Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Digital analyse af immun farvning af ZW10 interagerende protein i humant lunge væv

Published: May 1, 2019 doi: 10.3791/58551
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 4, 4, 5, 6, 4, 4, 4, 1
1Department of Hematology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 2Department of Thoracic Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, 3Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, 4Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Wuhan University, 5Department of Gastroenterology, Central Hospital of Wuhan, 6Department of Transfusion, Zhongnan Hospital of Wuhan University

Summary

ZW10 interagerende protein (ZWINT) deltager i mitotisk spindel check point og patogenesen af carcinoma. Her introducerer vi en metodologi for immun farvning af ZWINT i humant lungekræft væv, efterfulgt af den digitale scanning af hele dias og billedanalyse. Denne metode kan levere digitale billeder af høj kvalitet og pålidelige resultater.

Abstract

Formålet med denne undersøgelse er at indføre en metodologi for immun farvning af humant lunge væv, efterfulgt af hele dias digital scanning og billedanalyse. Digital scanning er en hurtig måde at scanne en stak af slides og producere digitale billeder med høj kvalitet. Det kan producere samstemmende resultater med konventionel lys mikroskopi (CLM) af patologer. Desuden gør tilgængeligheden af digitale billeder det muligt, at det samme dias kan observeres samtidigt af flere mennesker. Desuden kan digitale billeder af dias gemmes i en database, hvilket betyder, at den langsigtede forringelse af glas glider undgås. Begrænsningerne af denne teknik er som følger. For det første har det brug for forberedt væv af høj kvalitet og de originale Immunhistokemi (IHC) slides uden nogen skade eller overskydende tætningsmiddel rester. Anden, tumor eller nontumor områder bør specificeres af erfarne patologer før analysen ved hjælp af software, for at undgå enhver forvirring om tumoren eller nontumor områder under scoring. For det tredje skal operatøren styre farvegengivelsen i hele digitaliseringsprocessen i hele slide Imaging.

Introduction

ZW10 interagerende protein (zwint) er en nødvendig bestanddel af kinetochore-komplekset, som er involveret i den mitotiske spindel checkpunkt1,2,3. Det er blevet rapporteret, at nedbrydningen af zwint fører til afvigende for tidlig kromosom adskillelse1,2,3. Nylige undersøgelser har antydet, at zwint er involveret i patogenesen af flere tumorer ved at fremme udbredelsen af tumorceller4,5. Vi har tidligere rapporteret overekspression af ZWINT i lungekræft5. Det er blevet almindeligt accepteret, at analysen af dias af patologer ved hjælp af CLM er tidskrævende og ikke kvantitativ6,7,8. Desuden kan forværringen af lagrede glas slides gøre det umuligt at trække tidligere oprettede slides. Den nye metode til computerbaseret digital helslide Imaging (wsi) kan overvinde disse begrænsninger6,7,8.

Til dette formål beskriver vi en metodologi for immun farvning af ZWINT i humant lungekræft væv, kombineret med hel-slide digital scanning og software-baseret billedanalyse. Den største fordel ved denne metode er at fremstilling af konkordant resultater med CLM. Denne teknologi kan anvendes i vid udstrækning i områder med patologisk scoring af hematoxylin-eosin farvning (H & E) og IHC, fluorescens in situ hybridisering (fisk), vævs mikroarrays (TMA), og Drug opdagelse og udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af det etiske udvalg af Zhongnan Hospital på Wuhan University og Renmin Hospital i Wuhan University.

