Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

肾小球的分离及肾小球细胞表面蛋白的活体标记

doi: 10.3791/58542 Published: January 18, 2019

Summary

在这里, 我们提出了一个协议的小鼠体内标记肾小球细胞表面蛋白与生物素.该协议包含有关如何灌注小鼠肾脏, 分离肾小球, 并执行内源性免疫沉淀的感兴趣的蛋白质的信息。

Abstract

蛋白尿是由被过滤的内皮细胞、肾小球基底膜和带缝隙膜片组成的肾小球滤池的破坏引起的。肾小球滤池的微妙结构, 特别是裂隙膜片, 依赖于不同细胞表面蛋白质的相互作用。到目前为止, 对这些细胞表面蛋白的研究仅限于体外研究或组织学分析。在这里, 我们提出了一个小鼠体内生物素化标记方法, 使我们能够研究肾小球细胞表面蛋白在生理和病理生理条件下。该协议包含有关如何灌注小鼠肾脏, 分离肾小球, 并执行内源性免疫沉淀的感兴趣的蛋白质的信息。这种新方法可以对肾小球细胞表面丰度进行半定量, 并可研究生物素灌注和免疫沉淀所能获得的所有蛋白质。此外, 通过在生物素化或不生物素化的情况下分离肾小球, 可以进一步分析肾小球 rna 和蛋白质以及原代肾小球细胞培养 (原代肾小球细胞培养)。

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

蛋白尿是肾小球损伤的标志, 通常伴随肾小球滤池 1的破坏。肾小球滤池由被过滤的内皮细胞、肾小球基底膜和足细胞组成。肾小球滤池的微妙分子结构是高度动态的, 在健康和患病的肾脏2,3,4, 5, 6 都容易发生细胞表面蛋白贩运.细胞表面蛋白的内分泌已被证明是至关重要的生存的足细胞7。肾素和足苷酸是在足细胞上表达的跨膜蛋白。肾素是肾小球裂隙膜片的主干, 而 podocalyxin 是一种四聚糖蛋白, 包覆于足部 8910 的次生足部过程。此前, 已经显示肾素和 podocalyxin3111213、14的内分泌贩运。

据我们所知, 细胞表面蛋白的内吞尚未在肾小球内皮细胞中被描述在文献中。然而, 内皮细胞一般表达所有必要的蛋白质为不同类型的内吞 (即, clathrin 依赖, 流依赖性内吞)15,16。因此, 可以用这种方法研究内皮细胞表面的移植, 例如, 使用血管内皮 (ve)-钙粘蛋白和细胞内粘附分子 (icam-2) 作为肾小球内皮细胞17的细胞表面标记蛋白.

遗憾的是, 对于可以研究细胞表面蛋白质贩运的精细三层肾小球滤池, 目前还没有准确的体外模型。因此, 这种方法的目的是研究体内肾小球蛋白贩运。此外, 该协议还包含有关如何分离肾小球的信息, 从而能够进一步分析肾小球 rna、蛋白质或细胞。不同的组 18,19描述了类似的肾小球分离技术。

此前, 我们和其他人使用了生物素化2342021对肾小球细胞表面蛋白进行外标记。然而, 在这种体外方法中, 孤立的肾小球暴露在机械应力下, 这可能会影响细胞内贩运。另外, 肾小球细胞表面蛋白的免疫荧光标记已被广泛应用于文献22022.然而, 使用这种方法, 只有少量的蛋白质可以在一张幻灯片内进行分析, 并且免疫荧光图像的定量往往是困难的。

这种新的体内方法为研究健康和患病肾脏中肾小球细胞表面蛋白质丰度和贩运提供了可靠的工具, 可作为免疫荧光检测的补充。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

老鼠是从当地动物护理设施或法国 janvier 实验室获得的, 作为一种内部品种。调查是根据《实验动物护理和使用指南》 (美国国立卫生研究院85-23 出版物, 1996年修订) 中概述的准则进行的。所有动物实验都是按照相关机构批准进行的 (州政府 lanuv 参考编号 az:84-02.0 04)。2016. a435)。

