Summary
Vi presenterer her en utprøvd og testet protokoll for rensing av chloroplast protein import komplekser (TOC-TIC komplekse) bruke trykk-koden. Ett-trinns affinitet-isolasjon protokollen kan potensielt brukes til alle protein og brukes til å identifisere nye samhandling partnere av massespektrometri.
Abstract
Chloroplast biogenesis krever import av kjernen-kodet proteiner i plastid. Import av disse proteinene er avhengig av translocon på ytre (Innholdsfortegnelsen) og indre (TIC) chloroplast membraner. Innholdsfortegnelse og TIC komplekser er multimeric og inneholder sannsynligvis ennå ukjent komponenter. Ett av hovedmålene i feltet er å etablere hele beholdningen av Innholdsfortegnelsen og TIC. For isolering av TOC-TIC komplekser og identifisering av nye komponenter endret preprotein reseptoren TOC159 har blitt N-Terminal med tillegg av tandem affinitet rensing (TAP) koden resulterer i trykk-TOC159. Trykk-koden er utformet for to sekvensiell affinitet rensing trinn (derav "tandem affinity"). Trykk-koden brukt i disse studiene består av et N-terminal IgG-bindende domene avledet fra Staphylococcus aureus Protein en (ProtA) etterfulgt av en calmodulin-binding peptid (CBP). Mellom disse to affinitet koder, en tobakk etse virus (TEV) protease cleavage nettstedet blitt inkludert. Derfor kan TEV protease brukes for mild elueringsrør av TOC159 inneholder komplekser etter binding til IgG perler. Protokollen presenteres her, ble det andre Calmodulin-affinity rensing trinnet utelatt. Rensing protokollen starter med forberedelse og solubilization av totale mobilnettet membraner. Etter vaskemiddel-behandling, er solubilized membran proteiner ruges med IgG perler for immunoisolation av trykk-TOC159-som inneholder komplekser. Bindende og omfattende vask, er trykk-TOC159 som inneholder komplekser kløyvde og løslatt fra IgG perler med den TEV protease der S. aureus IgG-bindende domenet er fjernet. Vestlige blotting av den isolerte TOC159 inneholder komplekser kan brukes til å bekrefte tilstedeværelse av kjent eller mistenkt Innholdsfortegnelsen og TIC proteiner. Enda viktigere, har TOC159 inneholder komplekser blitt brukt med hell å identifisere nye komponenter av innholdsfortegnelse og TIC komplekser av massespektrometri. Protokollen som presenterer vi potensielt kan effektiv isolasjon av noen membran-bundet protein kompleks som skal brukes til å identifisere ennå ukjent komponenter av massespektrometri.
Introduction
Planter avhengig chloroplasts for fotosyntesen og photoautotrophic vekst1. De aller fleste chloroplast proteiner er kodet i kjernen, syntetisert i stoffer og importeres til chloroplast via TIC og innholdsfortegnelse komplekser i konvolutten membraner2. Kjernen i Innholdsfortegnelsen kompleks består av to reseptoren GTPases Toc33 og Toc1593,4,5Toc75 protein-drive kanalen. TOC159 er viktig for biogenesis av chloroplasts og formidler massiv akkumulering av fotosyntesen-assosiert proteiner6. TIC komplekset består av TIC20 protein-drive kanalen, samt TIC110 og TIC407,8. Nylig en 1MD protein translokasjon complex på indre konvolutt membranen ble isolert og inneholdt tidligere uidentifiserte komponenter9, en av dem var TIC56. Vi har nylig co isolert TIC56 av det 1 MDa komplekse ved hjelp av trykk-TOC159 affinitet rensing protokollen. Dataene viser en strukturell overlapping mellom "kanoniske" Innholdsfortegnelsen/TIC komplekser og 1 MDa komplekse10. Tidligere ble ukjent komponenter som KOC1 også identifisert som nye samhandling partnere i Innholdsfortegnelsen og TIC komplekser med trykk-metoden beskrevet her10,11.
Dermed er trykk-tag rensing en effektiv metode for isolering av protein komplekser og identifikasjon av samspill partnere med påfølgende masse spectrometric analyse12. Trykk koden består av to IgG bindende gjentar atskilt fra en calmodulin-binding peptid (CBP) med en tobakk etse virus (TEV) protease cleavage området. Den opprinnelige metoden, bestående av et IgG-affinitet rensing skritt etterfulgt av TEV cleavage og påfølgende calmodulin affinitet kromatografi tillatt innfødt rensing av store og svært ren protein komplekser13,14 . Vi har forenklet prosedyren og vist at TOC159 inneholder protein komplekser kan også bli renset effektivt bruker bare IgG-affinitet rensing skritt etterfulgt av TEV-cleavage elueringsrør15. I vår erfaring, unnlatelse av calmodulin-affinitet trinnet resultert i høyere avkastning og kan derfor være hensiktsmessig for lav overflod proteiner.