1. klargøring af IHC-slides

  1. Løs lunge vævsprøven ved at fordybe det humane lunge vævs fragment (ca. 3 x 3 cm) i 4% PARAFORMALDEHYD i fosfat bufferet saltvand (PBS) i 24 timer ved stuetemperatur (RT).
  2. Dehydrat vævet i 80%, 95%, og 100% ethanol i 15 min, 20 min, og 20 min, henholdsvis ved stuetemperatur. Endelig sænkes vævet i 100% xylen 3x i 20 min hver ved stuetemperatur.
  3. Til indlejring sænkes vævet i paraffin (63 °C) i 30 min. Skift paraffin og sænk vævet igen for en anden 45 min. Endelig ændre paraffin igen og fordybe vævet i det for yderligere 1 h.
  4. Brug en roterende mikrotom til at skære vævet i 5 μm-tykke sektioner og placere dem på 20 μg/mL poly-L-lysin-coatede slides.
  5. Til afvoksning skal du anbringe diasene i en 65 °C-ovn i 2 timer og derefter nedsænke sektionerne i dimethylbenzen i 15 minutter, efterfulgt af iblødsætning i 100% xylen i 15 min.
  6. Fugt gliderne med vævs afsnittene 2x i 5 min i 100% ethanol, efterfulgt af en behandling med serielt fortyndet ethanol på 5 min i 95% ethanol, 5 min i 80% ethanol, 5 min i 70% ethanol og 5 min i 50% ethanol.
  7. Udfør antigen reparation.
    1. Fortyndet citronsyre reparations væske (20x) til 1x med dobbeltdestilleret H2o (DDH2o).
    2. Placer slides med vævs sektioner og 1x citronsyre reparations væske (300 mL) i en antigen reparations boks, og Opvarm dem derefter i mikrobølgeovnen ved høj effekt i 2 minutter, efterfulgt af opvarmning ved lav effekt for at opretholde kogning i 6 min.
    3. Lad sektionerne køle ned naturligt til stuetemperatur.
    4. Udskift citronsyre reparations væsken med 0,01 M PBS, vask afsnittene 3x, hver gang i 5 minutter, i rotations rysteapparatet ved stuetemperatur.
  8. Eliminer den endogene peroxidase.
    1. 30% af H2o2 til 3% fortyndes med DDH2o, tilsæt den til slidene (Sørg for, at den dækker alle væv), og Inkuber gliderne i en våd kasse ved stuetemperatur i 30 minutter.
      Bemærk: den våde boks er en plastikæske på 10 x 15 cm og kan indeholde vand.
    2. Vask slidene 3x, hver gang i 5 min, med 0,01 M PBS i rotations rysteapparatet ved stuetemperatur.
  9. Bloker det uspecifikke antigen.
    1. Det koncentrerede normale gede serum fortyndes til 10% gede serum med PBS med 0,1% Tween 20 (PBST).
    2. Tilsæt 10% gede serum til slidene og Inkuber dem i den våde boks ved 37 °C i 30 minutter.
      Bemærk: gede serum skal dække alle væv i slidene.
  10. Plette vævet.
    1. Inkubatter med kanin anti-humant anti-ZWINT antistof (1:50) ved 4 °C natten over.
    2. Slidene 3 x, hver gang i 5 min, med 0,01 M PBST (1 mL 0,1% Tween 20 i 1.000 mL PBS) i rotations rysteapparatet ved stuetemperatur.
    3. De glider med sekundært antistof (anti-kanin detekteringssystem, 1:200) i 30 minutter ved 37 °C.
    4. Vask slidene 3x, hver gang i 5 min, med 0,01 M PBST i rotations rysteapparatet.
  11. For at visualisere immun farvning tilsættes diasene til 300 μL frisk 3, 3-diaminobenzidin og derefter vaskes gliderne med ledningsvand ved stuetemperatur.
    Bemærk: graden af farvning overvåges under et mikroskop (forstørrelse 10X-40X).
  12. Modvirker vævet. Plette gliderne med hematoxylinlegemer farvningsopløsning i 2 minutter ved stuetemperatur, og vask derefter gliderne med vand fra hanen i 15 minutter.
    Bemærk: kernen vises blå under mikroskopet (forstørrelse 10X-40X). Hvis graden af blå farvning er mere potent, salt alkohol differentiering for 3-5 s kan anvendes, efterfulgt af skylning vævet tilbage til blå med vand fra hanen i 15 min at lette den fremtrædende farvning af vævet.
  13. Dehydrere lysbillederne i 5 min i 50% ethanol, 5 min i 70% ethanol, 2x i 80% ethanol i 5 min, 5 min i 95% ethanol, og endelig 2x for 5 min hver i 100% ethanol ved stuetemperatur.
  14. For gennemsigtighed, Sænk vævs sektionerne i en tank, der indeholder 100% xylen i 15 minutter, og Overfør sektionerne til en anden tank, der indeholder 100% xylen i 15 minutter ved stuetemperatur.
  15. Til forsegling, tag 50-100 μL neutral tyggegummi og tilsæt 5% xylen til blandingen (undgå at blande i bobler). Tilsæt 15 μL af ovennævnte blanding til lungevævsektionerne. Forsegl filmen med Cover glas og tryk forsigtigt boblerne ud.