1. 仪器、解决方案和设备的准备

  1. 制备1升磷酸盐缓冲盐水, 辅以 1 mm 氯化镁 (mgcl 2)和 0.1 mm 氯化钙 (cacl 2) (pbscm), 并通过无菌过滤器进行过滤。
  2. 准备5毫升的无菌 pbscm 每只小鼠灌注, 并将其放置在冰上。
  3. 为每只小鼠准备5毫升无菌 pbscm, 辅以 0.5 mg/ml 生物素。
  4. 对于每只小鼠, 准备5毫升无菌 pbscm, 并添加 0.8 x10 8磁珠 (例如, 在不经过预处理的情况下, 为 4 x 108beads\ ml 溶液添加200微米升的磁珠), 用于肾小球的栓塞。在细胞培养工作台下准备此溶液, 以保持原来管中的磁珠无菌。将此解决方案放在冰上。
  5. 在 pbscm (每只小鼠5毫升) 中加入 100 mm 甘氨酸, 并将其保持在冰上, 从而制备淬火溶液。
  6. 在无菌 pbscm 中制造胶原酶溶液 (0.378 u/ml 胶原酶 a)。每鼠标, 液器1毫升的胶原酶溶液成一个2毫升管, 并将其放置在冰上。
  7. 对于洗涤, 请在50毫升管中制备无菌 pbscm (见步骤 1.1), 并将其放置在冰上。
  8. 对于灌注, 请使用流量为 2.0 ml/min 的注射器泵。
  9. 准备一个10毫升注射器与21g 针。将针尖放入20-30 厘米长的导管 (内径, id = 0.58 mm)。用10厘米短的导管 (id0.28 mm) 连接导管 (id0.58 mm), 并将较小的导管斜的尖端切割成很容易插入小鼠主动脉。
  10. 对于手术过程中的结扎手术, 每只小鼠可切割 3条5-7 厘米的丝线 (4-0 至 6-0)。
  11. 手术时, 准备3个手术夹具, 2个手术剪刀, 2个推子, 2个精细的推子, 1个精细的剪刀, 和棉签。准备麻醉 (例如,腹腔麻醉氯胺酮 100 mg/kg 体重和 xylazine 5 mg kg 体重)。
  12. 对于两个肾脏的肾小球的隔离, 使用100μm 的细胞过滤器、两个50毫升管和一个磁铁捕手。
  13. 制备 chaps 裂解缓冲液:20 mm3-[(3-胆碱丙基) 二甲基氨酸]-1-丙基磺酸 (chaps);20 mm tris (羟基甲基)-氨基 (tris) ph 值 7.5;50 mm sodiumchorlide (ncl);50 mm 钠氟化物 (naf);15 mmna 4p2o7;0.1 mm 乙二胺四乙酸 (edta) ph 值 8.0;2 m 硫醇;和 2 mm 腺苷酸荧光粉 (atp)。
  14. 冷却离心机至4°c。

2. 显微镜下的手术

  1. 对鼠标进行麻醉 (例如,用酮胺/腹腔, 见步骤 1.11)。执行脚趾夹紧测试, 以确认适当的麻醉。
  2. 用70% 异丙醇消毒小鼠腹侧。
  3. 通过骨盆到胸骨的皮肤进行中位切割, 用推子将皮肤从腹部筋膜中取出。用手术剪刀将腹部中间两侧的皮肤剪断。
  4. 更换手术工具。通过腹部肌肉层将从西普的中位切割到膀胱, 并使用推子和手术剪刀将其分为四个象限。用两个手术夹具将上两个用夹子固定在老鼠的脖子上。
    注: 腹部现在被打开。
  5. 用无菌棉签将内脏放在一边, 用精细的剪刀切割肝韧带。
  6. 准备结扎 (与丝线4-0 至 6-0) 周围的主动脉近端肾上腺的高度与两个精细的推子。收紧主动脉近端结扎术, 用推子消除血液流动。
  7. 将主动脉远端从筋膜、脂肪和其他组织中解救出来, 并使用精细的手术推拿器准备肾动脉肝-肠系膜动脉颅骨周围的结扎术。
  8. 准备结扎 (与丝线4-0 至 6-0) 周围的主动脉远端的肾动脉, 并夹紧静脉和主动脉在分叉的高度。
  9. 在主动脉远端的主动脉上切一个小孔, 使这个洞的直径是主动脉的一半。将导管插入主动脉, 并与准备好的结扎固定。
    注意: 避免灌注系统中的气泡, 以防止空气栓塞。
  10. 以 2 ml/min 的流速开始用冰凉 pbscm 进行灌注。
  11. 用精细的手术剪刀将一个洞切入肾动脉水平的肾静脉, 并收紧肝和肠系膜动脉周围的结扎。
    注: 肾脏应在开始灌注后变得苍白。

