Summary
La protéine interagissante ZW10 (ZWINT) participe au point de contrôle mitotique de fuseau et à la pathogénie du carcinome. Ici, nous introduisons une méthodologie de l'immunostaining de ZWINT dans les tissus humains de cancer du poumon, suivie de la numérisation numérique des diapositives entières et de l'analyse d'image. Cette méthodologie peut fournir des images numériques de haute qualité et des résultats fiables.
Abstract
Le but de cette étude est d'introduire une méthodologie de l'immunostaining des tissus pulmonaires humains, suivie d'une analyse numérique et d'une analyse d'images. La numérisation numérique est un moyen rapide de numériser une pile de diapositives et de produire des images numériques de haute qualité. Il peut produire des résultats concordants avec la microscopie lumineuse conventionnelle (CLM) par des pathologistes. En outre, la disponibilité d'images numériques permet que la même diapositive peut être observée simultanément par plusieurs personnes. En outre, les images numériques des diapositives peuvent être stockées dans une base de données, ce qui signifie que la détérioration à long terme des diapositives en verre est évitée. Les limites de cette technique sont les suivantes. Tout d'abord, il a besoin de tissus préparés de haute qualité et l'immunohistochimie originale (IHC) glisse sans aucun dommage ou résidu de scellant excédentaire. Deuxièmement, les secteurs de tumeur ou nontumor devraient être spécifiés par les pathologistes expérimentés avant l'analyse utilisant le logiciel, afin d'éviter n'importe quelle confusion au sujet de la tumeur ou des secteurs nontumorpendants pendant la notation. Troisièmement, l'opérateur doit contrôler la reproduction des couleurs tout au long du processus de numérisation dans l'imagerie de diapositives entières.
Introduction
ZW10 protéine d'interaction (ZWINT) est un composant nécessaire du complexe kinetochore qui est impliqué dans le point de contrôle de fuseau mitotique1,2,3. Il a été rapporté que l'épuisement de ZWINT conduit à la ségrégation prématurée aberrante de chromosome1,2,3. Des études récentes ont suggéré que ZWINT est impliqué dans la pathogénie des tumeurs multiples en favorisant la prolifération des cellules tumorales4,5. Nous avons précédemment rapporté la surexpression de ZWINT dans le cancer du poumon5. Il a été largement admis que l'analyse des diapositives par les pathologistes utilisant CLM est longue et non quantitative6,7,8. En outre, la détérioration des glissières en verre stockées pourrait rendre impossible de rétracter les diapositives précédemment créées. La nouvelle méthode d'imagerie numérique à glissière (WSI) par ordinateur peut surmonter ces limites6,7,8.
À cette fin, nous décrivons une méthodologie de l'immunostaining de ZWINT dans les tissus humains de cancer du poumon, couplée à la numérisation numérique de glissement entier et à l'analyse d'image basée sur le logiciel. Le principal avantage de cette méthodologie est la production de résultats concordants avec CLM. Cette technologie peut être largement utilisée dans les domaines de la notation pathologique de la coloration de l'hématoxylin-éosine (H et E) et IHC, de la fluorescence in situ hybridation (FISH), des microréseaux tissulaires (TMA) et de la découverte et du développement de médicaments.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité d'éthique de l'hôpital Zhongnan de l'Université de Wuhan et l'hôpital Renmin de l'Université de Wuhan.
1. Préparation des diapositives IHC
- Fixez l'échantillon de tissu pulmonaire en immergeant le fragment de tissu pulmonaire humain (environ 3 x 3 cm) dans 4 % de paraformaldéhyde dans de la saline tamponnée de phosphate (PBS) pendant 24 h à température ambiante (RT).
- Déshydrater le tissu en 80 %, 95 % et 100 % d'éthanol pendant 15 min, 20 min et 20 min, respectivement, à température ambiante. Enfin, immerger le tissu dans 100% xylène 3x pendant 20 min chacun à température ambiante.