2. automatisk scanning af IHC-slides i hele dias

  1. Lad de forseglede lysbilleder tørre i 12 timer ved stuetemperatur for at udtørre dem.
  2. Vælg det lyse felt manuelt , og Indtast brugergrænsefladen til manuel scanning.
  3. Revider navnet på diasene, og vælg en lagrings sti til billederne.
  4. Indstil scanningsområdet, og vælg indstillingen Scan eksempler ved hjælp af brugerindstillede tærskler. Tærsklen er omkring 50 med et scanningsområde udvidelses værdi på 200 μm.
  5. Angiv værdien for scannings fokus, Vælg fokus automatisk – den spænder fra 1050 til 2650 – og vælg til sidst enkeltlags tilstand.
  6. Indlæs IHC-diasene på arbejdsstationen, og start den automatiske scanning.
    Bemærk: Sørg for, at diasene ikke er beskadigede. Holde slides rene og gennemsigtige og undgå støv, Confetti, og overskydende tætningsmiddel rester på slides. Glas sliden og dæksedlen skal være uden mærker. Rengør ikke gliderne med xylen. Størrelsen af diasene er angivet i tabel 1.
  7. Scan automatisk hele vævs afsnittet på et dias med en forstørrelse på 20X, 40X eller 100X.
  8. Indsamle og gemme billederne i slutningen af hele-slide scanning.

3. analyse af slides af imaging software

  1. Start den histopatologiske billedanalyse software, og vælg Lokal computer.
  2. Åbn den fil, der gemmer scannings dataene.
  3. Vælg det relevante zoomniveau fra område 2X til 40X.
  4. Juster farven for at indstille den optimale kontrast via Skift farvejustering.
  5. Manuel cirkel og navngiv dele af interesse på hvert billede.
    Bemærk: for eksempel kan du cirkel et område og navngive det som tumor område.
  6. Vælg plugins og QC. På dette tidspunkt dukker scenarie Builder op.
  7. Vælg tæthed Quant og Juster detekterings bjælken.
    Bemærk: denne proces skal udføres omhyggeligt. Linjen af blå tolerance bruges til at justere farven på cellekernen. Linjen med brun tolerance bruges til at justere mætningen af fyldfarven i billedet. Resultaterne af billederne efter justeringer bør være i overensstemmelse med de oprindelige modparter.
  8. Juster score niveauerne for at gøre farvnings intensiteten i de cirklede områder, der svarer til de oprindelige billeder.
    Bemærk: mørkebrun indikerer stærk positiv, brunlig gul er moderat positiv, lysegul er svagt positiv, og hvid er negativ.
  9. Gem og navngiv modellen som en fil. Anvend modellen på andre dias, og vælg markeret anmærkning".
  10. Lad softwaren automatisk beregne H-score for de cirklede områder i billedet.

4. kvantificering af pointene ved hjælp af H-scorings systemet9,10

  1. Procentdelen af immun farvning og farvnings intensiteten (0: negativ, 1 +: svag, 2 +: moderat, 3 +: stærk) beregnes.
  2. Brug et scoringssystem (H-score) til at beregne den patologiske scoring af tumoren og tilstødende nontumor områder.
    Bemærk: H-score = (% af celler med svag intensitet x 1) + (% af celler med moderat intensitet x 2) + (% af celler med stærk intensitet x 3). Derfor er den maksimale H-score 300, hvis 100% af cellerne kvantificeres med stærk intensitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi målte udtrykket niveauer af ZWINT i 28 par af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) prøver (tumor og tilstødende nontumor væv), herunder 14 planocellecarcinomer (SCCs) og 14 adenocarcinomer (ADCs), af IHC. Den digitale scanning af diasene på hele diaset leverede digitale billeder af høj kvalitet (figur 1a). Resultaterne viste, at H-score for lungekræft var signifikant højere end for tilstødende noncancer væv (P < 0,0001, to-sidet t-test) (figur 1a og 1b). Desuden fandt vi, at ekspressions niveauet for ZWINT i SCCs var betydeligt højere end i ADCs (figur 1c).

Figure 1
Figur 1 : Immun Histokemisk farvning af lungecancer væv. Dette tal er blevet ændret fra yuan et al. 5 med tilladelse fra Dove Press. A) dette panel viser repræsentative immunhistokemiske billeder af lungecancer patienter (forstørrelse: 10x og 40x). (B) dette panel viser H-score af lungekræft og tilstødende noncancer væv. (C) dette panel viser H-score af ADCS og SCCS. Fejllinjerne angiver standardafvigelsen. * P < 0,05; P < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

MIN (mm) MAX (mm)
Bredde 25 26
Længde 75 76
Tykkelse 0,9 1,2

Tabel 1: slide størrelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hel-slide scanning er ved at blive et varmt emne for sin robuste scanning og produktion af høj kvalitet billeder til kliniske og forskningsformål11,12,13. Billeder kan produceres ved slide-scanning mikroskoper inden for minutter11,12,13. Ved at anvende denne metode, vi opnåede billeder af høj kvalitet til ZWINT IHC slides og sammenlignede H-score mellem tumor og nontumor væv. I protokollen præsenteres her, de mest kritiske trin er forberedelsen af høj kvalitet IHC dias, billedet erhvervelse, og specifikation af tumor og nontumor områder før den patologiske scoring13,14 , 15 , 16.