3.活体生物素化

  1. 将无滑注射器的气泡改为冰凉 pbscm, 辅以 0.5 mg/l 生物素用于表面标签, 并在 2 mlmin 的流量下对5毫升的肾脏进行灌注。
    注: 将 pbscm 解决方案 (例如,通过转动50毫升管) 轻轻混合, 以避免在溶液中形成气泡。在注射器内吸入溶液后, 从注射器中排出任何气泡或空气。在注射器上使用额外的插管 (21g) 来填充连接到导管系统的插管中的空间。最后, 将注射器与没有气泡的导管粘在插管中。
  2. 将无滑注射器的气泡改为冰凉的 pbscm, 再加上 100 mm 甘氨酸, 在 2 mlp 最小的流量下, 以 5 ml 的速度淬火肾小球和灌注。
  3. 将无滑注射器的气泡改为冰凉 pbscm, 再加上200μl 磁性 beadsml, 并在2mlmmin 进行灌注肾脏。
    注: 在肾脏表面, 用棕色磁珠栓塞肾小球将是可见的。

4. 从两个肾脏中分离出肾小球

  1. 取下肝门的肾脏, 取出胶囊。将肾脏放在10厘米细胞培养盘中的 pbscm 15 毫升的冰上。在摘除肾脏后, 在麻醉下对小鼠进行颈椎脱位的安乐死。手术和灌注手术持续约20-22分钟。
  2. 使用新的双刃刀片将肾脏切成最小的碎片。将组织移动到含有1毫升胶原酶 a 的2毫升管中 (见步骤 1.6), 并在37°c 下消化30分钟。消化前后, 用1000μl 切割的移液器轻轻搅拌。
  3. 使用冰凉 pbscm, 通过100μm 的细胞过滤器冲洗消化后的组织。轻轻地使用细胞刮刀切碎剩余的组织槽细胞过滤器, 然后用冰凉 pbscm 冲洗它到总容量50毫升。
  4. 在 4°c 500 x g 下离心悬浮液 5分钟, 在循环处理颗粒时, 取出上清液, 以略小于 1.5 ml 的冰凉 pbscm 重新悬浮颗粒。随后, 将肾小球悬浮液放入新的2毫升管中。

5. 清洗

  1. 使用磁铁捕手将肾小球拉到一侧。等待 1分钟, 才会向磁铁移动。
  2. 当2毫升管留在磁体捕手中时, 用1000μl 移液器取出上清液。在第一和第二清洗步骤 (见步骤 5.3) 中, 250 微米的上清液仍留在试管中, 以避免肾小球的损失。快速执行此过程, 以避免使管状结构沉入管底。
    注: 否则, 清洗过程将持续更长的时间。
  3. 从磁体捕手中取出2毫升管, 加入1毫升 pbscm, 上下移液器 (非常重要), 然后涡旋。
  4. 将管子放回磁铁捕手中, 然后从步骤5.2 重新开始。
  5. 重复洗涤步骤, 直到肾小球的纯度达到90%。为此, 请在显微镜下 (40-100x) 检查上清液的代表性位基因。
    注: 肾小球将显示为含有棕色磁珠的圆形结构。伸长的结构是管状的碎片, 自由磁珠表现为棕色圆点。细胞碎片可能会出现笨重的结构。
  6. 如果达到纯度, 通过溶解 pbscm 1 毫升中的肾小球来估计肾小球的数量。混合后, 取10μl 的, 并在显微镜下计数肾小球。用以下公式计算肾小球的数量: 在 10μl aliquot x 100 中的最终肾小球数 = 肾小球数。
  7. 成功隔离肾小球可获得 10, 000-40000 的肾小球范围。

6. 蛋白质提取和免疫沉淀 (ip)