- Pour l'incorporation, immerger le tissu dans la paraffine (63 oC) pendant 30 min. Changer la paraffine et replonger le tissu pendant 45 min. Enfin, changer la paraffine à nouveau et immerger le tissu en elle pendant 1 h supplémentaire.
- Utilisez un microtome rotatif pour couper le tissu en sections de 5 m d'épaisseur et placez-les sur des lames de 20 g/mL recouvertes de polylysine.
- Pour le déwaxing, placer les lames dans un four à 65 oC pendant 2 h, puis plonger les sections dans du diméthylbenzène pendant 15 min, puis tremper dans 100% xylène pendant 15 min.
- Hydratez les lames avec les sections de tissu 2x pour 5 min dans 100% d'éthanol, suivies d'un traitement avec l'éthanol dilué en série de 5 min dans 95% d'éthanol, 5 min dans 80% d'éthanol, 5 min dans l'éthanol de 70% et 5 min dans 50% d'éthanol.
- Effectuer la réparation de l'antigène.
- Diluer le liquide de réparation d'acide citrique (20x) à 1x avec H2O à double distillation (ddH2O).
- Placez les glissières avec les sections de tissu et le liquide de réparation d'acide citrique 1x (300 ml) dans une boîte de réparation d'antigène et, puis, chauffez-les dans le four à micro-ondes à puissance élevée pendant 2 min, suivi par le chauffage à basse puissance pour maintenir l'ébullition pendant 6 min.
- Laisser refroidir les sections naturellement à température ambiante.
- Remplacer le liquide de réparation d'acide citrique par 0,01 M PBS, laver les sections 3x, chaque fois pendant 5 min, dans le shaker rotatif à température ambiante.
- Éliminez la peroxidase endogène.
- Diluer 30% de H2O2 à 3% avec le ddH2O, l'ajouter aux lames (assurez-vous qu'il couvre tous les tissus), et incuber les diapositives dans une boîte humide à température ambiante pendant 30 min.
Note: La boîte humide est une boîte en plastique de 10 x 15 cm et peut contenir de l'eau. - Laver les diapositives 3x, chaque fois pendant 5 min, avec 0,01 M PBS dans le shaker rotatif à température ambiante.
- Diluer 30% de H2O2 à 3% avec le ddH2O, l'ajouter aux lames (assurez-vous qu'il couvre tous les tissus), et incuber les diapositives dans une boîte humide à température ambiante pendant 30 min.
- Bloquez l'antigène non spécifique.
- Diluer le sérum de chèvre normal concentré à 10% sérum de chèvre avec PBS avec 0.1% Tween 20 (PBST).
- Ajouter 10 % de sérum de chèvre sur les lames et les incuber dans la boîte humide à 37 oC pendant 30 min.
Remarque : Le sérum de chèvre doit couvrir tous les tissus des diapositives.
- Tachez les tissus.
- Incuber les toboggans avec des anticorps anti-ZWINT anti-humains de lapin (1:50) à 4 oC pendant la nuit.
- Laver les toboggans 3x, à chaque fois pendant 5 min, avec 0,01 M PBST (1 ml de 0,1% de tween 20 dans 1000 mL PBS) dans le shaker rotatif à température ambiante.
- Incuber les diapositives avec des anticorps secondaires (système de détection anti-lapin, 1:200) pendant 30 min à 37 oC.
- Laver les diapositives 3x, chaque fois pendant 5 min, avec 0,01 M PBST dans le shaker rotatif.
- Pour visualiser l'immunostaining, ajouter les diapositives à 300 l de 3,3-diaminobenzidine fraîche et, ensuite, laver les diapositives avec de l'eau du robinet à température ambiante.
Remarque : Le degré de teinture est surveillé au microscope (grossissement 10X - 40X). - Contre-tache du tissu. Tainer les diapositives avec une solution de coloration à l'hématoxyline pendant 2 min à température ambiante, puis laver les lames avec de l'eau du robinet pendant 15 min.
Note: Le noyau apparaît bleu sous le microscope (magnification 10X - 40X). Si le degré de coloration bleue est plus puissant, la différenciation de l'alcool chlorhydrique pour 3 - 5 s peut être utilisée, suivie par le rinçant le tissu à l'eau du robinet pendant 15 min pour faciliter la coloration proéminente du tissu. - Déshydrater les lames pendant 5 min dans 50% d'éthanol, 5 min dans 70% d'éthanol, 2x dans 80% d'éthanol pour 5 min, 5 min dans 95% d'éthanol, et enfin, 2x pour 5 min chacun dans 100% d'éthanol à température ambiante.
- Par transparence, immerger les sections de tissu dans un réservoir contenant 100% de xylène pendant 15 min et transférer les sections dans un autre réservoir contenant 100% de xylène pendant 15 min à température ambiante.
- Pour l'étanchéité, prendre 50 à 100 l de gomme neutre et ajouter 5 % de xylène au mélange (éviter de mélanger dans des bulles). Ajouter 15 ll du mélange mentionné ci-dessus aux sections des tissus pulmonaires. Scellez le film avec du verre de couverture et appuyez doucement sur les bulles.
2. Numérisation automatique de glissières entières des diapositives IHC
- Laisser sécher les lames scellées pendant 12 h à température ambiante pour les dessécher.
- Sélectionnez l'option de champ Bright manuellement et entrez l'interface de numérisation manuelle.
- Réviser le nom des diapositives et sélectionner un chemin de stockage pour les images.
- Définir la zone de numérisation et choisir l'option Scan échantillons en utilisantdes seuils fixés par l'utilisateur . Le seuil est d'environ 50 avec une valeur d'expansion de la zone de numérisation de 200 m.
- Définir la valeur de mise au point de numérisation, sélectionner la mise au point automatiquement — elle varie de 1050 à 2650 — et enfin, sélectionnez mode à une seulecouche.
- Chargez les glissières IHC sur le poste de travail et démarrez la numérisation automatique.
Remarque : Assurez-vous que les glissières ne sont pas endommagées. Garder les glissières propres et translucides et éviter la poussière, les confettis et l'excès de résidus d'étanchéité sur les lames. La glissière en verre et la glissière de couverture doivent être dépourvues de marques. Ne pas nettoyer les diapositives avec du xylène. La taille des diapositives est donnée dans le tableau 1. - Scannez automatiquement toute la section tissulaire sur une diapositive avec un grossissement 20X, 40X ou 100X.
- Recueillir et stocker les images à la fin de la numérisation de diapositives entières.
3. Analyse des diapositives par logiciel d'imagerie
- Démarrer le logiciel d'analyse d'image histopathologique et sélectionnez ordinateur local.
- Ouvrez le fichier qui stocke les données de numérisation.
- Sélectionnez le niveau de zoom approprié de la plage 2X à 40X.
- Ajuster la couleur pour définir le contraste optimal via Toggle couleur ajuster.
- Encerclez manuellement et nommez les parties d'intérêt sur chaque image.
Remarque : Par exemple, vous pouvez encercler une zone et la nommer zone tumorale. - Sélectionnez Plugins et QC. À ce moment, le constructeur de scénarios apparaît.
- Sélectionnez Quant de densité et ajustez la barre de détection.
Remarque : Ce processus doit être effectué avec soin. La barre de tolérance bleue est utilisée pour ajuster la couleur du noyau cellulaire. La barre de tolérance Brown est utilisée pour ajuster la saturation de la couleur de remplissage dans l'image. Les résultats des images après ajustements doivent être compatibles avec les contreparties d'origine. - Ajustez les niveaux de score pour rendre l'intensité de coloration des zones encerclées semblable à celle des images originales.