Kort sagt, vi utviklet stabil transgene A. thaliana uttrykke trykk-TOC159 i ppi2 (toc159 KO mutant) bakgrunn og etablerte det som en pålitelig kilde for rensing av TOC-TIC komplekser. Protokollen for isolering av TOC-TIC komplekset starter med homogenisering av plantemateriale i en vaskemiddel uten buffer. Etter sentrifugering forkastes nedbryting. Pellet inneholder totalt membran brøkdel er solubilized med en detergent inneholder buffer. Etter en ultra-sentrifugering trinn brukes nedbryting som inneholder solubilized TOC-TIC komplekser IgG-harpiks for affinitet rensing. Etter flere vask trinn, elueringsrør utføres ved hjelp av en TEV protease inneholder buffer selektivt deler nedstrøms IgG-bindende domenene og forsiktig løslate innfødt TOC159 inneholder komplekser. Den TEV eluate kan analyseres direkte ved Western blotting eller massespektrometri å identifisere samhandling partnerne TOC15910,11,15. Metoden har også blitt brukt til å identifisere post-translasjonell modifikasjoner av TOC15915. I fremtiden, kan innfødt TOC159 inneholder komplekser brukes til strukturell studier med cryoelectron mikroskopi.
Protocol
1. forberedelse av Arabidopsis planter
- Forberede 1 L halv styrke av Murashige og Skoog (MS) middels inkludert vitaminer med 1% sukrose og justere pH til 5.7 med kaliumhydroksid (KOH). Legge til 0,8% av phytoagar og autoklav etter 20 min på 120 ° C.
- Hell 75 mL av MS medium per Petri plate (diameter 14,5 cm, høyde 3 cm) og tillate størkning 1t.
- Legg til 30 mg Arabidopsis thaliana frø slik 1,5 mL microfuge og overflaten sterilisere med 70% (v/v) etanol 0,05 prosent (v/v) Triton X-100 for 5 min, etterfulgt av 100% (v/v) etanol for 10 min. Fjern etanol.
- Overføre frøene til sterilt filter papir for å tørke. Dryss sterilisert frøene jevnt på en MS plate (hver genotype krever minst 8-10 plater), og forsegle hver plate med kirurgisk tape.
- Inkuber platene på 4 ° C i to dager i mørket synkronisere frø spiring. Overføring til en vekst kammer med følgende lys syklus: 8 h av 120 µmol m2 s−1 lys, og 16 h av mørke på 22-20 ° C.
2. forberedelse av HsIgG Agarose perler
- Avbryte CNBr-aktivert agarose perler (4 g) 100 mL 1 mM HCl og ruge i 30 min ved romtemperatur.
- Overføre agarose perler til filtere sintered glass, vask under vakuum med 100 mL 100 mM HCl og Gjenta 2 - 3 ganger.
Merk: Nedkjøling vaskeløsning 4 ° C. - Resuspend agarose perler i 1 mL av kaldt 100 mM HCl og overføre til en 50 mL konisk sentrifuge rør. Filteren sintered glass med 3 mL 100 mM HCl og overføre væske til samme rør.
- Spinn på 400 × g i 5 min på 4 ° C og fjerne nedbryting med en pipette.
Merk: Ikke Dekanter røret. - Resuspend perler i 50 mL av kopling buffer (tabell 1); Bland kort, og deretter spinne på 400 × g i 5 min på 4 ° C.
- Oppløse 50 mg lyofilisert Homo sapiens IgG (Hs-IgG) i 10 mL kopling bufferen, bland agarose perler forsiktig og ruge i roterende shaker overnatting på 4 ° C.
- Spinn på 400 × g i 5 min på 4 ° C og fjerne nedbryting med en pipette.
- Vask IgG-agarose perler med 50 mL av bufferen og spinn på 400 × g i 5 min på 4 ° C.
- Resuspend IgG-agarose perler med 50 mL av blokkering buffer (tabell 1) og spinn på 400 × g i 5 min på 4 ° C. Gjentas én gang.
- Resuspend IgG-agarose perler i 50 mL av blokkering buffer, rotere blandingen for 2 h på RT og spinn på 400 × g i 5 min på 4 ° C.
- Fjern nedbryting og resuspend IgG-agarose perler i 200 mL NaCl kopling buffer (tabell 1).
- Hvis du vil blokkere alle gjenværende cross-linking CNBr grupper, vask IgG-agarose perler med 100 mL 0.1 M glycine-HCl, pH 2.8. Spinn på 400 × g i 5 min på 4 ° C og fjerne nedbryting. Vask med 0,2 M glycine-HCl, pH 2.8, spinn på 400 × g i 5 min på 4 ° C og fjern nedbryting. Til slutt, vask IgG-agarose perler med 200 mL ultrapure vann.
- Vask IgG-agarose perler med 200 mL ultrapure vann og deretter 200 mL PBS buffer (tabell 1).
- Resuspend IgG-agarose perler i 20 mL PBS bufferen med 0,01% NaN3 (Natriumazid) og lagre på 4 ° C.
3. isolering og Solubilization membran brøkdel
- Grind 10 g av tre uker gamle A. thaliana frøplanter i flytende nitrogen med en kald morter sand.
- Legge til 20 mL kaldt sliping buffer (tabell 1) til 10 g av bakken vev, bland godt og tine på is.
- Filtrere homogenate gjennom to lag med rask filtrering materiale i en 50mL konisk sentrifuge rør. Nyt rask filtrering materiale med sliping buffer før filtrering.
- Sentrifuger filtratet i 10 min 1500 × g på 4 ° C og overføre nedbryting slik kjølt 50 mL konisk sentrifuge gjenta samme trinn én gang og samle nedbryting. Beholde et 200 µL utvalg av "total brøken" og lagre-80 ° c for senere analyse
- Overføre nedbryting til kalde 38.50 mL ultracentrifuge rør og topp opp til 35 mL med kaldt sliping buffer. Sentrifuger 1t 100.000 × g på 4 ° C i en ultracentrifuge.
- Overføre nedbryting slik 50 mL konisk sentrifuge. Beholde en 200 µL eksempel på "løselig brøkdel" og butikken på-80 ° C for senere analyse.
- Nytt suspendere det grønne pellet med et glass teflon homogenizer, sliping buffer. Sentrifuge 1t 100.000 × g på 4 ° C i en ultracentrifuge og kast nedbryting.
- Resuspend den grønne pellet i 18.75 mL 1 x sliping Buffer ved hjelp av en glass teflon homogenizer og legge 9.375 mL 1 x sliping buffer.
- Legge til 9.375 mL av 4 x solubilisation løsning (tabell 1) (inneholder TX-100 vaskemiddel) gi 37,5 mL og ruge i 30 min på en "roterende shaker" på 4 ° C.
- Sentrifuger 1t 100.000 × g på 4 ° C i en ultracentrifuge. Overføre nedbryting slik 50 mL konisk sentrifuge. Beholde et 200 µL utvalg av nedbryting (fremtidige "Last brøkdel") og butikk på-80 ° C for senere analyse.
- Resuspend pellet i 37,5 mL sliping buffer. Beholde prøven av uløselig del og butikk på-80 ° C
4. Immunoprecipitation
- Equilibrate 100 µL pakket IgG-agarose harpiks i Buffer A (tabell 1) og spinn på 100 × g i 5 min på 4 ° C.
- Fjerne nedbryting og resuspend IgG-agarose harpiks i 100 µL av Buffer A på 4 ° C.
- Overføre vasket IgG-agarose harpiks til det 37,5 mL av solubilized membraner og ruge over natten på en roterende shaker i et 50 mL konisk sentrifuge rør på 4 ° C.
- Sediment IgG-agarose harpiks på 100 × g i 5 min på 4 ° C og fjerne nedbryting med en pipette. Beholde et 200 µL utvalg av "flyten gjennom" og lagre-80 ° c for senere analyse.
- Vask IgG-agarose harpiks i 37,5 mL bufferen A og ruge i 10 min på en roterende shaker.
- Sediment IgG-agarose harpiksen på 100 × g i 5 min på 4 ° C, fjerne nedbryting med en pipette, legge til 5 mL av sliping Buffer A 15 mL sentrifuge rør og sentrifuger på 100 × g, 4 ° C, 5 min. Behold et 200 µL utvalg av "Vaske 1" og lagre-80 ° c for senere analyse.
- Gjenta det 5 mL vaske trinn tre ganger med Buffer A.