  1. 在 4°c 6800 x 克的离心下收集肾小球, 在 6800 x 克的温度下离心 5分钟, 在使用磁铁捕手时取出上清液, 并在冰冷的裂解缓冲液中重新悬浮颗粒 (例如, 300μl 中的 30, 000 肾小球;chaps, 见步骤 1.11)。用组织均质机在30秒的最高速度对样品进行均质化, 并将其在冰上裂解30分钟。
  2. 在4°c 的温度下, 以 15, 000 x 克离心 30分钟, 去除不溶性材料。将包括细胞裂解液的上清液移液输送到一个新的 1.5 ml 管中。丢弃颗粒。
  3. 按照制造商的指示, 使用基于双氯化物 (bca) 的方法测量上清液的蛋白质浓度。成功裂解 30, 000 肾小球产量为 700-1000μg/ml 的肾小球蛋白。调整到等于蛋白质量与裂解缓冲液。
  4. 取肾小球裂解液总体积的 10%, 在95°c 孵育5分钟前加入 2x laemmli + 二硫醇 (dtt)。
  5. 对于 ip, 在4°c 的头顶振动台上, 用链霉素琼脂糖珠在夜间孵育其余的裂解物。
  6. 离心琼脂糖珠在1000xg 下 3分钟, 在4°c 下 3分钟, 去除上清液, 并加入800μl 的裂解缓冲液清洗珠子, 以获得非特异性蛋白质结合。
  7. 重复洗三次, 并完全取出上清液。
  8. 加入30μl 的 2x laemmli + dtt, 在95°c 孵育5分钟。
  9. 将裂解液和 ip 探针装上 10% sds 凝胶, 以 70 v 的速度运行 30分钟, 然后以每种凝胶 20 ma 的速度运行1.5 小时, 然后将凝胶在 200 ma 的温度下在硝化纤维素膜上涂布2小时。
  10. 用5% 的牛血清白蛋白 (bsa) 在洗涤缓冲液中隔夜阻断硝化纤维素膜。
  11. 在4°c 条件下, 用感兴趣的抗体连夜培育膜。用洗涤缓冲液清洗 3次, 在振动台上清洗 5分钟, 并在室温下用 hrp 标记的二级抗体孵育膜1小时。重复清洗步骤。
  12. 使用带有 ccd 摄像机的超分辨率化学发光剂, 可在膜上显示溶酸盐和免疫沉淀探针。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

为了准确地分离肾小球, 必须先用 pbscm 灌注小鼠肾脏。pbscm 灌注使肾脏变白 (图 1a)。用磁珠栓塞肾小球将可见于肾脏表面的棕色圆点 (图 1b)。用捕磁器分离肾小球可能显示肾小管污染 (图 1c)。在进一步分析肾小球之前, 需要通过更彻底地清洗肾小球来达到 > 95% 的肾小球纯度 (图 1d)。

体内生物素化依赖于用生物素标记细胞表面蛋白质的能力。为了研究这个问题, 小鼠肾脏中注入了 pbscm 或非细胞膜透透生物素。如图 2所示, 生物素标记在生物素灌注, 但不控制小鼠肾脏的毛细血管循环。为研究体内生物素灌注标记的肾小球细胞表面蛋白, 对肾小球提取物的生物素组分进行免疫沉淀。图 3小球跨膜蛋白、软糖蛋白和 podocalyxin in 在生物素分数范围内具有免疫沉淀作用。然而, 在对照小鼠中, 在生物素化蛋白的免疫沉淀分数中没有检测到肾素或 podocalyxin in。作为一种阴性对照, 细胞内蛋白细胞外信号调节激酶 p42 和 p42 (erk) 在控制和生物素灌注小鼠肾脏的生物素化蛋白免疫沉淀分数中没有发现。为了证实细胞表面蛋白肾实际上是由这种方法生物素化的, 肾素是由对照和生物素灌注小鼠肾脏沉淀而成的。为了可视化生物素, 免疫沉淀分数被染色链霉素。图 3b显示生物素在生物灌注中的神经素, 但不控制动物。裂解液控制表明, 在控制和生物毒素灌注动物中, 蛋白质含量相等。内皮蛋白血管内皮 (ve)-钙粘蛋白在生物素组分内进行免疫沉淀, 如图 3c 所示。在对照小鼠中, 无 ve-钙粘蛋白沉淀, 而 ve-钙粘蛋白存在于对照和生物素灌注动物的裂解物中。细胞内粘附分子 2 (icam-2) 是由生物素灌注动物沉淀而成, 在对照动物中没有 icam-2。控制和生物素灌注动物的裂解物显示出相同数量的 icam-2 (图 3c)。行动作为装载控制。

