Cancer Research

मानव फेफड़ों के ऊतकों में $W10 बातचीत प्रोटीन के इम्यूनोस्टेनिंग का डिजिटल विश्लेषण

Published: May 1, 2019 doi: 10.3791/58551

Yuan Wen¹, Xie Song-ping², Liu Pan³, Liu Xiao-yan¹, Pan Shan⁴, Yin Qian⁴, Sun Meng⁵, Huang Xiao-xing⁶, Xiao Rui-jing⁴, Xiong Jie⁴, Zhang Qiu-ping⁴, Shao Liang¹

¹Department of Hematology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, ²Department of Thoracic Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, ³Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, ⁴Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Wuhan University, ⁵Department of Gastroenterology, Central Hospital of Wuhan, ⁶Department of Transfusion, Zhongnan Hospital of Wuhan University

Summary

$W10 बातचीत प्रोटीन (जेडआईओटी) माइटोटिक धुरी जांच की चौकी और कार्सिनोमा के रोगजनन में भाग लेता है। यहाँ, हम मानव फेफड़ों के कैंसर के ऊतकों में $WINT के इम्यूनोस्टेनिंग की एक पद्धति पेश करते हैं, जिसके बाद पूरी स्लाइड्स और छवि विश्लेषण की डिजिटल स्कैनिंग होती है। इस पद्धति उच्च गुणवत्ता वाले डिजिटल छवियों और विश्वसनीय परिणाम प्रदान कर सकते हैं.

Abstract

इस अध्ययन का उद्देश्य मानव फेफड़ों के ऊतकों के इम्यूनोस्टेनिंग की एक पद्धति शुरू करना है, जिसके बाद पूरे-स्लाइड डिजिटल स्कैनिंग और छवि विश्लेषण का पालन किया जाता है। डिजिटल स्कैनिंग स्लाइड के ढेर को स्कैन करने और उच्च गुणवत्ता वाले डिजिटल छवियों का उत्पादन करने का एक तेज़ तरीका है। यह पैथोलॉजिस्ट द्वारा पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी (सीएलएम) के साथ सामंजस्यपूर्ण परिणाम का उत्पादन कर सकते हैं। इसके अलावा, डिजिटल छवियों की उपलब्धता यह संभव है कि एक ही स्लाइड समवर्ती कई लोगों द्वारा मनाया जा सकता है बनाता है. इसके अलावा, स्लाइड की डिजिटल छवियों को डेटाबेस में संग्रहीत किया जा सकता है, जिसका अर्थ है कि कांच की स्लाइडों की दीर्घकालिक गिरावट से बचा जा सकता है। इस तकनीक की सीमाएं इस प्रकार हैं। सबसे पहले, यह किसी भी क्षति या अतिरिक्त सीलेंट अवशेषों के बिना उच्च गुणवत्ता वाले तैयार ऊतक और मूल इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) स्लाइड की जरूरत है। दूसरा, ट्यूमर या nontumor क्षेत्रों सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण से पहले अनुभवी पैथोलॉजिस्ट द्वारा निर्दिष्ट किया जाना चाहिए, स्कोरिंग के दौरान ट्यूमर या nontumor क्षेत्रों के बारे में किसी भी भ्रम से बचने के लिए. तीसरा, ऑपरेटर पूरे स्लाइड इमेजिंग में डिजिटलीकरण प्रक्रिया भर में रंग प्रजनन को नियंत्रित करने की जरूरत है.

Introduction

$W10 बातचीत प्रोटीन ($WINT) kinetochore परिसर का एक आवश्यक घटक है जो माइटोटिक धुरी जांच की चौकी¹^,²^,³में शामिल है । यह सूचित किया गया है कि जिंट की कमी से समय पूर्व गुणसूत्र पृथक्करण¹^,²^,³होता है . हाल के अध्ययनों से पता चला है कि ट्यूमर कोशिकाओं^केप्रसार को बढ़ावा देने के द्वारा कई ट्यूमर के रोगजनन में शामिल है^{4 ,}⁵. हम पहले फेफड़ों के कैंसर⁵में $WINT के overexpression की सूचना दी. यह व्यापक रूप से स्वीकार किया गया है कि सीएलएम का उपयोग करने वाले पैथोलॉजिस्ट द्वारा स्लाइडों का विश्लेषण समय लेने वाला है न कि मात्रात्मक⁶^,⁷^,⁸_. इसके अलावा, संग्रहीत ग्लास स्लाइड की गिरावट से पहले बनाई गई स्लाइड्स को वापस लेना असंभव हो सकता है। कंप्यूटर आधारित, डिजिटल पूरे स्लाइड इमेजिंग (डब्ल्यूएसआई) के उभरते विधि इन सीमाओं को पार कर सकते^{हैं 6}^,⁷^,⁸.