Note: Brun foncé indique fort positif, jaune brunâtre est modérément positif, jaune clair est faiblement positif, et blanc est négatif. - Stockez et nommez le modèle comme fichier. Appliquer le modèle sur d'autres diapositives et sélectionnez L'annotation sélectionnée".
- Laissez le logiciel calculer automatiquement le score H pour les zones encerclées de l'image.
4. Quantification des scores à l'aide du système de notation H9,10
- Calculer le pourcentage d'immunostaining et l'intensité de coloration (0: négatif, 1 ': faible, 2 ': modéré, 3 ': fort).
- Utilisez un système de notation (H-score) pour calculer la notation pathologique de la tumeur et des zones non tumorales adjacentes.
Note : H-score (% des cellules avec une faible intensité x 1) (% des cellules à intensité modérée x 2) (% des cellules à forte intensité x 3). Par conséquent, le score H maximum est de 300 si 100% des cellules sont quantifiées avec une forte intensité.
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Representative Results
Nous avons mesuré les niveaux d'expression de ZWINT dans 28 paires de spécimens de cancer du poumon de non-petite cellule (NSCLC) (tumeur et tissus nontumor adjacents), y compris 14 carcinomes squamous de cellules (SCC) et 14 adénocarcinomes (ADCs), par IHC. La numérisation numérique complète des diapositives a fourni des images numériques de haute qualité (Figure 1A). Les résultats ont montré que le score H du cancer du poumon était significativement plus élevé que celui des tissus non cancéreux adjacents (P et lt; 0,0001, t-test à deux queues) (Figure 1A et 1B). De plus, nous avons constaté que le niveau d'expression de ZWINT dans les CSP était significativement plus élevé que celui des CDA (figure 1C).
Figure 1 : Coloration immunohistochimique pour les tissus du cancer du poumon. Ce chiffre a été modifié à partir de Yuan et al. 5 avec la permission de Dove Press. (A) Ce panneau montre des images immunohistochimiques représentatives des patients atteints de cancer du poumon (magnifications : 10X et 40X). (B) Ce panneau montre le score H du cancer du poumon et des tissus non cancéreux adjacents. (C) Ce panneau montre le score H des ADC et des CSC. Les barres d'erreur indiquent l'écart type. P et lt; 0,05; P et lt; 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| MIN (mm) | MAX (mm) | |
| Largeur | 25 Annonces | 26 Annonces |
| longueur | 75 Annonces | 76 Annonces |
| épaisseur | 0,9 | 1,2 |
Tableau 1 : Taille des diapositives.
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Discussion
La numérisation de diapositives entières devient un sujet brûlant pour sa numérisation robuste et la production d'images de haute qualité à des fins cliniques et de recherche11,12,13. Les images peuvent être produites par des microscopes à balayage en quelques minutes11,12,13. En appliquant cette méthodologie, nous avons obtenu des images de haute qualité pour les diapositives ZWINT IHC et comparé le score H entre les tissus tumoraux et nontumors. Dans le protocole présenté ici, les étapes les plus critiques sont la préparation des diapositives IHC de haute qualité, l'acquisition d'image, et la spécification des zones tumorales et non tumorales avant la notation pathologique13,14 , 15 Annonces , 16.
La méthode actuelle présente certains avantages par rapport à (CLM). La numérisation numérique est assez rapide (environ 20 diapositives/heure) pour numériser une pile de diapositives et produire des images numériques de haute qualité. Il peut produire des résultats concordants avec CLM, mais prend relativement moins de temps. La disponibilité d'images numériques permet que la même diapositive puisse être observée simultanément par plusieurs personnes. Les images numériques des diapositives peuvent être stockées dans une base de données, ce qui signifie que la détérioration à long terme des diapositives en verre est évitée.