该方法可用于量化肾病模型 (肾毒性肾炎、ntn) 中肾小球细胞表面蛋白的数量。在 ntn 的早期 [第1天 (1 d) 后, ntn 血清注射], 蛋白尿迅速增加。在 ntn 的后期 [第18天 (18 d)], 蛋白尿显著减少。图 4显示了早期 ntn (1 d) 中的肾素细胞表面丰度。体内生物素化试验 (图 4a) 显示, 与对照组相比, ntn 动物的细胞表面苯二酚含量有所下降。密度计分析显示, 与对照组相比, ntn 动物的生物素化肾 (57%) 显著减少 (图 4c)。对肌动蛋白总肾的定量分析显示, 对照组与 ntn 小鼠之间无显著性差异 (图 4b)。使用 p57 p57 pdocyte 细胞特异性染色, podocyte 数字在 ntn 中显示相等的数量, 并控制动物 (图 4d4D)。图 5显示了 ntn 晚期肾素细胞表面丰度的结果 (18 d)。图 5a显示了控制体内的生物素化分析, ntn 小鼠表明细胞表面的肾毒素已恢复。密度计分析显示, 在对照和 ntn 小鼠方面, 细胞表面肾素没有显著差异 (图 5b)。ntn 小鼠的肾总蛋白减少了 25% (图 5c)。与对照组相比, ntn 小鼠的 podocyte 数量减少了约 19% (图 5d5D)。

Figure 1
图 1: 肾灌注和肾小球的隔离.(a) 用 pbscm 灌注后, 通过显微镜观察小鼠的位点。主动脉中的导管用箭头表示。pbscm 灌注后, 肾脏变得苍白。(b) 磁珠栓塞肾小球在肾表面呈褐色圆点。(c) 通过显微镜观察 (棕色圆形结构) 的污染;ii) 带管状物 (轻质拉长结构);和 iii) 细胞碎片。肾小球的纯度约为50%。自由磁珠显示为棕色圆点 (放大倍率 100x)。(d) 通过显微镜观察肾小球纯度为 95% (放大倍率 100x)。刻度条 = 100μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2:在肾小球毛细血管循环中检测到的生物素.具有代表性的小鼠肾小球免疫荧光图像 (c57bl6) 与 pbscm (对照) 和生物素 (生物素) 灌注。生物素 (绿色) 仅在生物素灌注小鼠的肾小球毛细血管循环中被链霉素所显示。对照小鼠不显示肾小球生物素染色。在两只小鼠的足细胞核中检测到 wt1 (红色)。这一数字已从以前的出版物20中修改。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3:小球细胞表面蛋白的体内生物素标记.(a) 对 pbmmcmtcm 灌注 (对照) 和生物素灌注 (生物素) 小鼠的免疫沉淀 (ip) 生物素化细胞表面蛋白 (ip:strepttvidin 琼脂糖珠) 和肾脏裂解物 (裂解物) 进行西方印迹分析。仅在生物灌注小鼠肾脏的免疫沉淀样本中检测到跨膜蛋白肾和 podocalyxin。在对照小鼠中, 在对照小鼠肾脏的免疫沉淀探针中没有检测到肾素和足霉素。在控制和生物素灌注动物的裂解物中, 总肾和 podocalyxin 在两组中都有平等表达。细胞内蛋白外信号调节激酶 p42 和 p42 (erk) 未检测到免疫沉淀探针的控制和生物素灌注小鼠肾脏。在两个鼠标组的溶酶中, 检测 erk 的数量相等。肌动蛋白被染色作为一个装载控制。(b) 对 pbscm 灌注小鼠 (对照) 和生物素灌注小鼠免疫沉淀的苯甲酸酯 (ip:α-nefhrin) 进行西方印迹分析。在生物素灌注肾中, 用链霉素染色显示肾素, 而在对照小鼠中没有检测到肾素。肾的免疫沉淀分数 (ip:α-肾素, wb:nefrin) 以及为肾素染色的裂解物分数 (裂解液, wb:nefrin) 显示出相同数量的肾素。活动被用作加载控制。(c) 对 pbscm 灌注小鼠 (对照) 和生物素-灌注剂 (生物素) 小鼠的免疫沉淀生物素化细胞表面蛋白 (ip:strepttvidin 琼脂糖珠) 和肾脏裂解物 (裂解物) 进行西方印迹分析。跨膜标记蛋白血管内皮 (ve)-钙粘蛋白和细胞内粘附分子 2 (icam-2) 仅在生物灌注动物的免疫沉淀部分检测。在对照小鼠中, 未检测到 ve-钙粘蛋白或 icam-2。行动作为一个加载控制。这一数字已从以前的出版物20中修改。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4肾小球蛋白肾丰富于早期肾毒性肾炎肾病 (ntn).(a) 对控制和肾毒性血清处理小鼠 (ntn 1d) 的表面肾素 (ip:α-肾素, wb:streptavidin) 和总肾素 (ip:α-nefferin 或裂解物, wb:neferin) 进行西方印迹分析。行动作为一个加载控制。与对照组相比, ntn 治疗的小鼠显示细胞表面肾素 (ip:α-肾素, wb 链霉素) 比对照组有所减少。(b) 对照组和 ntn 1d 小鼠的总肾素含量的定量分析 [对照 n = 4, ntn = 6, 无显著性差异 (ns)]。(c) 对照组和 ntn 小鼠 (* p < 0.01, 对照 n = 4, ntn = 6) 细胞表面肾素 (生物素化肾总肾) 的密度计分析。(d) p57 的免疫组织化学显示在控制和 ntn 1d 小鼠。(e) 对每簇面积 (μm2) 的 p57 阳性细胞进行定量分析。(每只小鼠40个肾小球量化, ns)。西方印迹数据显示的手段±sdd. podocyte 计数显示的手段±sem. 未配对 t-测试与韦尔奇的校正.刻度杆 = 50μm。这一数字已从以前的出版物20中修改。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5肾小球蛋白肾丰度在晚期肾毒性肾炎肾病 (ntn) 中的含量.(a) 对控制和肾毒血清毒性小鼠 (ntn 18 d) 的表面肾素 (ip:α-肾素, wb:streptavidin) 和总肾素 (ip:α-肾素或裂解物, wb:neferin) 进行西方印迹分析。与对照相比, ntn 18 d 小鼠显示出相同数量的细胞表面肾 (ip:α-肾素, wb:streptavidin)。ntn 在第18天治疗的小鼠表现出的总肾素较少, 肌动蛋白作为负载控制。(b) 密度测量分析显示对照组与 ntn 18 d 小鼠 (对照组 n = 4、ntn n = 3) 之间的细胞表面肾素无显著差异。(c) 对肌动蛋白的总肾进行密度计分析。在第18天的 ntn 小鼠中, 与对照组 (对照 n = 4、ntn = 3、* * p < 0.001) 相比, 肾素的表达较少。(d) p57 的免疫组织化学显示在控制中的足细胞和 ntn 18 d 小鼠。与对照组相比, ntn18 d 小鼠的 p57 阳性细胞 (红色) 较少。磁珠显示为黑点。(e) 对每个肾小球簇面积 (μm 2) (* * * p< 0.0001, 控制 n = 2, ntn n = 2, 每只小鼠40个肾小球进行定量分析)。西方印迹数据显示的手段±sdt. 后药计数显示的手段±sem. 统计分析: 未配对t-测试与韦尔奇的校正。刻度杆 = 50μm。这一数字已从以前的出版物20中修改。请点击这里查看此图的较大版本.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

该方法可以成功地分离肾小球, 以研究肾小球 rna 或蛋白质。此外, 原代肾小球细胞培养可以从分离的肾小球进行。如果生物素是在肾小球分离之前应用的, 则可以对肾小球细胞表面蛋白进行标记。利用该方法可以研究体内肾小球细胞表面蛋白的贩运, 并可对蛋白质丰度进行半定量。成功检测肾小球细胞表面蛋白丰度的最关键步骤是: 1) 发展小鼠手术方面的手工专业知识, 特别是主动脉插管, 2) 注射器无气泡连接, 以避免空气栓塞。肾小球, 3) 在冰寒条件下工作, 一旦开始与 pbscm 灌注已经开始。