इस अंत में, हम मानव फेफड़ों के कैंसर के ऊतकों में $WINT के इम्यूनोस्टेनिंग की एक पद्धति का वर्णन करते हैं, जो पूरे-स्लाइड डिजिटल स्कैनिंग और सॉफ्टवेयर-आधारित छवि विश्लेषण के साथ मिलकर होते हैं। इस पद्धति का मुख्य लाभ सीएलएम के साथ सुसंगत परिणामों का उत्पादन है। इस प्रौद्योगिकी व्यापक रूप से hematoxylin-eosin धुंधला (एच एंड ई) और IHC, situ संकरीकरण (फिश), ऊतक microarrays (TMA), और दवा की खोज और विकास में फ्लोरोसेंट के रोग स्कोरिंग के क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Protocol

यहाँ वर्णित सभी तरीकों वुहान विश्वविद्यालय के झोंगना अस्पताल और वुहान विश्वविद्यालय के रेनमिन अस्पताल की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है.

1. आईएचसी स्लाइड की तैयारी

कमरे के तापमान (आरटी) में 24 एच के लिए फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में मानव फेफड़ों के ऊतक ों के टुकड़े (लगभग 3 x 3 सेमी) को डुबोकर फेफड़ों के ऊतकों के नमूने को ठीक करें।
कमरे के तापमान पर क्रमशः 80%, 95%, और 100% इथेनॉल के लिए 15 मिनट, 20 मिनट, और 20 मिनट में ऊतक निर्जलीकरण। अंत में, कमरे के तापमान पर प्रत्येक 20 मिनट के लिए 100% xylene 3x में ऊतक विसर्जित कर दिया।
embedding के लिए, 30 मिनट के लिए पैराफिन (63 डिग्री सेल्सियस) में ऊतक विसर्जित. पैराफिन बदलें और एक और 45 मिनट के लिए फिर से ऊतक विसर्जित. अंत में, फिर से पैराफिन बदलने के लिए और एक अतिरिक्त 1 ज के लिए यह में ऊतक विसर्जित कर दिया।
ऊतक को 5 डिग्री-थिक खंडों में काटने के लिए एक रोटरी माइक्रोटोम का उपयोग करें और उन्हें 20 ग्राम/एमएल पॉली-एल-लीसिन-कोटेड स्लाइडों पर रखें।
dewaxing के लिए, 2 एच के लिए एक 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में स्लाइड जगह है और, फिर, 15 मिनट के लिए dimethylbenzene में वर्गों विसर्जित, 15 मिनट के लिए 100% xylene में भिगोने के बाद.
ऊतक वर्गों के साथ स्लाइड 2x 100% इथेनॉल में 5 मिनट के लिए हाइड्रेट, 95% इथेनॉल में 5 मिनट के क्रमिक पतला इथेनॉल के साथ एक उपचार के बाद, 80% इथेनॉल में 5 मिनट, 70% इथेनॉल में 5 मिनट, और 50% इथेनॉल में 5 मिनट.
प्रतिजन की मरम्मत करते हैं.
1. डिल्यूट साइट्रिक एसिड मरम्मत तरल (20x) डबल-डिस्टिल्ड एच₂ओ (डीडीएच₂हे) के साथ 1x करने के लिए।
2. एक प्रतिजन की मरम्मत बॉक्स में ऊतक वर्गों और 1x साइट्रिक एसिड की मरम्मत तरल (300 एमएल) के साथ स्लाइड प्लेस और फिर, उन्हें 2 मिनट के लिए उच्च शक्ति पर माइक्रोवेव ओवन में गर्मी, कम शक्ति पर हीटिंग के बाद 6 मिनट के लिए उबलते बनाए रखने के लिए.
3. वर्गों कमरे के तापमान के लिए स्वाभाविक रूप से ठंडा करने के लिए अनुमति दें।
4. 0.01 एम पीबीएस के साथ साइट्रिक एसिड की मरम्मत तरल बदलें, वर्गों 3x धोने, कमरे के तापमान पर रोटरी शेकर में 5 मिनट के लिए हर बार।
अंतर्जात peroxidase को हटा दें.