- Utføre de to siste vask trinnene uten hemmere (NaF, Protease hemmer og PMSF)
Merk: Hemmere er ikke lenger nødvendig på dette stadiet og unnlatt å redusere kostnadene. Beholde en 200 µL eksempel på siste vask trinn "siste vaske (W6)" og butikken på-80 ° C for senere analyse. - Overføre IgG-agarose harpiks til en 500 µL spinn kolonne med en 35 µm filter og vask perlene to ganger med 300 µL TEV elueringsrør bufferen (tabell 1) (ikke inneholder AcTEV) for balanse. Lukk kolonnen spinn.
- Legge til 300 µL TEV elueringsrør bufferen som inneholder 50 enheter (10 µL) av AcTEV. Klargjør blandingen i et rør før du legger til harpiks.
- Inkuber kolonnen spin med perler i en thermomixer på 16 ° C, 350 rpm for 2 h. Inverter kolonnen forsiktig flere ganger hver 30 min.
- Åpne kolonnen spinn, plasserer den i en ny ren 1,5 mL tube og spinn på 100 × g i 5 min på 4 ° C å samle eluate.
- Tørr (for eksempel) 10% (v/v) på eluted utvalget (~ 25 µL) i en sentrifugal fordamperen og bruke massespektrometri eller andre ytterligere analyse.
- Aliquot de gjenværende eluate (~ 275 µL) delt i elleve 1,5 mL sentrifuge rør (25 µL hver), tørr i en sentrifugal fordamperen, og lagre på-80 ° C.
- Analysere prøvene beholdt hele prosedyren samt eluates av standard SDS siden etterfulgt av immunoblotting. For eksempel forberedelse, bunnfall 50 µg av Total (T), Last (L), strømme gjennom (FT), vask 1 (W1) og 200 µL vask 6 (W6) av kloroform/metanol utvinning16.
- Legge til 10 µL av 2 x SDS-lasting buffer (tabell 1) utfelt prøvene og 25 µL av elut tørket prøve. Vortex og kok i 10 minutter ved 95 ° C i en varme blokk.
- Analysere Total (T), Last (L), strømme gjennom (FT), vask 1 (W1), vaske 6 (W6) og elueringsrør (E) av immunoblotting med anti-TOC159 antistoffer til å fastslå effektiviteten av isolasjon prosedyren.
Representative Results
Vi her beskrevet en protokoll for rensing av et trykk-merket chloroplast konvolutt protein kompleks fra transgene A. thaliana planter. Som vist i figur 1A, planter uttrykke 35S:NTAP-TOC159 konstruksjon ble brukt til å isolere Dette komplekset mens planter uttrykke 35S:NTAP Konstruer ble brukt som en kontroll. Figur 1 B viser detaljerte trinn for rensing av trykk-TOC159 protein komplekser etterfulgt av massespektrometri tillate identifikasjon av samspill proteiner. Immunoblot analyse (figur 2, høyre) bekrefter at isolert trykk-TOC159 samvirker med TOC75 og TOC33 av Innholdsfortegnelsen komplekset. Chloroplast ytre membran kinase KOC1 kjent for å phosphorylate TOC159 også co isolert med trykk-TOC159 komplekset (figur 2B, høyre). Tilstedeværelsen av TIC110 avslører at isolert trykk-TOC159 komplekset inneholder komponentene av TIC komplekset. FBN1A antistoffer reist mot et plastoglobule protein urelaterte protein Importer gjenkjente ikke trykk-TOC159 komplekset som angir fravær av forurensing. I kontrollen negative immunoprecipitated NTAP protein co isolere ikke med noen av TOC-TIC proteiner (figur 2, venstre) og bekrefter spesifisiteten av trykk-TOC159 rensing.