对于这种技术, 在小鼠手术的手动专业知识是必不可少的。主动脉的插管尤其重要, 因为血管的解剖会防止肾脏的灌注。主动脉的切口应该足够大 (大约是血管直径的 50%), 以创造足够的空间来引入导管。如果将导管对角线切割, 将导管引入主动脉会更容易。除解剖外, 引入的导管应放置在主动脉高的位置, 以免阻塞肾动脉。否则, 肾动脉将不会与生物素和磁珠灌注。

生物素是一种与链霉素蛋白具有高度亲和力的小维生素。由于其体积小 (244 达), 生物素不会改变共轭蛋白的功能, 并将通过肾小球过滤。通过与链霉素的培养, 生物素化蛋白可以很容易地从无标记的蛋白质中分离琼脂糖珠或其他方法。n-羟基琥珀酰亚胺酯 (nhs) 的生物素结合到胺 (-nh2) 组的蛋白质, 这是丰富的赖氨酸残留链, 例如。如果细胞膜完好, 磺胺-nhs-lc-生物素是水溶性和细胞不渗透的。磺胺-nhs-lc-b想见素已被证明可以标记细胞表面蛋白 23。将生物素国民保健服务酯与胺组结合取决于 ph 值 (7-9) 和使用无胺缓冲液 (pbscm)。因此, ph 值为7.4 的 pbscm 被用于用生物素灌注小鼠肾脏, 因为它结合了理想的生理特性和最佳的溶解性和生物素的功能。为了在标记后对蛋白质进行淬火, 对 pbscm 进行甘氨酸灌注, 使游离生物素与甘氨酸的胺基团结合。为了防止动物死亡后的细胞过程, 重要的是要用冰凉溶液进行灌注, 并继续在冰上工作。

体外生物素化方法类似,在体内生物素化协议中处理肾小球的机械应力也可能影响细胞内吞、快速信号事件和 rna 完整性。因此, 所有处理步骤都必须在冰上进行, 以降低酶细胞活性的风险。

蛋白质性动物模型, 如肾毒性血清肾炎 (ntn) 严重损害小鼠肾脏。特别是, ntn 导致系膜扩张, 肾小球硬化, 和管状病变, 导致肾纤维化在疾病的晚期 (42天)24。在疾病模型中硬化性肾小球灌注障碍可能导致蛋白质丰度偏颇的结果。硬化性肾小球很可能不会与磁珠灌注, 因此在这种方法中可能不会被隔离。在导致严重肾小球硬化的疾病模型中, 使用技术通过不同的筛分步骤分离肾小球可能是本协议25中使用的磁珠方法的替代方法.然而, 如果肾小球严重硬化, 甚至与生物素灌注可能会受到损害。此外,体外生物素化, 其中提取的肾小球在生物溶液 21中被体内沐浴, 在这些模型中可能并不有利。或者, 使用免疫荧光检测严重病变的肾小球中的蛋白质丰度可能是有利的, 因为它不依赖于肾小球的灌注。

使用这种技术对蛋白质丰度进行半定量, 使用密度测量效果很好。然而, 由于密度测量的检测极限, 蛋白质丰度的微小差异可能会被忽略。

所述技术可以转移到其他灌注的动物器官, 前提是感兴趣的结构可以通过隔离技术获得, 或者感兴趣的表面蛋白质是特定于一种细胞类型或器官结构的。尽管所有表面蛋白质都是通过这种技术进行生物化的, 但使用特定抗体进行免疫沉淀将导致特定蛋白质的细胞表面蛋白表达的分数 (如图 3b 所示)。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