1. डीडीएच 2 ओ के साथ 30% एच₂ओ₂ से 3% को दूर करें, इसे स्लाइडमें जोड़ें (यह सुनिश्चित करें कि यह सभी ऊतकों को कवर करता है), और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक गीले बॉक्स में स्लाइड्स को इनक्यूबेट करें।
  नोट: गीला बॉक्स 10 x 15 सेमी की एक प्लास्टिक बॉक्स है और पानी शामिल कर सकते हैं.
2. स्लाइड 3x धो लें, कमरे के तापमान पर रोटरी शेकर में 0.01 एम पीबीएस के साथ, 5 मिनट के लिए हर बार।
गैर-विशिष्ट प्रतिजन को ब्लॉक करें।
1. 0.1% ट्वीन 20 (PBST) के साथ पीबीएस के साथ 10% बकरी सीरम के लिए केंद्रित सामान्य बकरी सीरम को शांत करना।
2. स्लाइड में 10% बकरी सीरम जोड़ें और उन्हें 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गीले बॉक्स में इनक्यूबेट करें।
  नोट: बकरी सीरम स्लाइड में सभी ऊतकों को कवर करना चाहिए.
ऊतकों को दागें।
1. रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर खरगोश विरोधी मानव विरोधी -WINT एंटीबॉडी (1:50) के साथ स्लाइड इनक्यूबेट करें।
2. स्लाइड 3x धो लें, 5 मिनट के लिए हर बार, 0.01 एम PBST के साथ (1 एमएल 0.1% ट्वीन 20 में 1,000 एमएल PBS) कमरे के तापमान पर रोटरी शेकर में.
3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी (विरोधी रैबिट डिटेक्शन सिस्टम, 1:200) के साथ स्लाइडकोटे।
4. रोटरी शेकर में 0.01 एम PBST के साथ, 5 मिनट के लिए हर बार, 3x स्लाइडवॉश करें।
इम्यूनोस्टेनिंग को देखने के लिए, स्लाइडको ताजा 3,3-डायमिनोबेन्जिन के 300 डिग्री सेल्सियस में जोड़ें और फिर, कमरे के तापमान पर नल के पानी के साथ स्लाइड को धो लें।
नोट: रंगाई की डिग्री एक माइक्रोस्कोप (मैग्नीफिकेशन 10X - 40X) के तहत नजर रखी है।
ऊतक को काउंटरस्टेन करें। कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए हेमेटोक्सीलिन धुंधला समाधान के साथ स्लाइड दाग और, फिर, 15 मिनट के लिए नल के पानी के साथ स्लाइड धो लें।
नोट: नाभिक माइक्रोस्कोप (मैग्नीफिकेशन 10X - 40X) के नीचे नीला दिखाई देता है। यदि नीले दाग की डिग्री अधिक शक्तिशाली है, हाइड्रोक्लोरिक शराब भेदभाव के लिए 3 - 5 एस इस्तेमाल किया जा सकता है, इसके बाद ऊतक को वापस नीले रंग में 15 मिनट के लिए नल के पानी के साथ rinsing द्वारा ऊतक के प्रमुख धुंधला की सुविधा के लिए.
50% इथेनॉल में 5 मिनट के लिए स्लाइड निर्जलित, 70% इथेनॉल में 5 मिनट, 80% इथेनॉल में 2x 5 मिनट के लिए, 95% इथेनॉल में 5 मिनट, और अंत में, कमरे के तापमान पर 100% इथेनॉल में 5 मिनट प्रत्येक के लिए 2x.
पारदर्शिता के लिए, 15 मिनट के लिए 100% xylene युक्त एक टैंक में ऊतक वर्गों विसर्जित और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 100% xylene युक्त एक और टैंक के लिए वर्गों हस्तांतरण.
सीलिंग के लिए, तटस्थ गम के 50 - 100 डिग्री एल लें और मिश्रण में 5% xylene जोड़ें (बबलों में मिश्रण से बचें)। फेफड़ों के ऊतकों के वर्गों में उपर्युक्त मिश्रण का 15 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। कवर ग्लास के साथ फिल्म सील और धीरे बुलबुले बाहर दबाएँ.

