Isolasjonen av Glomeruli og i Vivo merking av Glomerular celle overflaten proteiner
Summary
Her presenterer vi en protokoll for murine i vivo merking av glomerular celle overflaten proteiner med biotin. Denne protokollen inneholder informasjon om hvordan du perfuse musen nyrer, isolere glomeruli og utføre endogene immunoprecipitation av protein av interesse.
Abstract
Proteinuria resultatene fra avbrudd glomerular filter som består av fenestrated endotelet, glomerular kjelleren membranen og podocytes med sine slit membraner. Delikat strukturen glomerular filter, spesielt slit membranen, er avhengig av samspillet mellom ulike celle overflaten proteiner. Studere disse cellen overflaten proteinene har så langt vært i vitro studier eller histologic analyse. Her presenterer vi et murint i vivo biotinylation merking metoden, som muliggjør studiet av glomerular celle overflaten proteiner under fysiologiske og pathophysiologic forhold. Denne protokollen inneholder informasjon om hvordan du perfuse musen nyrer, isolere glomeruli og utføre endogene immunoprecipitation av et protein av interesse. Immunoprecipitation kan studeres semi kvantifisering av glomerular celle overflaten overflod er lett tilgjengelig med denne romanen metoden og alle proteiner tilgjengelig for biotin perfusjon. I tillegg kan isolering av glomeruli med eller uten biotinylation videre analyse av glomerular RNA og protein, i tillegg til primære glomerular cellekultur (dvs. primære podocyte cellekultur).
Introduction
Proteinuria er et kjennetegn på glomerular skader og vanligvis følger avbrudd av glomerular filteret1. Glomerular filteret består av fenestrated endotelet, glomerular kjelleren membranen og podocytes. Den delikate molekylære strukturen av glomerular filteret er svært dynamisk og emne til cellen overflaten protein menneskehandel i både friske og syke nyrer2,3,4,5,6 . Endocytose cellen overflaten proteiner har vist seg å være avgjørende for overlevelsen av podocytes7. Nephrin og podocalyxin er transmembrane proteiner uttrykt på podocytes. Nephrin er ryggraden i glomerular slit membranen, mens podocalyxin er en sialoglycoprotein belegg sekundære foten prosesser av podocytes8,9,10. Endocytic menneskehandel har tidligere vist for nephrin og podocalyxin3,11,12,13,14.
Til best av vår kunnskap, har endocytose cellen overflaten proteiner ikke ennå blitt beskrevet i glomerular endotelceller i litteraturen. Imidlertid uttrykke endotelceller generelt alle nødvendige proteiner for ulike endocytose (dvs. clathrin-avhengige, flåte-avhengige endocytose)15,16. Derfor endothelial celle overflaten menneskehandel kan studeres med denne metoden bruker, for eksempel vaskulær endotelial (VE)-cadherin og intracellulær vedheft molekyl (ICAM-2) som en celle overflaten markør protein for glomerular endotelceller17 .
Dessverre er det ingen nøyaktig i vitro modell for delikat tre-lagdelt glomerular filteret i hvilken celle overflaten protein menneskehandel kan studeres. Målet med denne metoden er derfor å studere glomerular protein menneskehandel i vivo. I tillegg inneholder denne protokollen informasjon om hvordan du isolerer glomeruli, en slik analyse av glomerular RNA, proteiner eller celler. Lignende glomerular isolasjon teknikker har blitt beskrevet av ulike grupper18,19.
Tidligere har vi og andre brukt ex vivo merking av glomerular celle overflaten proteiner av biotinylation,2,,3,,4,,20,,21. Men i denne ex vivo metoden, ble isolerte glomeruli utsatt for mekanisk stress, som kan påvirke endocytic menneskehandel. Eventuelt er immunofluorescence merking av glomerular celle overflaten proteiner mye brukt i litteratur2,20,22. Med denne metoden, men bare et lite antall proteiner kan analyseres i ett lysbilde, og kvantifisering av immunofluorescence bilder er ofte vanskelig.
Denne romanen i vivo metoden gir et pålitelig verktøy for å studere glomerular celle overflaten protein overflod og omsetning nøyaktig i friske og syke nyrer, og den kan brukes som et tillegg til immunofluorescence tester.
Protocol
Representative Results
Discussion
Presentert metoden gjør det mulig for vellykket isolering av glomeruli å undersøke glomerular RNA eller protein. I tillegg kan primære glomerular cellekulturer utføres fra de isolerte glomeruli. Hvis biotin brukes før glomerular isolasjon, kan merking av glomerular celle overflaten proteiner utføres. Med denne metoden i vivo glomerular celle overflaten protein menneskehandel kan studeres, og semi kvantifisering av protein overflod er mulig. De viktigste trinnene for å kunne teste glomerular celle overfla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Blanka Duvnjak for sin eksepsjonelle kundestøtte. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 til M.W. og QU280/3-1 til IQ Funder ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling, analyse, beslutningen om å publisere og utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
References
- Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
- Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
- Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).
- Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
- Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein–nephrin–is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).
- Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
- Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
- Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).
- Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
- Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
- Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
- Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
- Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
- Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).
- Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).
