Summary
我々 はここで葉緑体の浄化のためのテスト/実証済みのプロトコル タンパク質インポート複合体 (TIC TOC 複合体) をタップ-タグを使用してを提示.ワンステップの親和性隔離のプロトコルは蛋白質を適用できる可能性があると質量分析法による新しい相互作用のパートナーを識別するために使用します。
Abstract
葉緑体のバイオジェネシス プラスチドに核符号化された蛋白質の何千ものインポートが必要です。これらの蛋白質の輸入は、外側 (TOC) と内側 (TIC) 葉緑体膜透過装置に依存します。TOC と TIC 錯体ポリコームタンパク、おそらくまだ未知の成分を含みます。フィールドの主な目標の 1 つは目次とチックのコンポーネントの完全なインベントリを確立します。TIC TOC 錯体の分離と新しいコンポーネントの識別、preprotein 受容体 TOC159 がされているを変更 N 末端タップ TOC159 のタンデム親和性の浄化 (蛇口) タグの付加によって。2 つ連続アフィニティ精製ステップ タップ タグです (したがって「タンデム アフィニティ」)。これらの研究で使用される水道札は、由来黄色ブドウ球菌蛋白質 (ProtA) カルモジュリン結合ペプチド (CBP) の N 末端抗体結合ドメインで構成されます。これらの 2 つの親和性の札間タバコ etch ウイルス (TEV) プロテアーゼ胸の谷間のサイトが含まれています。そのため、igg 抗体ビーズにバインドした後 TOC159 を含む複合体の穏やかな溶出の TEV プロテアーゼを使用できます。ここで提示されたプロトコル、2 番目のカルモジュリン アフィニティ精製ステップが省略されました。浄化のプロトコルは準備と総細胞膜の可溶化から始まります。洗剤治療後タップ TOC159 を含む複合体の免疫の IgG ビーズで可溶化された膜タンパク質に孵化します。バインディングと広範な洗浄、タップ TOC159 含んでいる複合体が裂かれ、黄色ブドウ球菌の抗体結合ドメインの削除という TEV プロテアーゼを用いた IgG ビーズから解放。免震のウェスタンブロッティング TOC159 含む錯体は、既知または疑われる TOC と TIC 蛋白質の存在を確認する使用できます。もっと重要なは、TOC159 を含む複合体が使用されて正常に TOC とチックの複合体の新しいコンポーネントを識別するために質量分析法による。可能性を提案するプロトコルでは、質量分析法による未知成分の同定に使用する複雑な任意の膜結合型蛋白質の効率的な分離をことができます。
Introduction
植物は、葉緑体の光合成および生育1に依存します。葉緑体タンパク質の大部分は核でエンコードされた、細胞質で合成され、エンベロープ膜2における TIC TOC 体を介して葉緑体にインポートします。複雑な景徳鎮のコアは Toc75 タンパク質チャネルおよび 2 つの受容体低分子量 g 蛋白質 Toc33 および Toc1593,4、5から成っています。TOC159 は、葉緑体のバイオジェネシスに欠かせない光合成関連タンパク質6の大規模な蓄積を仲介します。チック複合体は TIC110 と TIC407,8と同様、TIC20 蛋白質チャネルから成っています。最近、1MD タンパク質輸送の内側エンベロープ膜で複雑な分離され含まれていなかったコンポーネント9TIC56 は 1 つだった。我々 は最近共同水道 TOC159 親和性の浄化のプロトコルを使用して複雑な 1 MDa の TIC56 を分離しました。データには、「標準」の目次/TIC 錯体と 1 MDa 複雑な10間構造の重複が示されます。以前タップ メソッドを使用して目次とチックの複合体の新たな相互作用パートナーはここで説明した10、11KOC1 など未知の成分また識別されました。
したがって、タップ タグ浄化はタンパク質複合体の単離と後続の質量分析12によって相互作用のパートナーの同定のための効率的な方法です。タップのタグの 2 つで構成されていますタバコ カルモデュリン結合ペプチド (CBP) から区切って IgG 結合繰り返し etch プロテアーゼ切断部位のウイルス (TEV)。Igg 抗体アフィニティ精製ステップで構成される元のメソッドは続いて TEV 胸の谷間と後続カルモデュリン-アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー許可大規模な非常に純粋なタンパク質複合体13,14のネイティブの浄化.手順を簡素化し、溶出15TEV 胸の谷間に続く igg 抗体アフィニティ精製ステップのみを効率的に使用して TOC159 を含むタンパク質複合体を浄化するもことができることを実証しました。経験から、カルモジュリン親和性ステップの省略はより高い収穫で起因した、低豊富な蛋白質のために適切であります。
