Summary
ZW10相互作用蛋白(ZWINT)参与线粒主轴检查点和癌的发病机制。在这里,我们介绍了一种在人类肺癌组织中对ZWINT进行免疫染色的方法,然后对整个幻灯片进行数字扫描和图像分析。该方法可以提供高质量的数字图像和可靠的结果。
Abstract
本研究旨在介绍人体肺组织的免疫染色方法,然后进行全滑数字扫描和图像分析。数字扫描是扫描一叠幻灯片并生成高质量数字图像的快速方法。它可以产生与病理学家的传统光显微镜(CLM)一致的结果。此外,数字图像的可用性使得多人可以同时观察到同一张幻灯片。此外,幻灯片的数字图像可以存储在数据库中,这意味着玻璃幻灯片的长期恶化是可以避免的。此技术的局限性如下。首先,它需要高质量的制备组织和原始的免疫组织化学(IHC)幻灯片,没有任何损伤或过多的密封剂残留物。其次,肿瘤或非肿瘤区域应在使用软件进行分析之前由经验丰富的病理学家指定,以避免在评分过程中对肿瘤或非肿瘤区域产生任何混淆。第三,操作员需要在整个幻灯片成像过程中控制色彩再现。
Introduction
ZW10相互作用蛋白(ZWINT)是血吸管复合物的必要成分,它涉及线粒主轴检查点1,2,3。据报道,ZWINT的耗竭导致异常的过早染色体分离1,2,3。最近的研究表明,ZWINT通过促进肿瘤细胞4、5的增殖参与多种肿瘤的发病机制。我们之前曾报道过,ZWINT在肺癌5中过度表达。人们普遍认为,病理学家使用CLM分析幻灯片是费时费时的,而不是定量的6,7,8。 此外,存储的玻璃幻灯片的损坏可能使其无法收回以前创建的幻灯片。基于计算机的数字化全幻灯片成像(WSI)的新兴方法可以克服这些限制6,7,8。
为此,我们描述了人类肺癌组织中ZWINT免疫染色的方法,以及全幻灯片数字扫描和基于软件的图像分析。该方法的主要优点是与 CLM 产生一致的结果。该技术可广泛应用于血氧素-eosin染色(H&E)和IHC的病理评分、原位杂交(FISH)、组织微阵列(TMA)以及药物发现和开发等领域。
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Protocol
本文介绍的所有方法均已经武汉大学中南医院和武汉大学人民医院伦理委员会批准。
1. 准备 IHC 幻灯片
- 将人体肺组织片段(约3 x 3 cm)浸入磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的4%甲醛中,在室温(RT)下24小时,修复肺组织样本。
- 在室温下,分别在80%、95%和100%乙醇中脱水组织15分钟、20分钟和20分钟。最后,在室温下将组织浸入100%二甲苯3倍,每次20分钟。
- 对于嵌入,将组织浸入石蜡 (63 °C) 中 30 分钟,更换石蜡,再浸入组织 45 分钟。最后,再次更换石蜡,将组织浸入其中1小时。
- 使用旋转微体将组织切成 5 μm 厚的部分,并将其放置在 20 μg/mL 多-L-流膜涂层幻灯片上。
- 对于脱蜡,将幻灯片放入 65°C 烤箱中 2 小时,然后将部分浸入二甲基苯中 15 分钟,然后浸泡在 100% 二甲苯中 15 分钟。
- 在100%乙醇中用组织部分2x5min5min进行水合,然后用5分钟的连续稀释乙醇在95%乙醇中,在80%乙醇中使用5分钟,在70%乙醇中5分钟,在50%乙醇中进行5分钟的处理。
- 执行抗原修复。
- 稀释柠檬酸修复液(20x)至1倍,双蒸馏H2O(ddH2O)。
- 将带有组织部分和 1x 柠檬酸修复液 (300 mL) 的幻灯片放入抗原修复盒中,然后在微波炉中以高功率加热 2 分钟,然后以低功率加热以维持沸腾 6 分钟。
- 让部分自然冷却到室温。
- 用 0.01 M PBS 更换柠檬酸修复液,在室温下在旋转摇床中清洗 3x 部分,每次 5 分钟。
- 消除内源性过氧化物酶。
- 用 ddH2O 稀释 30% 的 H2O2到 3%,将其添加到幻灯片中(确保它覆盖所有组织),并在室温下在湿箱中孵育幻灯片 30 分钟。