Figur 1 . Ordningen av konstruksjoner og affinitet rensing prosedyren. (A). 35S:NTAP-TOC159 konstruksjon, koding NTAP-TOC159 var stabilt uttrykt i Arabidopsis thaliana. Negativ control planter uttrykt 35S:NTAP Konstruer, koding trykk-koden alene. (B). trinn klok affinitet rensing protokollen består av membran isolasjon og solubilization, IgG agarose immuno-rensing, vasker, TEV protease cleavage og elueringsrør. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Tandem affinitet rensing av TOC159 protein. N-Terminal trykk-merket TOC159 var renset fra NTAP-TOC15:ppi2 Arabidopsis planter og trykk protein renset fra SPRINGEN: WT planter ble brukt som en negativ kontroll. Totalt protein ekstrakter (T), solubilized membran proteiner = Last brøkdel (L), strømme gjennom (FT), første og siste vask brøker (W1 og W6) og 10% av den TEV eluate ble analysert av vestlige blotting. Membranen undersøkt med antistoffer mot TOC159 (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950), og FBN1A (AT4G04020). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Tabell over buffere | ||
| Kopling Buffer | NaHCO3 Justere pH 8.5 justere pH med 0.1 M Na2CO3 |
100 mM |
| Blokkerer Buffer | Tris-HCl Justere pH 8 med HCl. |
100 mM |
| PBS Buffer | Na2HPO4 KH2PO4 NaCl KCl Justere pH 7.3 med HCl. |
4.3 mM 1.4 mM 137 2.7 |
| NaCl kopling Buffer | Koplingen buffer NaCl |
1 M |
| 2 x sliping Buffer | Tris-HCl, pH 7.5 med HCl. NaCl NaF PMSF Anlegget protease hemmer cocktail |
100 mM 200 mM 5 mM 1 mM 0,20% |
| 4 x solubilisation løsning | Glyserol Triton-X100 |
40% 3% |
| Buffer A | 2 x sliping Buffer 1 x sliping Buffer 4 x solubilisation løsning |
100 ml 50 ml 25 ml 25% |
| TEV elueringsrør Buffer | Tris-HCl, pH 8 med HCl EDTA, pH 8 med HCl NaCl Glyserol Triton-X100 DTT |
50 mM 0,5 mM 100 mM 10% 0,75% 1 mM |
| 2 x SDS-lasting Buffer | Tris-HCl pH 6.8 med HCl SDS Glyserol Bromophenol blå DTT |
0.1 M 4% 20% 0,20% 0,2 M |
Tabell 1. Bufferen oppskrifter.
Discussion
Vi vist at et enkelttrinn trykk tag rensing er en bestemt og effektiv metode for rensing av Arabidopsis TOC-TIC komplekset. Selv om trykk-koden vil tillate to påfølgende rensing trinn (IgG-etterfulgt av calmodulin affinitet rensing etter TEV protease-cleavage), tror vi at i mange tilfeller affinitet steg etterfulgt av TEV protease cleavage vil være tilstrekkelig. Vårt mål, TOC159, er lav rikelig og inkludering av andre calmodulin-affinitet trinn overdrevet redusert protein avkastningen som var Hovedårsaken til utelate det fra vår nåværende protokollen. TEV-tilsettes i seg selv er svært bestemt og milde rensing som slipper bare trykk-merket målet sammen med tilknyttede samhandling partnere mens forurensende proteiner stikker nonspecifically til IgG harpiks vil fortsatt være der. Således, i kombinasjon med IgG-affinitet trinn, TEV tilsettes resulterer i en tilstrekkelig effektiv rensing for våre og sannsynligvis mange andre formål.
Må utvises at Konstruer trykk-merket er fullt funksjonell i vivo. Trykk merking kan ha potensielt skadelige effekter på protein aktivitet, stabilitet eller lokalisering. TOC159 består av tre domener, N-terminal surt domenet, sentrale GTP-bindende domene og C-terminalen membran domene, som forankrer TOC159 i ytre chloroplast membran2. For å unngå forstyrrelser med membran innsetting, smeltet vi trykk-koden til N-terminus av TOC159. Fusion å N-terminus er heller unntaket enn regelen. Mange proteiner inneholder N-terminal målinformasjon og bør derfor ved merket på C-terminus. Vi forsikret at TOC159 er funksjonelle i vivo ved complementation av ppi2 mutant (en albino mutant mangler TOC159) med trykk-TOC159. Redning av grønne, vill type fenotypen indikerte trykk-TOC159 funksjonell15.