一言で言えば、我々 設計安定した形質転換シロイヌナズナ ppi2 (toc159 KO 変異) でタップ TOC159 を表現するライン背景し、TIC TOC の複合体の浄化のための信頼できる情報源として設立。洗剤無料バッファー内の植物材料の均質化と TIC TOC 複雑な開始の隔離のためのプロトコル。遠心分離後、上清は破棄されます。合計膜画分を含むペレットは、洗剤を含むバッファーを使用して可溶化です。超遠心分離ステップの後, 可溶化 TIC TOC 錯体を含む上清は親和性の浄化の IgG 樹脂に適用されます。後いくつか手順を洗浄、溶出を用いて TEV プロテアーゼを含むバッファー選択的に下流を裂くことゆっくりと抗体結合ドメインのネイティブ TOC159 を含む複合体をリリースします。西部にしみが付くことや TOC15910、11,15の相互作用のパートナーを識別するために質量分析法によって直接 TEV 溶出液を分析できます。このメソッドは、TOC15915のポスト翻訳の修正を識別するために使用されています。将来は、ネイティブ TOC159 を含む複合体は低温電子顕微鏡による構造研究のため使えます。
Protocol
1. シロイヌナズナの準備
- 1% スクロース培地、培 (MS) の中の含むビタミンの半分強の 1 L を準備し、水酸化カリウム (KOH) と 5.7 を pH を調整します。120 ° C で phytoagar と 20 分間のオートクレーブの 0.8% を追加します。
- ペトリ プレートごと MS 培地の 75 mL を注ぐ (直径 14.5 cm、高さ 3 cm) 1 h の凝固を可能とします。
- 1.5 の mL および microfuge の管にシロイヌナズナ種子の 30 mg を追加、表面消毒 0.05% (v/v) を含む 70% (v/v) エタノール 5 分トリトン X-100 10 分 (v/v) エタノール 100% エタノールを削除します。
- 乾燥滅菌フィルター ペーパーに種子を転送します。(各遺伝子型が少なくとも 8 10 枚必要) MS 板に均等に滅菌の種子を振りかけるし、サージカル テープ、各プレートをシールします。
- 種子の発芽を同期する暗闇の中で 2 日間の 4 ° C で版を孵化させなさい。次の光の周期と成長の商工会議所への転送: 120 µmol m− 2の− 1 、光の 8 h と 16 h 22-20 ° c. で暗いの
HsIgG アガロース ビーズ調製された2。
- 1 mM 塩酸 100 mL にエポキシ活性化アガロース ビーズ (4 g) を中断し、室温で 30 分間インキュベートします。
- 焼結ガラス フィルターにアガロース ビーズを転送し、100 mM 塩酸 100 mL で真空下で洗浄し、2-3 回繰り返します。
注: Precool 洗浄液を 4 ° C - アガロース ビーズ冷たい 100 mM 塩酸 1 ml と 50 mL の円錐形遠心チューブへの転送を再懸濁します。100 mM 塩酸 3 mL で焼結ガラス フィルターを洗って、同じ管に液体を転送します。
- 4 ° C で 5 分間 400 × gでスピンし、ピペットで上澄みを削除します。
注: を行うチューブをデカントしてないです。 - 50 mL の結合バッファー (表 1) のビードを再停止しなさい一時的に、混ぜるし、4 ° C で 5 分間 400 × gでスピン
- 10 mL の結合バッファーで凍結乾燥、ホモ ・ サピエンスIgG (Hs IgG) の 50 mg を溶解、優しく、アガロース ビーズをミックスし、シェーカー 4 ° C で一晩で孵化させなさい
- 4 ° C で 5 分間 400 × gでスピンし、ピペットで上澄みを削除します。
- 50 ml の結合バッファーと 4 ° C で 5 分間 400 × gでのスピンの IgG アガロース ビーズを洗浄します。
- 4 ° C で 5 分間 400 × gで 50 ml のブロック バッファー (表 1) とスピンの IgG アガロース ビーズを再懸濁しますもう一度繰り返します。
- 50 mL のブロック バッファーで IgG アガロース ビーズを再懸濁します、RT に 2 h と 4 ° C で 5 分間 400 × gでのスピンのための混合物を回転させる
- 上澄みを除去し、200 mL の塩化ナトリウム結合バッファー (表 1) で IgG アガロース ビーズを再懸濁します。