2. IHC स्लाइड के स्वत: पूरे स्लाइड स्कैनिंग

सील की गई स्लाइडको कमरे के तापमान पर 12 एच के लिए सूखने दें ताकि उन्हें निष्क्रिय किया जा सके।
मैन्युअल रूप से उज्ज्वल क्षेत्र विकल्प का चयन करें और मैनुअल स्कैनिंग इंटरफ़ेस दर्ज करें।
स्लाइड्स के नाम को संशोधित करें और छवियों के लिए एक भंडारण पथ का चयन करें।
स्कैनिंग क्षेत्र सेट करें और उपयोगकर्ता-सेट थ्रेशोल्ड का उपयोग कर के नमूने स्कैनविकल्प का चयन करें। सीमा के बारे में 50 है एक स्कैनिंग क्षेत्र विस्तार मूल्य के साथ 200 डिग्री.
स्कैनिंग फोकस मान सेट करें, स्वचालित रूप से फ़ोकस का चयन करें-यह 1050 से 2650 तक है और अंत में, एकल-परत मोडका चयन करें।
कार्यस्थान पर IHC स्लाइड लोड करें और स्वचालित स्कैनिंग प्रारंभ करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि स्लाइड क्षतिग्रस्त नहीं हैं। स्लाइड को साफ और पारदर्शी रखते हुए और स्लाइड पर धूल, कंफ़ेद्दी, और अतिरिक्त सीलेंट अवशेषों से बचें। कांच की स्लाइड और कवरस्लिप अंकों से रहित होना चाहिए। xylene के साथ स्लाइड साफ न करें। स्लाइड का आकार तालिका 1में दिया गया है।
स्वचालित रूप से 20X, 40X, या 100X आवर्धन के साथ एक स्लाइड पर पूरे ऊतक अनुभाग स्कैन.
पूरी-स्लाइड स्कैनिंग के अंत में छवियों को संग्रहीत और संग्रहीत करें.

3. इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा स्लाइड का विश्लेषण

हिस्टोपैथोलॉजिकल छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रारंभ करें और स्थानीय कंप्यूटरका चयन करें।
वह फ़ाइल खोलें जो स्कैनिंग डेटा संग्रहीत करती है.
रेंज 2X से 40X करने के लिए उपयुक्त ज़ूम स्तर का चयन करें।
टॉगलरंग समायोजित के माध्यम से इष्टतम विपरीत सेट करने के लिए रंग समायोजित करें।
मैन्युअल रूप से वृत्त और प्रत्येक छवि पर ब्याज के भागों का नाम.
नोट: उदाहरण के लिए, आप एक क्षेत्र सर्कल और ट्यूमर क्षेत्रके रूप में यह नाम कर सकते हैं।
Plugins और QCका चयन करें | इस समय, परिदृश्य बिल्डर पॉप अप करता है.
घनत्व क्वांट का चयन करें और पता लगाने पट्टी समायोजित करें।
नोट: इस प्रक्रिया को सावधानी से किया जाना चाहिए. ब्लू सहिष्णुता के बार सेलुलर नाभिक के रंग को समायोजित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। ब्राउन सहिष्णुता के बार छवि में भरने के रंग की संतृप्ति को समायोजित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. समायोजन के बाद छवियों के परिणाम मूल समकक्षों के साथ संगत होना चाहिए।
मूल छवियों के समान वृत्त क्षेत्रों के धुंधला तीव्रता बनाने के लिए स्कोर के स्तर को समायोजित करें।
नोट: गहरे भूरे रंग मजबूत सकारात्मक इंगित करता है, भूरे पीले मामूली सकारात्मक है, हल्के पीले कमजोर सकारात्मक है, और सफेद नकारात्मक है.
मॉडल को किसी फ़ाइल के रूप में संग्रहीत करें और नाम दें. मॉडल को अन्य स्लाइड्स पर लागू करें और चयनित एनोटेशनका चयन करें ".
सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से छवि में वृत्त क्षेत्रों के लिए एच स्कोर की गणना करते हैं।

4. एच-स्कोरिंग सिस्टम^9,¹⁰ का उपयोग कर स्कोर की मात्रा

इम्यूनोस्टेनिंग और धुंधला तीव्रता के प्रतिशत की गणना करें (0: नकारात्मक, 1+: कमजोर, 2+: मध्यम, 3+: मजबूत)।
ट्यूमर और आसन्न nontumor क्षेत्रों के रोग स्कोरिंग की गणना करने के लिए एक स्कोरिंग प्रणाली (एच स्कोर) का प्रयोग करें।
नोट: एच-स्कोर ] (कम तीव्रता x 1) के साथ कोशिकाओं का% + (% मध्यम तीव्रता x 2) के साथ कोशिकाओं का + (% मजबूत तीव्रता x 3 के साथ कोशिकाओं का)। इसलिए, अधिकतम एच स्कोर 300 है अगर कोशिकाओं के 100% मजबूत तीव्रता के साथ परिमाणित कर रहे हैं.