Den nuværende metode har nogle fordele i forhold til (CLM). Digital scanning er hurtig nok (~ 20 slides/time) til at scanne en stak af slides og producere høj kvalitet digitale billeder. Det kan producere samstemmende resultater med CLM, men tager relativt mindre tid. Tilgængeligheden af digitale billeder gør det muligt, at det samme dias kan observeres samtidigt af flere personer. Digitale billeder af slides kan lagres i en database, hvilket betyder, at den langsigtede forringelse af glas glider undgås.

Begrænsningerne af denne teknik omfatter behovet for høj kvalitet væv og IHC slides6,8,11 og teknisk ekspertise til at specificere tumor eller nontumor vævsprøver før analysen ved hjælp af imaging software , for at undgå enhver forvirring om tumoren eller nontumor områder under scoring6,7. Operatøren skal også overvåge farvegengivelsen i hele digitaliseringsprocessen i hele slide Imaging17.

Denne metode kan anvendes aktivt i fisk, TMA, og Drug opdagelse og udvikling6,18. Tabata et al. har undersøgt brugen af wsi i primære patologiske diagnoser19. De analyserede retrospektivt 1070 WSI-prøver fra ni hospitaler i Japan og bekræftede valideringen af brugen af WSI i primære diagnoser. En af de vigtigste fordele ved WSI er, at det giver mulighed for samtidig visning af slides af flere studerende20. Derfor kan validering af hele dias scanningsbilleder bidrage til udviklingen af digital diagnostik til uddannelsesmæssige og forskningsmæssige formål6,18,21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette projekt blev støttet af Kinas nationale naturlige fundament (nr. 81500151, 81400121, 81270607, 81541027 og 81501352) og det naturlige fundament for Hubei-provinsen (Kina) (no. 2017CFB631). Forfatterne udtrykker deres påskønnelse af Guo Qin, Chang min, Li Hui, og deres kolleger på Wuhan Google Biological Technology Co., LTD for deres tekniske support. Forfatterne takker også Muhammad Jamal for sprog redningen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pannoramic MIDI 3D HISTECH Cat: PMIDI-040709 An automated digital slide scanner with a remarkable feature set :12-slide capacity, fluorescence scanning, and many more.
QuantCenter 3D HISTECH Downloaded from the official website of the company The framework for 3DHISTCH's image analysis applications.
LEICA RM2235 Leica Microsystems Cat: 14050038604 The enhanced precision of the new accessories will add convenience to block to knife approach as well as specimen orientation.
Rabbit anti-human Anti-ZWINT antibody Abcam Cat: ab197794 Immunohistochemical analysis of ZWINT in human lung tissue.
Anti-rabbit secondary antibody Wuhan Goodbio Technology Cat:GB23303-1 Secondary antibody for IHC staining.
Phosphate-buffered saline Wuhan Goodbio Technology Cat:G0002 A solution containing a phosphate buffer.
OLYMPUS CX23 OLYMPUS Cat:6M87620 Microscope for detection of H&E or IHC slides.
Dimethylbenzene Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Cat:1330-20-7 A colorless, flammable fluid used as a solvent and clarifying agent in the preparation of tissue sections for microscopic study.
Hematoxylin Staining Solution Wuhan Servicebio technology Cat:G1039 It is commonly used for histologic studies, oftern colors the nuclei of cells blue.
Tween 20 Baitg Cat:2005-64-5 It is a polysorbate-type nonionic surfactant formed by the ethoxylation of sorbitan before the addition of lauric acid. It is used as a deterent and emulsifier in pharmacological applications.
Citric acid repair liquid Wuhan Servicebio technology Cat:G1202 Is is used to repair antigen after fixation during IHC procedure.
LEICA ASP200s Leica Cat: 14048043626 It was designed for routine and research histopathology of up to 200 cassettes.
LEICA Arcadia H Leica Cat: 14039354103 It is a heated paraffin embedding station and allows for simple operation and precise control, resulting in improved quality, a smooth workflow and reliability.
LEICA Arcadia C Leica Cat: 14039354102 It is a cold plate holding more than 60/65 cassettes on its large working surface. It was designed with an environment adaptive control module to make sure the operating temperature is always stabilized at -6°C.