Rensing protokollen ble brukt til å identifisere nye samhandling partnere av TOC159, som inkludert KOC1 og TIC5610,11. Totalt var 30 proteiner assosiert med komplekse antyder at ny samhandling partnere vil bli isolert og preget i nær fremtid. Mens vi anbefaler trykk-koden for komplekse rensing, ønsker vi fortsatt å påpeke at flere versjoner til den presenteres her finnes og kan være svært nyttig for enkelte programmer.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet av tilskudd fra Swiss National Science Foundation (31003A_156998 og 31003A_176191) og University of Neuchatel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaHCO3 | PanReac AppliChem | A0384 | |
| Tris | Biosolve | 0020092391BS | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7909 | |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | A2946 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | A2942 | |
| NaF | Sigma | S1509 | Toxic |
| PMSF | PanReac AppliChem | A0999 | Toxic |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | A0970 | |
| Triton X100 | Roche | 10789704001 | |
| Glycine | PanReac AppliChem | A1067 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043 | |
| Dithiothreitol (DTT) | PanReac AppliChem | A1101 | |
| SDS | PanReac AppliChem | A0675 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| HCl | VWR | 20252-290 | Corrosive |
| Sucrose | PanReac AppliChem | A3935 | |
| Murashige and Skoog medium with vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| Phytoagar | Duchefa Biochemie | P1003 | |
| Petri plate | Greiner Bio-one | 639102 | |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706 | |
| Ethanol | Fisher chemical | E/0600DF/15 | |
| Filter paper | Whatman | 10311804 | |
| Surgical tape | 3M | 1530-1 | |
| CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B) | GE Healthcare | 17-0430-01 | |
| Sintered glass filter | DURAN | 2515703 | |
| Centrifuge tube 50 mL | TPP | 91050 | |
| Purified immunoglobulin G (HsIgG) | MP Biomedicals | 855908 | |
| Rotating shaker | IKA | 4016000 | |
| NaN3 (sodium azide) | Sigma | 71290 | Toxic |
| Quick filtration material (Miracloth) | Merk-Millipore | 475855 | |
| Ultracentrifube XNP-80 | Beckman Coulter | A99839 | |
| Rotor SW 32 Ti | Beckman Coulter | 369650 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass teflon homogenizer (Potter) | Wheaton | 357426 | |
| Spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M1003 | |
| Filter 35µm for spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M513515 | |
| AcTEV | Invitrogen | 12575-015 | |
| Centrifugal evaporator (Speed Vac) | Eppendorf | 5305000100 | |
| FBN1A(PGL35) antibody | AgriSera | AS06 116 | RRID:AB_2247012 |
| Sand, Fontainebleau | VWR | 27460.295 |
References
- Jarvis, P., López-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Kessler, F., Schnell, D. Chloroplast biogenesis: diversity and regulation of the protein import apparatus. Current opinion in cell biology. 21 (4), 494-500 (2009).
- Schnell, D. J., Kessler, F., Blobel, G. Isolation of components of the chloroplast protein import machinery. Science. 266 (5187), 1007-1012 (1994).
- Kessler, F., Blobel, G., Patel, H. A., Schnell, D. J. Identification of two GTP-binding proteins in the chloroplast protein import machinery. Science. 266 (5187), 1035-1039 (1994).
- Jarvis, P., et al. An Arabidopsis mutant defective in the plastid general protein import apparatus. Science. 282 (5386), 100-103 (1998).
- Bauer, J., et al. Essential role of the G-domain in targeting of the protein import receptor atToc159 to the chloroplast outer membrane. The Journal of cell biology. 159 (5), 845-854 (2002).
- Kovacs-Bogdan, E., Soll, J., Bolter, B. Protein import into chloroplasts: the Tic complex and its regulation. Biochimica et biophysica acta. 1803 (6), 740-747 (2010).
- Nakai, M. The TIC complex uncovered: The alternative view on the molecular mechanism of protein translocation across the inner envelope membrane of chloroplasts. Biochimica et biophysica acta. 1847 (9), 957-967 (2015).
- Kikuchi, S., et al. Uncovering the protein translocon at the chloroplast inner envelope membrane. Science. 339 (6119), 571-574 (2013).
- Kohler, D., et al. Characterization of chloroplast protein import without Tic56, a component of the 1-megadalton translocon at the inner envelope membrane of chloroplasts. Plant physiology. 167 (3), 972-990 (2015).
- Zufferey, M., et al. The novel chloroplast outer membrane kinase KOC1 is a required component of the plastid protein import machinery. The Journal of biological chemistry. 292 (17), 6952-6964 (2017).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Rohila, J. S., Chen, M., Cerny, R., Fromm, M. E. Improved tandem affinity purification tag and methods for isolation of protein heterocomplexes from plants. The Plant journal. 38 (1), 172-181 (2004).
- Rohila, J. S., et al. Protein-protein interactions of tandem affinity purified protein kinases from rice. PloS one. 4 (8), 6685 (2009).
- Agne, B., et al. The acidic A-domain of Arabidopsis TOC159 occurs as a hyperphosphorylated protein. Plant physiology. 153 (3), 1016-1030 (2010).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