Les limites de cette technique comprennent la nécessité de tissus de haute qualité et des diapositives IHC6,8,11 et l'expertise technique pour spécifier les échantillons de tumeur ou de tissu nontumoral avant l'analyse à l'aide d'un logiciel d'imagerie , afin d'éviter toute confusion au sujet de la tumeur ou des zones nontumorales au cours de la notation6,7. L'opérateur doit également surveiller la reproduction des couleurs tout au long du processus de numérisation dans l'imagerie de diapositives entières17.
Cette méthode peut être activement appliquée dans FISH, TMA, et la découverte et le développement de médicaments6,18. Tabata et coll. ont étudié l'utilisation de l'ISM dans les diagnostics pathologiques primaires19. Ils ont analysé rétrospectivement 1070 échantillons wSI de neuf hôpitaux au Japon et ont confirmé la validation de l'utilisation de WSI dans les diagnostics primaires. Un des principaux avantages de WSI est qu'il permet la visualisation simultanée des diapositives par plusieurs étudiants20. Par conséquent, la validation d'images de balayage en diapositives entières pourrait contribuer au développement de diagnostics numériques à des fins éducatives et de recherche6,18,21.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce projet a été soutenu par la National Natural Foundation of China (No. 81500151, 81400121, 81270607, 81541027, et 81501352) et la Natural Foundation of Hubei Province (Chine) (No. 2017CFB631). Les auteurs expriment leur gratitude à Guo Qin, Chang Min, Li Hui, et leurs collègues de Wuhan Google Biological Technology Co., LTD pour leur soutien technique. Les auteurs remercient également Muhammad Jamal pour l'édition linguistique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pannoramic MIDI | 3D HISTECH | Cat: PMIDI-040709 | An automated digital slide scanner with a remarkable feature set :12-slide capacity, fluorescence scanning, and many more. |
| QuantCenter | 3D HISTECH | Downloaded from the official website of the company | The framework for 3DHISTCH's image analysis applications. |
| LEICA RM2235 | Leica Microsystems | Cat: 14050038604 | The enhanced precision of the new accessories will add convenience to block to knife approach as well as specimen orientation. |
| Rabbit anti-human Anti-ZWINT antibody | Abcam | Cat: ab197794 | Immunohistochemical analysis of ZWINT in human lung tissue. |
| Anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Goodbio Technology | Cat:GB23303-1 | Secondary antibody for IHC staining. |
| Phosphate-buffered saline | Wuhan Goodbio Technology | Cat:G0002 | A solution containing a phosphate buffer. |
| OLYMPUS CX23 | OLYMPUS | Cat:6M87620 | Microscope for detection of H&E or IHC slides. |
| Dimethylbenzene | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent | Cat:1330-20-7 | A colorless, flammable fluid used as a solvent and clarifying agent in the preparation of tissue sections for microscopic study. |
| Hematoxylin Staining Solution | Wuhan Servicebio technology | Cat:G1039 | It is commonly used for histologic studies, oftern colors the nuclei of cells blue. |
| Tween 20 | Baitg | Cat:2005-64-5 | It is a polysorbate-type nonionic surfactant formed by the ethoxylation of sorbitan before the addition of lauric acid. It is used as a deterent and emulsifier in pharmacological applications. |
| Citric acid repair liquid | Wuhan Servicebio technology | Cat:G1202 | Is is used to repair antigen after fixation during IHC procedure. |
| LEICA ASP200s | Leica | Cat: 14048043626 | It was designed for routine and research histopathology of up to 200 cassettes. |
| LEICA Arcadia H | Leica | Cat: 14039354103 | It is a heated paraffin embedding station and allows for simple operation and precise control, resulting in improved quality, a smooth workflow and reliability. |
| LEICA Arcadia C | Leica | Cat: 14039354102 | It is a cold plate holding more than 60/65 cassettes on its large working surface. It was designed with an environment adaptive control module to make sure the operating temperature is always stabilized at -6°C. |
| CaseViewer Software | 3DHISTECH |
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