CaseViewer Software 3DHISTECH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Endo, H., Ikeda, K., Urano, T., Horie-Inoue, K., Inoue, S. Terf/TRIM17 stimulates degradation of kinetochore protein ZWINT and regulates cell proliferation. The Journal of Biochemistry. 151 (2), 139-144 (2012).
  2. Wang, H., et al. Human Zwint-1 specifies localization of Zeste White 10 to kinetochores and is essential for mitotic checkpoint signaling. Journal of Biological Chemistry. 279 (52), 54590-54598 (2004).
  3. Lin, Y. T., Chen, Y., Wu, G., Lee, W. H. Hec1 sequentially recruits Zwint-1 and ZW10 to kinetochores for faithful chromosome segregation and spindle checkpoint control. Oncogene. 25 (52), 6901-6914 (2006).
  4. Ying, H., et al. Overexpression of Zwint predicts poor prognosis and promotes the proliferation of hepatocellular carcinoma by regulating cell-cycle-related proteins. OncoTargets and Therapy. 11, 689-702 (2018).
  5. Yuan, W., et al. Bioinformatic analysis of prognostic value of ZW10 interacting protein in lung cancer. OncoTargets and Therapy. 11, 1683-1695 (2018).
  6. Higgins, C. Applications and challenges of digital pathology and whole slide imaging. Biotechnic & Histochemistry. 90 (5), 341-347 (2015).
  7. Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
  8. Al-Janabi, S., Huisman, A., van Diest, P. J. Digital pathology: current status and future perspectives. Histopathology. 61 (1), 1-9 (2012).
  9. Bonomi, P. D., et al. Predictive biomarkers for response to EGFR-directed monoclonal antibodies for advanced squamous cell lung cancer. Annals of Oncology. 29 (8), 1701-1709 (2018).
  10. Villalobos, M., et al. ERCC1 assessment in upfront treatment with and without cisplatin-based chemotherapy in stage IIIB/IV non-squamous non-small cell. Medical Oncology. 35 (7), 106 (2018).
  11. Griffin, J., Treanor, D. Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back? Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).
  12. Huisman, A., Looijen, A., van den Brink, S. M., van Diest, P. J. Creation of a fully digital pathology slide archive by high-volume tissue slide scanning. Human Pathology. 41 (5), 751-775 (2010).
  13. Gray, A., Wright, A., Jackson, P., Hale, M., Treanor, D. Quantification of histochemical stains using whole slide imaging: development of a method and demonstration of its usefulness in laboratory quality control. Journal of Clinical Pathology. 68 (3), 192-199 (2015).
  14. Hofman, F. M., Taylor, C. R. Immunohistochemistry. Current Protocols in Immunology. 103, Unit 21.4 (2013).
  15. Ramos-Vara, J. A. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
  16. Otali, D., Fredenburgh, J., Oelschlager, D. K., Grizzle, W. E. A standard tissue as a control for histochemical and immunohistochemical staining. Biotechnic & Histochemistry. 91 (5), 309-326 (2016).
  17. Clarke, E. L., Treanor, D. Colour in digital pathology: a review. Histopathology. 70 (2), 153-163 (2017).
  18. Potts, S. J. Digital pathology in drug discovery and development: multisite integration. Drug Discovery Today. 14 (19-20), 935-941 (2009).
  19. Tabata, K., et al. Whole-slide imaging at primary pathological diagnosis: Validation of whole-slide imaging-based primary pathological diagnosis at twelve Japanese academic institutes. Pathology International. 67 (11), 547-554 (2017).
  20. Saco, A., Bombi, J. A., Garcia, A., Ramírez, J., Ordi, J. Current Status of Whole-Slide Imaging in Education. Pathobiology. 83 (2-3), 79-88 (2016).
  21. Griffin, J., Treanor, D. Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back? Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).

Tags

Kræftforskning automatisk digital teknik lungekræft ZW10 interagerende protein immun farvning digitaliseret hel-slide Imaging H-score
Digital analyse af immun farvning af ZW10 interagerende protein i humant lunge væv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, Y., Song-ping, X., Pan, L.,… More

Wen, Y., Song-ping, X., Pan, L., Xiao-yan, L., Shan, P., Qian, Y., Meng, S., Xiao-xing, H., Rui-jing, X., Jie, X., Qiu-ping, Z., Liang, S. Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues. J. Vis. Exp. (147), e58551, doi:10.3791/58551 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter