Her præsenterer vi en protokol for murine i vivo mærkning af glomerulær celle overflade proteiner med biotin. Denne protokol indeholder oplysninger om, hvordan du perfuse musen nyrer, isolere glomeruli og udføre endogene immunoprecipitation af protein af interesse.
Proteinuri skyldes forstyrrelse af det glomerulær filter, der er sammensat af fenestrated endothelium, glomerulær basalmembran og podocytes med deres slids membraner. Filteret glomerulær, især slids mellemgulvet, delikat struktur bygger på samspillet mellem forskellige celle overflade proteiner. At studere disse celle overflade proteiner har hidtil været begrænset til in vitro- undersøgelser eller histologiske analyse. Her præsenterer vi en murine i vivo biotinylation mærkning metode, som giver studier af glomerulær celle overflade proteiner under fysiologiske og patofysiologiske forhold. Denne protokol indeholder oplysninger om, hvordan du perfuse musen nyrer, isolere glomeruli og udføre endogene immunoprecipitation af en protein af interesse. Semi-kvantitering af glomerulær celle overflade overflod er let tilgængelige med denne nye metode, og alle proteiner tilgængelige for biotin perfusion og immunoprecipitation kan studeres. Isolering af glomeruli med eller uden biotinylation kan desuden yderligere analyse af glomerulær RNA og protein samt primære glomerulær cellekultur (dvs. primære podocyte cellekultur).
Proteinuri er kendetegnende for glomerulær skade og normalt ledsager afbrydelse af glomerulær filter1. Filteret glomerulær er sammensat af fenestrated endothelium, glomerulær basalmembran og podocytes. Filteret glomerulær delikat molekylære struktur er meget dynamisk og underlagt celle overflade protein menneskehandel både raske og syge nyrer2,3,4,5,6 . Endocytose af celle overflade proteiner har vist sig at være afgørende for overlevelse af podocytes7. Nephrin og podocalyxin er transmembrane proteiner udtrykt på podocytes. Nephrin er rygraden i glomerulær slids mellemgulvet, mens podocalyxin er en sialoglycoprotein belægning sekundære mund processer i podocytes8,9,10. Endocytic handel har tidligere vist for nephrin og podocalyxin3,11,12,13,14.
Til bedste af vores viden, har endocytose af celle overflade proteiner ikke endnu blevet beskrevet i glomerulær endotelceller i litteraturen. Imidlertid udtrykke endotelceller generelt alle nødvendige proteiner for de forskellige typer af endocytose (dvs. clathrin-afhængige, tømmerflåde-afhængige endocytose)15,16. Derfor, endotel celle overflade handel kan studeres med denne metode bruger, for eksempel vaskulære endotel (VE)-cadherin og intracellulære vedhæftning molekyle (ICAM-2) som en celle overflade markør protein for glomerulær endotelceller17 .
Desværre, der er ingen nøjagtige in vitro- model for de sarte tre-lags glomerulær filter i hvilken celle overflade protein handel kan studeres. Målet med denne metode er således at studere glomerulær protein menneskehandel i vivo. Denne protokol indeholder desuden oplysninger om, hvordan at isolere glomeruli, muliggør yderligere analyse af glomerulær RNA, proteiner eller celler. Lignende glomerulær isolation teknikker har været beskrevet af forskellige grupper18,19.
Vi og andre har tidligere brugt ex vivo mærkning af glomerulær celle overflade proteiner af biotinylation2,3,4,20,21. Men i denne ex vivo metode, isolerede glomeruli blev udsat for mekanisk stress, som kan påvirke endocytic handel. Alternativt, immunofluorescens mærkning af glomerulær celle overflade proteiner har flittigt blevet brugt i litteratur2,20,22. Med denne metode, men kun et lille antal proteiner kan analyseres inden for ét dias, og kvantitering af immunofluorescens billeder er ofte vanskelig.
Denne roman i vivo metode giver et pålideligt redskab til at studere glomerulær celle overflade protein overflod og menneskehandel præcist i raske og syge nyrer, og det kan bruges som et supplement til immunofluorescens test.
Metoden præsenteres muliggør vellykket isolation af glomeruli at undersøge glomerulær RNA og protein. Derudover kan primære glomerulær cellekulturer udføres fra de isolerede glomeruli. Hvis biotin er anvendt før glomerulær isolation, kan mærkning af glomerulær celle overflade proteiner udføres. Med denne metode, i vivo glomerulær celle overflade protein handel kan studeres, og semi-kvantitering af protein overflod er muligt. De mest kritiske trin til vellykket test glomerulær celle overflade protei…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Blanka Duvnjak for hendes enestående teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 til M.W. og QU280/3-1 til IQ Bidragyder spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling, analyse af data, beslutning om at offentliggøre og forberedelse af manuskriptet.
Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |