Summary
ZW10 interactie eiwit (ZWINT) neemt deel aan de mitotische spil controlepost en de pathogenese van carcinoom. Hier introduceren we een methodologie van de immunokleuring van ZWINT in menselijke longkanker weefsels, gevolgd door het digitaal scannen van hele dia's en beeldanalyse. Deze methodologie kan digitale beelden van hoge kwaliteit en betrouwbare resultaten bieden.
Abstract
Het doel van deze studie is om een methodologie van de immuunkleuring van menselijke Long weefsels te introduceren, gevolgd door een digitale scan van de hele dia en beeldanalyse. Digitaal scannen is een snelle manier om een stapel dia's te scannen en digitale beelden met hoge kwaliteit te produceren. Het kan overeenstemmende resultaten opleveren met conventionele Lichtmicroscopie (CLM) door pathologen. Bovendien maakt de beschikbaarheid van digitale beelden het mogelijk dat dezelfde Slide gelijktijdig kan worden waargenomen door meerdere mensen. Bovendien kunnen digitale afbeeldingen van dia's in een database worden opgeslagen, wat betekent dat de verslechtering op de lange termijn van glaasjes wordt vermeden. De beperkingen van deze techniek zijn als volgt. Ten eerste heeft het kwalitatief hoogwaardig geprepareerd weefsel en de originele immunohistochemie (IHC) glijbanen nodig, zonder enige beschadiging of overtollig afdichtings residu. Tweede, tumor of nontumor gebieden moeten worden gespecificeerd door ervaren pathologen vóór de analyse met behulp van software, om verwarring over de tumor of nontumor gebieden tijdens het scoren te voorkomen. Ten derde moet de operator de kleurreproductie tijdens het digitaliseringsproces in volledige diabeeldvorming controleren.
Introduction
ZW10 interactie eiwit (zwint) is een noodzakelijk onderdeel van het kinetochoor complex dat betrokken is bij de mitotische spil controlepunt1,2,3. Er is gemeld dat de uitputting van zwint leidt tot afwijkende voortijdige chromosoomsegregatie1,2,3. Recente studies hebben gesuggereerd dat zwint is betrokken bij de pathogenese van meerdere tumoren door het bevorderen van de proliferatie van tumorcellen4,5. Eerder rapporteerden we de overexpressie van ZWINT in longkanker5. Het is algemeen aanvaard dat de analyse van dia's door pathologen die CLM gebruiken, tijdrovend is en niet kwantitatief6,7,8. Bovendien kan de verslechtering van de opgeslagen glaasjes het onmogelijk maken om eerder gemaakte dia's te intrekken. De opkomende methode van computergebaseerde, digitale whole-Slide Imaging (WSI) kan deze beperkingen6,7,8overwinnen.
Daartoe beschrijven we een methodologie van de immunokleuring van ZWINT in menselijke longkanker weefsels, in combinatie met digitale scanning van de hele dia en software-gebaseerde beeldanalyse. Het belangrijkste voordeel van deze methodologie is de productie van overeenstemmende resultaten met clm. Deze technologie kan op grote schaal worden gebruikt op het gebied van pathologische scoring van hematoxyline-eosine kleuring (H & E) en IHC, fluorescentie in situ HYBRIDISATIE (vis), weefsel micro ARRAYS (TMA), en het opsporen en ontwikkelen van geneesmiddelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de ethische commissie van Zhongnan Hospital van Wuhan University en Renmin Hospital van Wuhan University.
1. voorbereiding van de IHC-glijbanen
- Fixeer het longweefsel monster door het menselijke longweefsel fragment (ongeveer 3 x 3 cm) in 4% Paraformaldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor 24 uur bij kamertemperatuur (RT) onder te dompelen.
- Dehydraat het weefsel in 80%, 95%, en 100% ethanol gedurende 15 min, 20 min, en 20 min, respectievelijk, bij kamertemperatuur. Tot slot, dompel het weefsel in 100% xyleen 3x voor 20 min elk bij kamertemperatuur.
- Voor inbedding, dompel het weefsel in paraffine (63 ° c) gedurende 30 min. Verander de paraffine en dompel het weefsel opnieuw op voor nog eens 45 min. Tot slot, verander de paraffine opnieuw en dompel het weefsel in het voor een extra 1 h.
- Gebruik een roterende microtoom om het weefsel in 5 μm dikke delen te snijden en plaats ze op 20 μg/mL poly-L-lysine-gecoate dia's.
- Voor het Dewaxing, plaats de glaasjes in een 65 ° c oven voor 2 h en dompel vervolgens de delen in dimethylbenzeen gedurende 15 minuten, gevolgd door onderdompelen in 100% xyleen gedurende 15 min.
- Hydrateer de dia's met de weefsel secties 2x voor 5 min in 100% ethanol, gevolgd door een behandeling met een serie verdunde ethanol van 5 min in 95% ethanol, 5 min in 80% ethanol, 5 min in 70% ethanol, en 5 min in 50% ethanol.
- Antigeen reparatie uitvoeren.
- Verdun citroenzuur reparatie vloeistof (20x) tot 1x met dubbel gedistilleerd H2o (DDH2o).
- Plaats de dia's met de weefsel secties en de 1x citroenzuur reparatie vloeistof (300 mL) in een antigeen reparatievak en verwarm ze vervolgens in de magnetron met hoog vermogen gedurende 2 minuten, gevolgd door verwarming op laag vermogen om het koken gedurende 6 minuten te ondersteunen.
- Laat de secties natuurlijk afkoelen tot kamertemperatuur.
- Vervang de citroenzuur reparatie vloeistof met 0,01 M PBS, was de secties 3x, elke keer gedurende 5 minuten, in het roterende Shaker bij kamertemperatuur.
- Elimineer de endogene peroxidase.
- Verdun 30% van H2o2 tot 3% met DDH2o, voeg het toe aan de glaasjes (zorg ervoor dat het alle weefsels bedekt) en inbroed de glaasjes in een natte doos bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
Let op: de natte doos is een plastic doos van 10 x 15 cm en kan water bevatten. - Was de dia's 3x, elke keer gedurende 5 minuten, met 0,01 M PBS in het roterende Shaker bij kamertemperatuur.
- Verdun 30% van H2o2 tot 3% met DDH2o, voeg het toe aan de glaasjes (zorg ervoor dat het alle weefsels bedekt) en inbroed de glaasjes in een natte doos bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Blokkeer het niet-specifieke antigeen.
- Verdun het geconcentreerde, normale geiten serum tot 10% geit serum met PBS met 0,1% Tween 20 (PBST).
- Voeg 10% geit serum toe aan de glijbanen en inbroed ze in de natte doos bij 37 °C gedurende 30 minuten.
Opmerking: het geiten serum moet alle weefsels in de glaasjes bedekken.
- Vlekken op de weefsels.
- Inbroed de glaasjes met konijn anti-humaan anti-ZWINT antilichaam (1:50) bij 4 °C 's nachts.
- Was de dia's 3x, elke keer gedurende 5 minuten, met 0,01 M PBST (1 mL 0,1% Tween 20 in 1.000 mL PBS) in het roterende Shaker bij kamertemperatuur.
- Inbroed de glaasjes met secundair antilichaam (anti-konijn detectiesysteem, 1:200) gedurende 30 min bij 37 °C.
- Was de dia's 3x, elke keer gedurende 5 minuten, met 0,01 M PBST in het roterende Shaker.
- Om de immunokleuring te visualiseren, voeg de glaasjes toe aan 300 μL vers 3, 3-diaminobenzidine en was de glijbaan met kraanwater bij kamertemperatuur.
Opmerking: de mate van het verven wordt gecontroleerd onder een microscoop (vergroting 10X-40X). - Het weefsel tegen vlekken. Vlek de dia's met een hematoxyline-kleurings oplossing gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en was de dia's vervolgens met kraanwater gedurende 15 minuten.
Opmerking: de Nucleus wordt blauw weergegeven onder de Microscoop (vergroting 10X-40X). Als de mate van blauwe kleuring krachtiger is, kan zout-alcohol differentiatie voor 3-5 s worden gebruikt, gevolgd door het weefsel gedurende 15 minuten terug te spoelen naar blauw met kraanwater om de prominente kleuring van het weefsel te vergemakkelijken. - Dehydraat de glaasjes 5 min in 50% ethanol, 5 min in 70% ethanol, 2x in 80% ethanol gedurende 5 min, 5 min in 95% ethanol, en ten slotte 2x voor 5 min elk in 100% ethanol bij kamertemperatuur.
- Voor transparantie, dompel de weefsel secties in een tank met 100% xyleen gedurende 15 minuten en breng de secties over naar een andere tank met 100% xyleen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Neem voor het afdichten 50-100 μL neutrale gom en voeg 5% xyleen toe aan het mengsel (Vermijd mengen in bellen). Voeg 15 μL van het bovengenoemde mengsel toe aan de longweefsel secties. Sluit de folie af met afdekglas en druk zachtjes op de bellen.
2. automatische volledige Slide scanning van IHC slides
- Laat de verzegelde glaasjes gedurende 12 uur op kamertemperatuur drogen om ze droog te maken.
- Selecteer de optie helderveld handmatig en voer de handmatige scan interface in.
- Wijzig de naam van de dia's en selecteer een opslagpad voor de afbeeldingen.
- Stel het scangebied in en kies de optie Scan samples met behulp van door de gebruiker ingestelde drempels. De drempel is ongeveer 50 met een scangebied uitbreidings waarde van 200 μm.
- Stel de waarde voor de scan focus in, selecteer automatisch de focus — het varieert van 1050 tot 2650 — en selecteer ten slotte de modus voor één laag.
- Laad de IHC-dia's op het werkstation en start het automatisch scannen.
Opmerking: Zorg ervoor dat de dia's niet beschadigd zijn. Houd de dia's schoon en doorschijnend en Vermijd stof, confetti en overtollige Afdicht resten op de dia's. De glazen glijbaan en dekglaasje moeten verstoken zijn van markeringen. Reinig de glaasjes niet met xyleen. De grootte van de dia's wordt aangegeven in tabel 1. - Scan de volledige weefsel sectie automatisch op een dia met een vergroting van 20X, 40X of 100X.
- Verzamel en bewaar de afbeeldingen aan het einde van het scannen van de hele dia.
3. analyse van de slides door Imaging software
- Start de histopathologische beeldanalyse software en selecteer lokale computer.
- Open het bestand waarin de scangegevens worden opgeslagen.
- Selecteer het gewenste zoomniveau van bereik 2X tot 40X.
- Pas de kleur aan om het optimale contrast in te stellen via kleuraanpassingin-/uitschakelen.
- Cirkel handmatig en noem de gedeelten van de interesse op elke afbeelding.
Let op: u bijvoorbeeld een gebied omcirkelen en het als tumor gebiednoemen. - Selecteer plugins en QC. Op dit moment, scenario Builder verschijnt.
- Selecteer dichtheids Quant en pas de detectie balk aan.
Opmerking: dit proces moet zorgvuldig worden uitgevoerd. De balk met blauwe tolerantie wordt gebruikt om de kleur van de cellulaire kern aan te passen. De balk met bruine tolerantie wordt gebruikt om de verzadiging van de vulkleur in de afbeelding aan te passen. De resultaten van de beelden na aanpassingen moeten consistent zijn met de oorspronkelijke tegenhangers. - Pas de Score niveaus aan om de kleurings intensiteit van de omcirkelde gebieden te laten lijken op die van de originele afbeeldingen.
Opmerking: donker bruin duidt op sterk positief, bruinachtig geel is matig positief, licht geel is zwak positief en wit is negatief. - Sla het model op en geef het een naam als bestand. Pas het model toe op andere dia's en selecteer geselecteerde aantekening".
- Laat de software automatisch de H-Score berekenen voor de omcirkelde gebieden in de afbeelding.
4. kwantificering van de scores met behulp van het H-scoring systeem9,10
- Bereken het percentage van de immunokleuring en de kleurings intensiteit (0: negatief, 1 +: zwak, 2 +: matig, 3 +: sterk).
- Gebruik een scorings systeem (H-Score) om de pathologische scores van de tumor en aangrenzende nontumor gebieden te berekenen.
Opmerking: H-Score = (% van cellen met zwakke intensiteit x 1) + (% van cellen met matige intensiteit x 2) + (% van cellen met sterke intensiteit x 3). Daarom is de maximale H-Score 300 als 100% van de cellen met een sterke intensiteit wordt gekwantificeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben de expressieniveaus van ZWINT gemeten in 28 paren van niet-kleincellige longkanker (NSCLC)-specimens (tumor en aangrenzende nontumor weefsels), waaronder 14 plaveiselcel carcinomen (Scc's) en 14 adenocarcinomen (ADCs), door IHC. De digitale afbeeldingen van hoge kwaliteit (Figuur 1a) worden digitaal gescand op de dia's. De resultaten toonden aan dat de H-Score van de longkanker significant hoger was dan die van aangrenzende niet-kanker weefsels (P < 0,0001, tweezijdige t-toets) (Figuur 1a en 1B). Daarnaast constateerden we dat het uitdrukkings niveau van ZWINT in Scc's significant hoger lag dan in ADCs (figuur 1c).
Figuur 1 : Immunohistochemische kleuring voor longkanker weefsels. Dit cijfer is gewijzigd van Yuan et al. 5 met toestemming van dove Press. (A) dit panel toont representatieve immunohistochemische beelden van longkanker patiënten (vergroingen: 10X en 40x). B) dit panel toont de H-Score van longkanker en aangrenzende nonkanker weefsels. (C) dit panel toont de H-Score van ADCS en scc's. De foutbalken geven de standaarddeviatie aan. * P < 0,05; P < 0,001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| MIN. (mm) | MAX (mm) | |
| Breedte | 25 | 26 |
| Lengte | 75 | 76 |
| Dikte | 0,9 | 1,2 |
Tabel 1: schuifmaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Scannen in hele dia's wordt een hot topic voor het robuuste scannen en produceren van afbeeldingen van hoge kwaliteit voor klinische en onderzoeksdoeleinden11,12,13. Afbeeldingen kunnen worden geproduceerd door dia-Scanning microscopen binnen minuten11,12,13. Door toepassing van deze methodologie, we verkregen van hoge kwaliteit beelden voor ZWINT IHC dia's en vergeleken de H-score tussen tumor en nontumor weefsels. In het protocol dat hier wordt gepresenteerd, zijn de meest kritieke stappen de voorbereiding van de hoogwaardige IHC-dia's, de beeld verwerving en de specificatie van de tumor-en nontumor gebieden vóór de pathologische scoring13,14 , 15 , 16.
De huidige methode heeft enkele voordelen ten opzichte van (CLM). Digitaal scannen is snel genoeg (~ 20 dia's per uur) om een stapel dia's te scannen en digitale afbeeldingen van hoge kwaliteit te produceren. Het kan overeenstemmende resultaten met CLM produceren, maar neemt relatief minder tijd in. De beschikbaarheid van digitale beelden maakt het mogelijk dat dezelfde dia gelijktijdig kan worden waargenomen door meerdere mensen. Digitale afbeeldingen van dia's kunnen worden opgeslagen in een database, wat betekent dat de verslechtering op de lange termijn van glaasjes wordt vermeden.
De beperkingen van deze techniek omvatten de noodzaak van kwalitatief hoogwaardige weefsel en IHC dia's6,8,11 en technische expertise om de tumor of nontumor weefselmonsters specificeren vóór de analyse met behulp van imaging software , om verwarring over de tumor of nontumor gebieden tijdens het scoren van6,7te voorkomen. De operator moet ook de kleurreproductie tijdens het digitaliseringsproces in de hele-Slide Imaging17bewaken.
Deze methode kan actief worden toegepast in vis, TMA, en Drug Discovery en ontwikkeling6,18. Tabata et al. hebben het gebruik van WSI in primaire pathologische diagnoses onderzocht19. Ze analyseerden achteraf 1070 WSI-specimens uit negen ziekenhuizen in Japan en bevestigden de validering van het gebruik van WSI in primaire diagnoses. Een van de belangrijkste voordelen van WSI is dat het gelijktijdige weergave van de dia's door meerdere studenten toestaat20. Daarom kan de validatie van afbeeldingen voor het scannen van hele dia's bijdragen aan de ontwikkeling van digitale diagnostiek voor educatieve en onderzoeksdoeleinden6,18,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project werd gesteund door de National Natural Foundation of China (nr. 81500151, 81400121, 81270607, 81541027 en 81501352) en de natuurlijke Stichting van de provincie Hubei (China) (nr. 2017CFB631). De auteurs uiten hun waardering voor Guo Qin, Chang min, Li Hui, en hun collega's bij Wuhan Google Biological Technology Co., LTD voor hun technische ondersteuning. De auteurs bedanken ook Mohammed Jamal voor de taal bewerking.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pannoramic MIDI | 3D HISTECH | Cat: PMIDI-040709 | An automated digital slide scanner with a remarkable feature set :12-slide capacity, fluorescence scanning, and many more. |
| QuantCenter | 3D HISTECH | Downloaded from the official website of the company | The framework for 3DHISTCH's image analysis applications. |
| LEICA RM2235 | Leica Microsystems | Cat: 14050038604 | The enhanced precision of the new accessories will add convenience to block to knife approach as well as specimen orientation. |
| Rabbit anti-human Anti-ZWINT antibody | Abcam | Cat: ab197794 | Immunohistochemical analysis of ZWINT in human lung tissue. |
| Anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Goodbio Technology | Cat:GB23303-1 | Secondary antibody for IHC staining. |
| Phosphate-buffered saline | Wuhan Goodbio Technology | Cat:G0002 | A solution containing a phosphate buffer. |
| OLYMPUS CX23 | OLYMPUS | Cat:6M87620 | Microscope for detection of H&E or IHC slides. |
| Dimethylbenzene | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent | Cat:1330-20-7 | A colorless, flammable fluid used as a solvent and clarifying agent in the preparation of tissue sections for microscopic study. |
| Hematoxylin Staining Solution | Wuhan Servicebio technology | Cat:G1039 | It is commonly used for histologic studies, oftern colors the nuclei of cells blue. |
| Tween 20 | Baitg | Cat:2005-64-5 | It is a polysorbate-type nonionic surfactant formed by the ethoxylation of sorbitan before the addition of lauric acid. It is used as a deterent and emulsifier in pharmacological applications. |
| Citric acid repair liquid | Wuhan Servicebio technology | Cat:G1202 | Is is used to repair antigen after fixation during IHC procedure. |
| LEICA ASP200s | Leica | Cat: 14048043626 | It was designed for routine and research histopathology of up to 200 cassettes. |
| LEICA Arcadia H | Leica | Cat: 14039354103 | It is a heated paraffin embedding station and allows for simple operation and precise control, resulting in improved quality, a smooth workflow and reliability. |
| LEICA Arcadia C | Leica | Cat: 14039354102 | It is a cold plate holding more than 60/65 cassettes on its large working surface. It was designed with an environment adaptive control module to make sure the operating temperature is always stabilized at -6°C. |
| CaseViewer Software | 3DHISTECH |
References
- Endo, H., Ikeda, K., Urano, T., Horie-Inoue, K., Inoue, S. Terf/TRIM17 stimulates degradation of kinetochore protein ZWINT and regulates cell proliferation. The Journal of Biochemistry. 151 (2), 139-144 (2012).