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Representative Results

हमने IHC द्वारा 14 स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एससीसी) और 14 एडेनोकार्सीनोमा (एडीसी) सहित गैर-छोटे-छोटे कोशिका फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी) नमूनों (ट्यूमर और आसन्न nontumor ऊतकों) के 28 जोड़े में $WINT की अभिव्यक्ति के स्तर को मापा। स्लाइड की पूरी स्लाइड डिजिटल स्कैनिंग उच्च गुणवत्ता के डिजिटल छवियों प्रदान की (चित्र 1A). परिणामों से पता चला कि फेफड़ों के कैंसर के एच स्कोर आसन्न गैर कैंसर ऊतकों की तुलना में काफी अधिक था (पी एंड एलटी; 0.0001, दो पूंछ टी-परीक्षण) (चित्र 1A और 1B)। इसके अतिरिक्त, हमने पाया कि SCCs में $WINT का व्यंजक स्तर ADCs (चित्र1C)की तुलना में काफी अधिक था।

चित्र 1 : फेफड़ों के कैंसर के ऊतकों के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला। यह आंकड़ा युआन एट अल से संशोधित किया गया है. कबूतर प्रेस से अनुमति के साथ 5. (ए) यह पैनल फेफड़ों के कैंसर रोगियों (मैग्नीफिकेशन: 10X और 40X) के प्रतिनिधि इम्यूनोहिस्टोकेमिकल छवियों को दिखाता है। (ख) यह पैनल फेफड़ों के कैंसर और आसन्न गैर कैंसर ऊतकों के एच-स्कोर को दर्शाता है। (सी) यह पैनल एडीसी और एससीसी के एच-स्कोर को दर्शाता है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. * पी एंड एलटी; 0.05; पी और 0.001. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

	MIN (मिमी)	मैक्स (मिमी)
चौड़ाई	25	26
लंबाई	75	76
मोटाई	0.9	१.२

तालिका 1: स्लाइड आकार.

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Discussion

पूरे स्लाइड स्कैनिंग अपनी मजबूत स्कैनिंग और नैदानिक और अनुसंधान प्रयोजनों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले छवियों के उत्पादन के लिए एक गर्म विषय बनता जा रहा है¹¹^,¹²^,¹³. छवियाँमिनट¹¹,¹²^,¹³के भीतर स्लाइड स्कैनिंग माइक्रोस्कोप द्वारा उत्पादित किया जा सकता है। इस पद्धति को लागू करने से, हम $WINT IHC स्लाइड के लिए उच्च गुणवत्ता वाले चित्र प्राप्त किया और ट्यूमर और nontumor ऊतकों के बीच एच स्कोर की तुलना में. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, सबसे महत्वपूर्ण कदम उच्च गुणवत्ता वाले IHC स्लाइड की तैयारी कर रहे हैं, छवि अधिग्रहण, और रोग स्कोरिंग से पहले ट्यूमर और nontumor क्षेत्रों के विनिर्देश¹³^,¹⁴ ^, ¹⁵ ^, ¹⁶.

वर्तमान विधि (CLM) की तुलना में कुछ लाभ है। स्लाइड्स के ढेर को स्कैन करने और उच्च-गुणवत्ता वाले डिजिटल छवियों का उत्पादन करने के लिए डिजिटल स्कैनिंग काफी तेज़ है ($ 20 स्लाइड/ यह CLM के साथ सामंजस्य परिणाम का उत्पादन कर सकते हैं, लेकिन अपेक्षाकृत कम समय लगता है. डिजिटल छवियों की उपलब्धता यह संभव है कि एक ही स्लाइड एक साथ कई लोगों द्वारा मनाया जा सकता है बनाता है। स्लाइड की डिजिटल छवियों को डेटाबेस में संग्रहीत किया जा सकता है, जिसका अर्थ है कि कांच की स्लाइड्स की दीर्घकालिक गिरावट से बचा जा सकता है।

इस तकनीक की सीमाओं में उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक और आईएचसी स्लाइड⁶^,⁸^,¹¹ और तकनीकी विशेषज्ञता के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण से पहले ट्यूमर या nontumor ऊतक नमूने निर्दिष्ट करने की आवश्यकता शामिल 6^,⁷अंक प्राप्त करने के दौरान ट्यूमर या गैर ट्यूमर क्षेत्रों के बारे में किसी भी भ्रम से बचने के लिए . ऑपरेटर भी पूरे स्लाइड इमेजिंग¹⁷में डिजिटलीकरण प्रक्रिया भर में रंग प्रजनन की निगरानी की जरूरत है.