提交人感谢 blanka duvnjak 的出色技术援助。这项工作得到了德国妇女组织 (www.dfg.de) w1811\ 2-1 至 m. w. 和 qu2803-1 至智商的支持。资助者在研究设计、数据收集、数据分析、出版决定和手稿准备方面没有任何作用。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Motic SMZ168 BL Motic SMZ168BL microscope for mouse surgery
KL1500LCD Pulch and Lorenz microscopy 150500 light for mouse surgery
Rompun (Xylazin) 2% Bayer PZN:01320422 anesthesia
Microfederschere Braun, Aesculap FD100R fine scissors, for cut into the aorta
Durotip Feine Scheren Braun, Aesculap BC210R for abdominal cut
Anatomische Pinzette Braun, Aesculap BD215R for surgery until the abdomen is opened
Präparierklemme Aesculap BJ008R for surgery 
Seraflex Serag Wiessner IC108000 silk thread
Ketamine 10% Medistar anesthesia
Rompun (Xylazin) 2% Bayer anesthesia
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm Portex 800/100/100 Catheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm Portex 800/100/200 Catheter
Harvard apparatus 11 Plus Harvard Apparatus 70-2209 syringe pump
EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin Thermo Scientific 21335 biotin
Dynabeads Untouched Mouse T-cells Invitrogen 11413D to embolize glomeruli
Collagenase A Roche 10103578001 to digest kidney tissue
DynaMag-2 Invitrogen 123.21D Magnet catcher
100µm cell stainer Greiner-bio 542000 for glomerular isolation
Axiovert 40 CFL Zeiss non available to confirm glomerular purity
TissueRuptor Quiagen 9002755 Tissue homogenizer
CHAPS Sigma-Aldrich C3023 for lysis buffer
Tris-HCL Sigma-Aldrich T5941 for lysis buffer
NaCl VWR chemicals 27810295 for lysis buffer
NaF Sigma-Aldrich 201154 for lysis buffer
EDTA Sigma-Aldrich E5134 for lysis buffer
ATP Sigma-Aldrich 34369-07-8 for lysis buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 Follow the manufacturer's instructions
nephrin antibody Progen GP-N2 for westernblot
Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody R&D Systems AF15556-SP for westernblot
Streptavidin Agarose Resin Thermo Scientific 20347 for immunoprecipitation
Protein A sepharose CL-4B GE Healthcare 17096303 for immunoprecipitation
polyclonal rabbit anti-p57 antibody SCBT sc-8298 for Immunohistochemistry
mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 Sigma-Aldrich A2228 Western blot loading control
rabbit anti-p44/42 cell signalling 4695 for westernblot
Pierce High sensitivity streptavidin-HRP Thermo Scientific 21130 for westernblot
polyclonal mouse ICAM-2 antibody R&D Systems AF774 for westernblot
polyclonal mouse anti-VE-cadherin R&D Systems AF1002 for westernblot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58, (5), 835-845 (2011).
  2. Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
  3. Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103, (38), 14110-14115 (2006).
  4. Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286, (15), 12959-12970 (2011).
  5. Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).
  6. Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28, (9), 1723-1737 (2013).
  7. Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122, (12), 4401-4411 (2012).
  8. Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1, (4), 575-582 (1998).
  9. Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).
  10. Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20, (8), 1669-1676 (2009).
  11. Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23, (16), 3229-3239 (2012).
  12. Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5, (4), 10185 (2010).
  13. Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20, (12), 2534-2545 (2009).
  14. Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23, (1), 27-35 (2012).
  15. Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34, (9), 1831-1837 (2014).
  16. Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283, (1), 25-38 (2016).
  17. Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69, (9), 1633-1640 (2006).
  18. Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161, (3), 799-805 (2002).
  19. Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5, (5), 1322-1326 (2013).
  20. Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12, (6), 0179217 (2017).
  21. Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156, (2), 115-128 (2014).
  22. Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371, (24), 2277-2287 (2014).
  23. Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
  24. Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).
  25. Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66, (1), 71-81 (1980).
肾小球的分离及肾小球细胞表面蛋白的<em>活体标记</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Königshausen, E., Potthoff, S. A., Haase, R., Meyer-Schwesinger, C., Kaufmann, E., Rump, L. C., Stegbauer, J., Sellin, L., Quack, I., Woznowski, M. Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58542, doi:10.3791/58542 (2019).More

Königshausen, E., Potthoff, S. A., Haase, R., Meyer-Schwesinger, C., Kaufmann, E., Rump, L. C., Stegbauer, J., Sellin, L., Quack, I., Woznowski, M. Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58542, doi:10.3791/58542 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter