Summary

Isolasjonen av Glomeruli og i Vivo merking av Glomerular celle overflaten proteiner

Published: January 18, 2019
doi:

Summary

Her presenterer vi en protokoll for murine i vivo merking av glomerular celle overflaten proteiner med biotin. Denne protokollen inneholder informasjon om hvordan du perfuse musen nyrer, isolere glomeruli og utføre endogene immunoprecipitation av protein av interesse.

Abstract

Proteinuria resultatene fra avbrudd glomerular filter som består av fenestrated endotelet, glomerular kjelleren membranen og podocytes med sine slit membraner. Delikat strukturen glomerular filter, spesielt slit membranen, er avhengig av samspillet mellom ulike celle overflaten proteiner. Studere disse cellen overflaten proteinene har så langt vært i vitro studier eller histologic analyse. Her presenterer vi et murint i vivo biotinylation merking metoden, som muliggjør studiet av glomerular celle overflaten proteiner under fysiologiske og pathophysiologic forhold. Denne protokollen inneholder informasjon om hvordan du perfuse musen nyrer, isolere glomeruli og utføre endogene immunoprecipitation av et protein av interesse. Immunoprecipitation kan studeres semi kvantifisering av glomerular celle overflaten overflod er lett tilgjengelig med denne romanen metoden og alle proteiner tilgjengelig for biotin perfusjon. I tillegg kan isolering av glomeruli med eller uten biotinylation videre analyse av glomerular RNA og protein, i tillegg til primære glomerular cellekultur (dvs. primære podocyte cellekultur).

Introduction

Proteinuria er et kjennetegn på glomerular skader og vanligvis følger avbrudd av glomerular filteret1. Glomerular filteret består av fenestrated endotelet, glomerular kjelleren membranen og podocytes. Den delikate molekylære strukturen av glomerular filteret er svært dynamisk og emne til cellen overflaten protein menneskehandel i både friske og syke nyrer2,3,4,5,6 . Endocytose cellen overflaten proteiner har vist seg å være avgjørende for overlevelsen av podocytes7. Nephrin og podocalyxin er transmembrane proteiner uttrykt på podocytes. Nephrin er ryggraden i glomerular slit membranen, mens podocalyxin er en sialoglycoprotein belegg sekundære foten prosesser av podocytes8,9,10. Endocytic menneskehandel har tidligere vist for nephrin og podocalyxin3,11,12,13,14.

Til best av vår kunnskap, har endocytose cellen overflaten proteiner ikke ennå blitt beskrevet i glomerular endotelceller i litteraturen. Imidlertid uttrykke endotelceller generelt alle nødvendige proteiner for ulike endocytose (dvs. clathrin-avhengige, flåte-avhengige endocytose)15,16. Derfor endothelial celle overflaten menneskehandel kan studeres med denne metoden bruker, for eksempel vaskulær endotelial (VE)-cadherin og intracellulær vedheft molekyl (ICAM-2) som en celle overflaten markør protein for glomerular endotelceller17 .

Dessverre er det ingen nøyaktig i vitro modell for delikat tre-lagdelt glomerular filteret i hvilken celle overflaten protein menneskehandel kan studeres. Målet med denne metoden er derfor å studere glomerular protein menneskehandel i vivo. I tillegg inneholder denne protokollen informasjon om hvordan du isolerer glomeruli, en slik analyse av glomerular RNA, proteiner eller celler. Lignende glomerular isolasjon teknikker har blitt beskrevet av ulike grupper18,19.

Tidligere har vi og andre brukt ex vivo merking av glomerular celle overflaten proteiner av biotinylation,2,,3,,4,,20,,21. Men i denne ex vivo metoden, ble isolerte glomeruli utsatt for mekanisk stress, som kan påvirke endocytic menneskehandel. Eventuelt er immunofluorescence merking av glomerular celle overflaten proteiner mye brukt i litteratur2,20,22. Med denne metoden, men bare et lite antall proteiner kan analyseres i ett lysbilde, og kvantifisering av immunofluorescence bilder er ofte vanskelig.

Denne romanen i vivo metoden gir et pålitelig verktøy for å studere glomerular celle overflaten protein overflod og omsetning nøyaktig i friske og syke nyrer, og den kan brukes som et tillegg til immunofluorescence tester.