इस विधि को फिश, टीएमए, और दवा की खोज और विकास⁶^,¹⁸में सक्रिय रूप से लागू किया जा सकता है। Tabata एट अल प्राथमिक रोग निदान¹⁹में WSI के उपयोग की जांच की है. वे पूर्वव्यापी जापान में नौ अस्पतालों से 1070 WSI नमूनों का विश्लेषण किया और प्राथमिक निदान में WSI के उपयोग के सत्यापन की पुष्टि की. WSI का मुख्य लाभ यह है कि यह एक साथ कई छात्रों द्वारा स्लाइड देखने की अनुमति देता है²⁰. इसलिए, पूरे स्लाइड स्कैनिंग छवियों के सत्यापन शैक्षिक और अनुसंधान प्रयोजनों के लिए डिजिटल निदान के विकास में योगदान कर सकते^{हैं 6},¹⁸^,²¹.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस परियोजना को नेशनल नेचुरल फाउंडेशन ऑफ चाइना (नं. 81500151, 81400121, 81270607, 81541027, और 81501352) और हुबेई प्रांत (चीन) (नहीं 2017CFB631) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक अपने तकनीकी समर्थन के लिए वुहान गूगल बायोलॉजिकल टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड में Guo Qin, चांग मिन, ली Hui, और उनके सहयोगियों के लिए अपनी प्रशंसा व्यक्त करते हैं। लेखक भी भाषा संपादन के लिए मुहम्मद जमाल धन्यवाद.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pannoramic MIDI	3D HISTECH	Cat: PMIDI-040709	An automated digital slide scanner with a remarkable feature set :12-slide capacity, fluorescence scanning, and many more.
QuantCenter	3D HISTECH	Downloaded from the official website of the company	The framework for 3DHISTCH's image analysis applications.
LEICA RM2235	Leica Microsystems	Cat: 14050038604	The enhanced precision of the new accessories will add convenience to block to knife approach as well as specimen orientation.
Rabbit anti-human Anti-ZWINT antibody	Abcam	Cat: ab197794	Immunohistochemical analysis of ZWINT in human lung tissue.
Anti-rabbit secondary antibody	Wuhan Goodbio Technology	Cat:GB23303-1	Secondary antibody for IHC staining.
Phosphate-buffered saline	Wuhan Goodbio Technology	Cat:G0002	A solution containing a phosphate buffer.
OLYMPUS CX23	OLYMPUS	Cat:6M87620	Microscope for detection of H&E or IHC slides.
Dimethylbenzene	Shanghai Lingfeng Chemical Reagent	Cat:1330-20-7	A colorless, flammable fluid used as a solvent and clarifying agent in the preparation of tissue sections for microscopic study.
Hematoxylin Staining Solution	Wuhan Servicebio technology	Cat:G1039	It is commonly used for histologic studies, oftern colors the nuclei of cells blue.
Tween 20	Baitg	Cat:2005-64-5	It is a polysorbate-type nonionic surfactant formed by the ethoxylation of sorbitan before the addition of lauric acid. It is used as a deterent and emulsifier in pharmacological applications.
Citric acid repair liquid	Wuhan Servicebio technology	Cat:G1202	Is is used to repair antigen after fixation during IHC procedure.
LEICA ASP200s	Leica	Cat: 14048043626	It was designed for routine and research histopathology of up to 200 cassettes.
LEICA Arcadia H	Leica	Cat: 14039354103	It is a heated paraffin embedding station and allows for simple operation and precise control, resulting in improved quality, a smooth workflow and reliability.
LEICA Arcadia C	Leica	Cat: 14039354102	It is a cold plate holding more than 60/65 cassettes on its large working surface. It was designed with an environment adaptive control module to make sure the operating temperature is always stabilized at -6°C.
CaseViewer Software	3DHISTECH