के बाद, रेफरेंस एक टेव को छेड़ने वाले बफर का उपयोग करके किया जाता है ताकि चुनिंदा आईजीजी-बाइंडिंग डोमेन के बहाव को सट सके और धीरे से देशी TOC159-युक्त परिसरों को रिलीज किया जा सके । टेव eluate पश्चिमी सोख्ता या मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा सीधे विश्लेषण किया जा सकता है TOC15910,11,15के संपर्क भागीदारों की पहचान । विधि भी TOC15915के बाद अनुवाद संशोधन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । भविष्य में, मूल TOC159-युक्त परिसरों cryoelectron माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर संरचनात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
हम प्रदर्शन किया है कि एक कदम टैग शुद्धीकरण नल Arabidopsis TOC की शुद्धि के लिए एक विशिष्ट और कुशल विधि-टिक जटिल है । हालांकि नल टैग दो क्रमिक शुद्धिकरण कदम (आईजीजी-टेव के बाद calmodulin संबध शुद्धि द्वारा पीछा-दरार) की अनुमति होगी, हम मानते है कि कई मामलों में पहले संबध कदम टेव को छेड़ो दरार के बाद पर्याप्त होगा । हमारा लक्ष्य, TOC159, कम प्रचुर मात्रा में है और दूसरा calmodulin के शामिल किए जाने-संबध कदम जरूरत से ज्यादा प्रोटीन उपज है जो यह हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल से छोड़कर के लिए मुख्य कारण था कम । टेव-अपने आप में रेफरेंस एक अति विशिष्ट और कोमल शुद्धि कदम है कि केवल नल के साथ जुड़े संपर्क भागीदारों के साथ टैग लक्ष्य जारी करेंगे, जबकि आईजीजी राल के लिए गैर विशेष रूप से चिपके प्रोटीन दूषित वहां रह जाएगा । इस प्रकार, आईजीजी-संबध कदम के साथ संयोजन में, हमारे और शायद कई दूसरों के प्रयोजनों के लिए एक पर्याप्त कुशल शोधन में टेव रेफरेंस परिणाम ।
ध्यान रखा जाना चाहिए कि नल टैग का निर्माण vivo मेंपूरी तरह कार्यात्मक है । नल-टैगिंग संभावित प्रोटीन गतिविधि, स्थिरता या स्थानीयकरण पर बचके प्रभाव हो सकता है । TOC159 तीन डोमेन, एन टर्मिनल अंलीय डोमेन, केंद्रीय GTP-बाध्यकारी डोमेन और सी-टर्मिनल झिल्ली डोमेन, कि लंगर बाहरी chloroplast झिल्ली2में TOC159 के होते हैं । झिल्ली प्रविष्टि के साथ संभावित हस्तक्षेप से बचने के लिए, हम नल-टैग से जुड़े N-TOC159 के टर्मिनस । एन के लिए फ्यूजन-टर्मिनस नियम से अपवाद नहीं बल्कि है । कई प्रोटीन एन टर्मिनल लक्ष्यीकरण जानकारी शामिल है और इसलिए सी पर टैग द्वारा किया जाना चाहिए-टर्मिनस । हम TOC159 ppi2 उत्परिवर्ती के पूरक द्वारा vivo में कार्यात्मक है कि आश्वासन दिया (एक albino उत्परिवर्ती कमी TOC159) नल-TOC159 के साथ । हरे, जंगली प्रकार phenotype के बचाव संकेत दिया कि नल-TOC15915कार्यात्मक था ।
शुद्धि प्रोटोकॉल TOC159 के नए संपर्क भागीदारों, कि KOC1 और TIC5610,11शामिल की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । कुल में, 30 प्रोटीन के आसपास के परिसर का सुझाव है कि नए संपर्क भागीदारों अलग हो जाएगा और निकट भविष्य में विशेषता के साथ जुड़े थे । जब तक हम अत्यधिक नल-जटिल शुद्धिकरण के लिए टैग की सिफारिश, हम अभी भी कहना है कि एक यहां प्रस्तुत करने के लिए अतिरिक्त संस्करण मौजूद है और कुछ अनुप्रयोगों के लिए बहुत उपयोगी हो सकता है पसंद है ।
The authors have nothing to disclose.
काम स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (31003A_156998 और 31003A_176191) और Neuchâtel विश्वविद्यालय द्वारा अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
NaHCO3 | PanReac AppliChem | A0384 | |
Tris | Biosolve | 0020092391BS | |
Na2HPO4 | Sigma | S7909 | |
KH2PO4 | PanReac AppliChem | A2946 | |
NaCl | PanReac AppliChem | A2942 | |
NaF | Sigma | S1509 | Toxic |
PMSF | PanReac AppliChem | A0999 | Toxic |
Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | |
Glycerol | PanReac AppliChem | A0970 | |
Triton X100 | Roche | 10789704001 | |
Glycine | PanReac AppliChem | A1067 | |
EDTA | Carl Roth | 8043 | |
Dithiothreitol (DTT) | PanReac AppliChem | A1101 | |
SDS | PanReac AppliChem | A0675 | |
Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
HCl | VWR | 20252-290 | Corrosive |
Sucrose | PanReac AppliChem | A3935 | |
Murashige and Skoog medium with vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
Phytoagar | Duchefa Biochemie | P1003 | |
Petri plate | Greiner Bio-one | 639102 | |
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706 | |
Ethanol | Fisher chemical | E/0600DF/15 | |
Filter paper | Whatman | 10311804 | |
Surgical tape | 3M | 1530-1 | |
CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B) | GE Healthcare | 17-0430-01 | |
Sintered glass filter | DURAN | 2515703 | |
Centrifuge tube 50 mL | TPP | 91050 | |
Purified immunoglobulin G (HsIgG) | MP Biomedicals | 855908 | |
Rotating shaker | IKA | 4016000 | |
NaN3 (sodium azide) | Sigma | 71290 | Toxic |
Quick filtration material (Miracloth) | Merk-Millipore | 475855 | |
Ultracentrifube XNP-80 | Beckman Coulter | A99839 | |
Rotor SW 32 Ti | Beckman Coulter | 369650 | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
Glass teflon homogenizer (Potter) | Wheaton | 357426 | |
Spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M1003 | |
Filter 35µm for spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M513515 | |
AcTEV | Invitrogen | 12575-015 | |
Centrifugal evaporator (Speed Vac) | Eppendorf | 5305000100 | |
FBN1A(PGL35) antibody | AgriSera | AS06 116 | RRID:AB_2247012 |
Sand, Fontainebleau | VWR | 27460.295 |