- Wang, H., et al. Human Zwint-1 specifies localization of Zeste White 10 to kinetochores and is essential for mitotic checkpoint signaling. Journal of Biological Chemistry. 279 (52), 54590-54598 (2004).
- Lin, Y. T., Chen, Y., Wu, G., Lee, W. H. Hec1 sequentially recruits Zwint-1 and ZW10 to kinetochores for faithful chromosome segregation and spindle checkpoint control. Oncogene. 25 (52), 6901-6914 (2006).
- Ying, H., et al. Overexpression of Zwint predicts poor prognosis and promotes the proliferation of hepatocellular carcinoma by regulating cell-cycle-related proteins. OncoTargets and Therapy. 11, 689-702 (2018).
- Yuan, W., et al. Bioinformatic analysis of prognostic value of ZW10 interacting protein in lung cancer. OncoTargets and Therapy. 11, 1683-1695 (2018).
- Higgins, C. Applications and challenges of digital pathology and whole slide imaging. Biotechnic & Histochemistry. 90 (5), 341-347 (2015).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
- Al-Janabi, S., Huisman, A., van Diest, P. J. Digital pathology: current status and future perspectives. Histopathology. 61 (1), 1-9 (2012).
- Bonomi, P. D., et al. Predictive biomarkers for response to EGFR-directed monoclonal antibodies for advanced squamous cell lung cancer. Annals of Oncology. 29 (8), 1701-1709 (2018).
- Villalobos, M., et al. ERCC1 assessment in upfront treatment with and without cisplatin-based chemotherapy in stage IIIB/IV non-squamous non-small cell. Medical Oncology. 35 (7), 106 (2018).
- Griffin, J., Treanor, D. Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back? Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).
- Huisman, A., Looijen, A., van den Brink, S. M., van Diest, P. J. Creation of a fully digital pathology slide archive by high-volume tissue slide scanning. Human Pathology. 41 (5), 751-775 (2010).
- Gray, A., Wright, A., Jackson, P., Hale, M., Treanor, D. Quantification of histochemical stains using whole slide imaging: development of a method and demonstration of its usefulness in laboratory quality control. Journal of Clinical Pathology. 68 (3), 192-199 (2015).
- Hofman, F. M., Taylor, C. R.
- Ramos-Vara, J. A.
- Otali, D., Fredenburgh, J., Oelschlager, D. K., Grizzle, W. E. A standard tissue as a control for histochemical and immunohistochemical staining. Biotechnic & Histochemistry. 91 (5), 309-326 (2016).
- Clarke, E. L., Treanor, D. Colour in digital pathology: a review. Histopathology. 70 (2), 153-163 (2017).
- Potts, S. J. Digital pathology in drug discovery and development: multisite integration. Drug Discovery Today. 14 (19-20), 935-941 (2009).
- Tabata, K., et al. Whole-slide imaging at primary pathological diagnosis: Validation of whole-slide imaging-based primary pathological diagnosis at twelve Japanese academic institutes. Pathology International. 67 (11), 547-554 (2017).
- Saco, A., Bombi, J. A., Garcia, A., Ramírez, J., Ordi, J. Current Status of Whole-Slide Imaging in Education. Pathobiology. 83 (2-3), 79-88 (2016).
- Griffin, J., Treanor, D. Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back? Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).