Protocol

Mus ble innhentet som en egen rase fra lokale dyr pleie anlegget eller Janvier Labs i Frankrike. Undersøkelser ble gjennomført i henhold til retningslinjene skissert i guiden for omsorg og bruk av forsøksdyr (USAs nasjonale institutter av helse publikasjonen nummer 85-23, revidert 1996). Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med relevante institusjonelle godkjenninger (staten regjeringen LANUV referanse nummer AZ:84-02.04. 2016.A435). 1. utarbeidelse av instrumenter, løsninger og utstyr…

Representative Results

For å isolere glomeruli nøyaktig, er det nødvendig å perfuse murint nyrene med PBSCM først. Perfusjon med PBSCM viser nyrer blek (figur 1A). Embolisering av glomeruli med magnetiske perler vises som brune prikker på nyre overflaten (figur 1B). Isolasjonen av glomeruli med magnet catcher kan vise forurensning med nyre tubuli (figur 1C). Før ytt…

Discussion

Presentert metoden gjør det mulig for vellykket isolering av glomeruli å undersøke glomerular RNA eller protein. I tillegg kan primære glomerular cellekulturer utføres fra de isolerte glomeruli. Hvis biotin brukes før glomerular isolasjon, kan merking av glomerular celle overflaten proteiner utføres. Med denne metoden i vivo glomerular celle overflaten protein menneskehandel kan studeres, og semi kvantifisering av protein overflod er mulig. De viktigste trinnene for å kunne teste glomerular celle overfla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takker Blanka Duvnjak for sin eksepsjonelle kundestøtte. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 til M.W. og QU280/3-1 til IQ Funder ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling, analyse, beslutningen om å publisere og utarbeidelse av manuskriptet.

Materials

Motic SMZ168 BL Motic SMZ168BL microscope for mouse surgery
KL1500LCD Pulch and Lorenz microscopy 150500 light for mouse surgery
Rompun (Xylazin) 2% Bayer PZN:01320422 anesthesia
Microfederschere Braun, Aesculap FD100R fine scissors, for cut into the aorta
Durotip Feine Scheren Braun, Aesculap BC210R for abdominal cut
Anatomische Pinzette Braun, Aesculap BD215R for surgery until the abdomen is opened
Präparierklemme Aesculap BJ008R for surgery 
Seraflex Serag Wiessner IC108000 silk thread
Ketamine 10% Medistar anesthesia
Rompun (Xylazin) 2% Bayer anesthesia
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm Portex 800/100/100 Catheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm Portex 800/100/200 Catheter
Harvard apparatus 11 Plus Harvard Apparatus 70-2209 syringe pump
EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin Thermo Scientific 21335 biotin
Dynabeads Untouched Mouse T-cells Invitrogen 11413D to embolize glomeruli
Collagenase A Roche 10103578001 to digest kidney tissue
DynaMag-2 Invitrogen 123.21D Magnet catcher
100µm cell stainer Greiner-bio 542000 for glomerular isolation
Axiovert 40 CFL Zeiss non available to confirm glomerular purity
TissueRuptor Quiagen 9002755 Tissue homogenizer
CHAPS Sigma-Aldrich C3023 for lysis buffer
Tris-HCL Sigma-Aldrich T5941 for lysis buffer
NaCl VWR chemicals 27810295 for lysis buffer
NaF Sigma-Aldrich 201154 for lysis buffer
EDTA Sigma-Aldrich E5134 for lysis buffer
ATP Sigma-Aldrich 34369-07-8 for lysis buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 Follow the manufacturer's instructions
nephrin antibody Progen GP-N2 for westernblot
Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody R&D Systems AF15556-SP for westernblot
Streptavidin Agarose Resin Thermo Scientific 20347 for immunoprecipitation
Protein A sepharose CL-4B GE Healthcare 17096303 for immunoprecipitation
polyclonal rabbit anti-p57 antibody SCBT sc-8298 for Immunohistochemistry
mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 Sigma-Aldrich A2228 Western blot loading control
rabbit anti-p44/42 cell signalling 4695 for westernblot
Pierce High sensitivity streptavidin-HRP Thermo Scientific 21130 for westernblot
polyclonal mouse ICAM-2 antibody R&D Systems AF774 for westernblot
polyclonal mouse anti-VE-cadherin R&D Systems AF1002 for westernblot

References

  1. Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
  2. Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
  3. Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
  4. Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
  5. Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).
  6. Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
  7. Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
  8. Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein–nephrin–is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
  9. Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).
  10. Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
  11. Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
  12. Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).
  13. Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
  14. Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
  15. Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
  16. Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
  17. Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
  18. Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
  19. Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
  20. Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).
  21. Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
  22. Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
  23. Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
  24. Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).
  25. Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).

Play Video

Cite This Article
Königshausen, E., Potthoff, S. A., Haase, R., Meyer-Schwesinger, C., Kaufmann, E., Rump, L. C., Stegbauer, J., Sellin, L., Quack, I., Woznowski, M. Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58542, doi:10.3791/58542 (2019).

View Video