- 任意の残りの架橋エポキシ基をブロック、100 ml の 0.1 M グリシン塩酸で pH 2.8 の IgG アガロース ビーズを洗ってください。4 ° C で 5 分間 400 × gで回転し、上清を削除します。0.2 M グリシン塩酸 pH 2.8、4 ° C で 5 分間 400 × gでのスピンで洗浄し、上清を除去します。最後に、200 ml の超純水の IgG アガロース ビーズを洗浄します。
- 純水 200 mL、200 mL の PBS バッファー (表 1) と IgG アガロース ビーズを洗浄します。
- 20 mL の 0.01% ナン3 (アジ化ナトリウム) PBS バッファーで IgG アガロース ビーズを再懸濁します、4 ° C で保存
3. 分離、膜画分の可溶化
- 砂で冷たい乳鉢と乳棒を使用して液体窒素で 3 週間シロイヌナズナ実生の 10 g を挽きます。
- 冷たい地面の組織 10 g にバッファー (表 1) を研削の 20 の mL を追加し、ミックスも、氷の上を解凍します。
- 50 mL の円錐形遠心チューブに簡単なろ過材の 2 つの層を介して磨砕液をフィルターします。ろ過の前にバッファーを砥石で簡単なろ過材を浸します。
- 4 ° C で冷やした 50 mL の円錐形遠心チューブに上清転送 1,500 × gで 10 分間遠心する濾液は、同じ 1 つのより多くの時間ステップし、上澄みを集めを繰り返します。「合計分数」の 200 μ L のサンプルを保持し、後で分析-80 ° C で保存
- 冷たい 38.50 mL 遠心チューブに上清を転送し、冷たい研削バッファーと最大 35 mL をトップします。100,000 × gで、超遠心機 4 ° C で 1 時間の遠心分離します。
- 50 mL の円錐形遠心チューブに上清を転送します。「可溶性」と後で分析-80 ° C でストアの 200 μ L のサンプルを保持します。
- 再研削のバッファーでガラス テフロン ホモジナイザーを使用して緑のペレットを中断します。100,000 × gで、超遠心機 4 ° C で 1 時間の遠心し、上清を捨てます。
- ガラス テフロン ホモジナイザーを使用してバッファーを研削 x 1 の 18.75 mL で緑のペレットを再懸濁します、9.375 バッファーを研削 x 1 mL を追加します。
- 37.5 mL を与えるため、4 ° C で「回転シェーカー」上で 30 分間インキュベート 9.375 4 x solubilisation 溶液 mL (表 1) (テキサス州 100 洗剤) を追加します。
- 100,000 × gで、超遠心機 4 ° C で 1 時間の遠心分離します。50 mL の円錐形遠心チューブに上清を転送します。上清 (将来「負荷率」) と後で分析-80 ° C でストアの 200 μ L のサンプルを保持します。
- バッファーを研削の 37.5 mL にペレットを再懸濁します。不溶性部分、-80 ° C でストアのサンプルを保持します。
4. 免疫沈降
- (表 1) バッファー A に IgG agarose 樹脂パックと 4 ° C で 5 分間 100 × gでスピンの 100 μ L を平衡します。
- 上澄みを除去し、4 ° C でバッファー A の 100 μ L で IgG agarose 樹脂を再懸濁します
- 可溶化された膜の 37.5 ml 洗浄 IgG agarose 樹脂を転送し、4 ° C で 50 mL の円錐形遠心管中回転シェーカーで一晩インキュベート
- 土砂 IgG アガロースは 4 ° C で 5 分間 100 × gで樹脂し、ピペットで上澄みを除去します。「流れ」の 200 μ L のサンプルを保持し、後で分析-80 ° C で保存します。
- 37.5 mL のバッファー A に IgG agarose 樹脂を洗浄し、回転シェーカーで 10 分間インキュベートします。
- 土砂 100 × g 4 ° C で 5 分間で IgG agarose 樹脂ピペットで上澄みを除去、「洗浄 1」の 200 μ L サンプル 15 mL 遠心管と 4 ° C、5 分保持 100 × g で遠心分離機にバッファー A を研削の 5 mL を追加、-80 ° C で保存後で分析。
- 5 mL の洗浄バッファー A. と 3 回のステップを繰り返す
- インヒビター (NaF, PMSF とプロテアーゼ阻害剤) 最後の 2 つの洗浄手順を実行します。
メモ: 阻害剤は、もはやこの段階で必要なコスト削減のため省略。最後洗濯手順"最終的な洗浄 (W6)」と、後で分析-80 ° C でストアの 200 μ L のサンプルを保持します。 - 35 μ m フィルターで 500 μ L スピン列に IgG agarose 樹脂を転送し、ビーズ TEV 溶出バッファー (表 1) の 300 μ L で 2 回 (AcTEV 含む) 平衡を洗ってください。スピン列を閉じます。
- AcTEV の 50 単位 (10 μ L) を持つ TEV 溶出バッファーの 300 μ L を追加します。樹脂に追加する前にチューブのミックスを準備します。
- スピン列 16 ° C で thermomixer でビーズをインキュベート、350 rpm のため 2 列を反転させる優しく数回 30 分毎。
- スピン列を開き、新しいきれいな 1.5 mL チューブと溶出液を収集するために 4 ° C で 5 分間 100 × gでのスピンに配置します。
- ドライ (例えば) 遠心蒸化器の溶出サンプル (〜 25 μ L) の 10% (v/v) と質量分析法や他のさらなる分析を使用します。
- 分注残り溶出液 (~ 275 μ L) で分けられる 11 1.5 mL 遠心チューブ (25 μ L 各)、遠心蒸化器で乾燥や-80 ° C で保存するには
- SDS-PAGE とイムノブロット標準手順として溶出を通して保有サンプルを分析します。試料の調製、沈殿物 50 μ g の合計 (T)、負荷 (L)、(フィート)、流れる洗浄 1 (W1) とクロロホルム ・ メタノール抽出16洗浄 6 (W6) を 200 μ l 添加します。
- 2 × SDS ページの読み込みバッファー (表 1) 沈殿したサンプルを 10 μ L と 25 μ L の溶出の乾燥サンプル追加します。渦と熱ブロック 95 ° C で 10 分間沸騰。
- 合計 (T)、負荷 (L)、(フィート) を通過、洗って 1 (W1) を分析分離処理の効率性を決定する抗 TOC159 抗体を用いたイムノブロット 6 (W6) と溶出 (E) を洗います。
Representative Results
我々 はここで形質転換シロイヌナズナから複雑なタグ付きのタップ葉緑体エンベロープ蛋白質の浄化のためのプロトコルを説明した植物。図 1Aのように、植物、35S:NTAP を表現する-TOC159 構造体は、コントロールとして使用された 35S:NTAP 構造体を表現する植物中にこの複合体を分離する使用されました。図 1Bは質量分析相互作用の蛋白質の識別を可能に続いてタップ TOC159 タンパク質複合体の精製の手順の詳細を示しています。イムノブロット解析 (図 2、右サイド) は、分離タップ TOC159 が TOC75 および TOC 複合体の TOC33 と対話することを確認します。葉緑体の外膜キナーゼ KOC1 共同水道 TOC159 複合体 (図 2B右側面) と分離も TOC159 をリン酸化する知られています。TIC110 の存在は、分離のタップ TOC159 複合体がチック複合体の構成要素も含まれていることを明らかにします。タンパク質インポートとは無関係な plastoglobule 蛋白質、FBN1A 抗体は、汚染の不在を示すタップ TOC159 複合体を認識しませんでした。ネガティブ コントロールに沈澱 NTAP タンパク質は TIC TOC 蛋白質 (図 2、左側) のいずれかと共同特定されなかったし、タップ TOC159 浄化の特異性を確認します。
図 1.構成要素およびアフィニティ精製法のスキーム。(A).、35S:NTAP-シロイヌナズナのコンストラクト、NTAP TOC159 が安定していた TOC159 を表明しました。陰性対照植物は、35S:NTAP コンストラクト、タップ タグだけで表現。(B). ステップ賢明な親和性の浄化のプロトコルは、膜分離、可溶化、IgG アガロース免疫浄化、洗浄、TEV プロテアーゼ胸の谷間と溶出で構成されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.TOC159 タンパク質のタンデム親和性の浄化します。NTAP TOC15 から精製された N 末端タグ付きのタップ TOC159:ppi2シロイヌナズナとタップ タップ: WT 植物から精製したタンパク質は、ネガティブ コントロールとして使用されていた。タンパク質可溶化抽出物 (T)、膜タンパク質を合計 = 負荷率 (L)、(フィート)、流れ最初と最後を洗う (W1 と W6) 分数と TEV 溶出液の 10% は西部にしみが付くことによって分析されました。膜は TOC159 に対する抗体をプローブ (AT4G02510)、TOC75 (AT3G46740)、TOC33 (AT1G02280)、KOC1 (AT4G32250)、TIC110 (AT1G06950) と FBN1A (AT4G04020)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| バッファーのテーブル | ||
| 結合バッファー | NaHCO3 調整 ph 8.5 は 0.1 M Na2CO3 pH を調整 |
100 mM |
| バッファーをブロック | トリス-HCl 塩酸で pH 8 に調整します。 |
100 mM |
| PBS バッファー | Na2HPO4 KH2PO4 塩化ナトリウム KCl 塩酸で pH 7.3 に調整されます。 |
4.3 mM 1.4 mM 137 2.7 |
| 塩化ナトリウムの結合バッファー | 結合バッファー 塩化ナトリウム |
1 M |
| バッファーを研削 x 2 | トリス-HCl、塩酸で pH 7.5。 塩化ナトリウム NaF PMSF 植物プロテアーゼ阻害剤カクテル |
100 mM 200 mM 5 mM 1 mM 0.20% |
| 4 x 脱色液 | グリセロール トリトン X100 |
40% 3% |
| バッファー A | バッファーを研削 x 2 バッファーを研削 x 1 4 x 脱色液 |
100 ml 50 ml 25 ml 25% |
| TEV 溶出バッファー | トリス-HCl、塩酸で pH 8 EDTA、塩酸で pH 8 塩化ナトリウム グリセロール トリトン X100 DTT |
50 mM 0.5 mM 100 mM 10% 0.75% 1 mM |
| 2 × SDS ページの読み込みバッファーします。 | HCl でトリス塩酸 pH 6.8 SDS グリセロール ブロモフェノール ブルー DTT |
0.1 M 4% 20% 0.20% 0.2 M |
表 1。バッファー調理法。
Discussion
我々 は、シングル ステップ タップ タグ浄化シロイヌナズナTIC TOC の複合体の浄化のため特定かつ効率的な方法であることを示した。タップ タグ 2 つ連続精製ステップ (IgG - TEV プロテアーゼ切断後のカルモジュリンの親和性の浄化続く) できるようになる、我々 は多くの場合 TEV プロテアーゼ胸の谷間に続いてまず親和性が十分なことと考えています。私たちの目標は、TOC159 は豊富な低、カルモジュリン親和性の 2 番目のステップを含めることは過度にだった主な理由は、私たちの現在のプロトコルから除外するため蛋白質収量を減少します。それ自体 TEV 溶出は、そこに残る非具体的には IgG 樹脂付着蛋白質を汚染しながら一緒に関連付けられた対話パートナー タグ付きのタップ ターゲットをリリースする予定特定性の穏やかな精製ステップです。したがって、igg 抗体親和性ステップと組み合わせて、TEV 溶出の私たちとおそらく他の多くの目的のための十分に効率的な浄化の結果します。
完全に機能の生体をタグ付きのタップ構成注意する必要があります。タップのタグ付けと、タンパク質活性、安定性またはローカリゼーションへ潜在的悪影響を及ぼす可能性があります。TOC159 は、3 つのドメイン、C 末端膜ドメイン、外側の葉緑体膜2で TOC159 のアンカー、N 末端酸性ドメイン中央の GTP 結合ドメインで構成されます。膜に挿入して潜在的干渉を避けるためには、TOC159 の N 末端側にタップ タグを融合しました。N 末端融合はルールよりも例外ではなくです。多くの蛋白質は N 末端のターゲット情報が含まれておよび C 末端でタグする必要がありますしたがって。我々 は、TOC159 は、機能的な体内 ppi2変異 (TOC159 に欠けているアルビノ変異) の相補性によってタップ TOC159 を保証しました。緑の救助、野生型表現型を示したタップ TOC159 機能15。
浄化のプロトコルは、KOC1 と TIC5610,11を含む TOC159 の新しい相互作用のパートナーを識別するために使用されました。合計では、約 30 蛋白質はその新しい相互作用パートナーは分離され、近い将来に特徴を示唆している複合体と関連付けられました。一方、複雑な浄化用タップ タグを強く勧め、紹介に追加バージョンが存在し、非常にいくつかのアプリケーションの役に立つかもしれないことを指摘したいまだと思います。
Disclosures
著者は競争の興味を宣言しません。
Acknowledgments
仕事は、ヌーシャテル大学、スイスの全米科学財団 (31003A_156998 と 31003A_176191) からの助成金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaHCO3 | PanReac AppliChem | A0384 | |
| Tris | Biosolve | 0020092391BS | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7909 | |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | A2946 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | A2942 | |
| NaF | Sigma | S1509 | Toxic |
| PMSF | PanReac AppliChem | A0999 | Toxic |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | A0970 | |
| Triton X100 | Roche | 10789704001 | |
| Glycine | PanReac AppliChem | A1067 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043 | |
| Dithiothreitol (DTT) | PanReac AppliChem | A1101 | |
| SDS | PanReac AppliChem | A0675 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| HCl | VWR | 20252-290 | Corrosive |
| Sucrose | PanReac AppliChem | A3935 | |
| Murashige and Skoog medium with vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| Phytoagar | Duchefa Biochemie | P1003 | |
| Petri plate | Greiner Bio-one | 639102 | |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706 | |
| Ethanol | Fisher chemical | E/0600DF/15 | |
| Filter paper | Whatman | 10311804 | |
| Surgical tape | 3M | 1530-1 | |
| CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B) | GE Healthcare | 17-0430-01 | |
| Sintered glass filter | DURAN | 2515703 | |
| Centrifuge tube 50 mL | TPP | 91050 | |
| Purified immunoglobulin G (HsIgG) | MP Biomedicals | 855908 | |
| Rotating shaker | IKA | 4016000 | |
| NaN3 (sodium azide) | Sigma | 71290 | Toxic |
| Quick filtration material (Miracloth) | Merk-Millipore | 475855 | |
| Ultracentrifube XNP-80 | Beckman Coulter | A99839 | |
| Rotor SW 32 Ti | Beckman Coulter | 369650 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass teflon homogenizer (Potter) | Wheaton | 357426 | |
| Spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M1003 | |
| Filter 35µm for spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M513515 | |
| AcTEV | Invitrogen | 12575-015 | |
| Centrifugal evaporator (Speed Vac) | Eppendorf | 5305000100 | |
| FBN1A(PGL35) antibody | AgriSera | AS06 116 | RRID:AB_2247012 |
| Sand, Fontainebleau | VWR | 27460.295 |
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