注意:湿盒是一个10 x 15厘米的塑料盒,可以装水。 - 在室温下,用 0.01 M PBS 在旋转摇床中清洗幻灯片 3 次,每次 5 分钟。
- 用 ddH2O 稀释 30% 的 H2O2到 3%,将其添加到幻灯片中(确保它覆盖所有组织),并在室温下在湿箱中孵育幻灯片 30 分钟。
- 阻止非特异性抗原。
- 用0.1%补间20(PBST)将浓缩的正常山羊血清稀释至10%山羊血清。
- 将10%山羊血清加入幻灯片,在37°C的湿箱中孵育30分钟。
注意:山羊血清应覆盖幻灯片中的所有组织。
- 弄脏纸巾
- 在4°C过夜时用兔子抗人抗ZWINT抗体(1:50)孵育幻灯片。
- 在室温下,用 0.01 M PBST(1 mL 0.1% 的 1 mL T 0.1% 补间 20 分)在室温下将滑轨 3 次,每次清洗 5 分钟。
- 在37°C下用二级抗体(抗兔子检测系统,1:200)孵育幻灯片30分钟。
- 用 0.01 M PBST 在旋转摇床中清洗幻灯片 3 次,每次 5 分钟。
- 要可视化免疫染色,将幻灯片添加到 300 μL 的新鲜 3,3-二氨基苯胺,然后在室温下用自来水清洗幻灯片。
注意:染色程度在显微镜下监测(放大倍数10倍 - 40倍)。 - 反污组织。在室温下用血氧林染色溶液染色2分钟,然后用自来水清洗幻灯片15分钟。
注:原子核在显微镜下呈蓝色(放大倍数为10倍 - 40倍)。如果蓝色染色的程度更有效,可以使用盐酸醇分化3-5s,然后用自来水将组织回蓝色,15分钟,以方便组织突出染色。 - 在50%乙醇中脱水5分钟,在70%乙醇中脱水5分钟,在80%乙醇中脱水2次,在95%乙醇中脱水5分钟,在室温下,在100%乙醇中各脱水2次,每次5分钟。
- 为透明起见,将组织部分浸入含有 100% 二甲苯的罐中 15 分钟,并在室温下将部分转移到另一个含有 100% 二甲苯的罐中 15 分钟。
- 密封时,服用50-100μL中性口香糖,并在混合物中加入5%的二甲苯(避免在气泡中混合)。将上述混合物的15μL加入肺组织部分。用盖玻璃密封薄膜,然后轻轻将气泡压出。
2. IHC幻灯片的自动全幻灯片扫描
- 让密封的幻灯片在室温下干燥 12 小时,使其干燥。
- 手动选择"亮字段"选项并输入手动扫描界面。
- 修改幻灯片的名称并选择图像的存储路径。
- 设置扫描区域,并使用用户设置的阈值选择"扫描样本"选项。阈值约为 50,扫描区域扩展值为 200 μm。
- 设置扫描焦点值,自动选择焦点(范围从 1050 到 2650),最后选择单层模式。
- 在工作站上加载 IHC 幻灯片并启动自动扫描。
注意:确保幻灯片未损坏。保持滑片清洁和半透明,避免滑轨上残留灰尘、纸屑和过量密封剂残留物。玻璃滑块和盖玻片应没有标记。请勿用二甲苯清洁幻灯片。幻灯片的大小在表 1中给出。 - 以 20 倍、40 倍或 100 倍的放大倍率自动扫描幻灯片上的整个组织部分。
- 在全幻灯片扫描的末尾收集和存储图像。
3. 成像软件对幻灯片的分析
- 启动组织病理学图像分析软件并选择本地计算机。
- 打开存储扫描数据的文件。
- 从 2 倍到 40 倍选择适当的缩放级别。
- 调整颜色以通过"切换颜色调整"设置最佳对比度。
- 手动圈出并命名每个图像上感兴趣的部分。
注意:例如,您可以圈出一个区域并将其命名为肿瘤区域。 - 选择插件和QC。 此时,方案生成器弹出。
- 选择"密度量化"并调整检测栏。
注意:此过程应小心执行。蓝色容差条用于调整细胞核的颜色。棕色容差的条用于调整图像中填充颜色的饱和度。调整后的图像结果应与原始对应图像一致。 - 调整分数级别,使圆形区域的染色强度与原始图像相似。
注意:深棕色表示强正,棕色黄色表示中度正,浅黄色为弱正,白色为负。 - 将模型存储并命名为文件。将模型应用于其他幻灯片并选择"选定批注"。
- 让软件自动计算图像中圆圈区域的 H 得分。
4. 使用 H 评分系统9、10对分数进行量化
- 计算免疫染色百分比和染色强度(0:负,1+:弱,2+:中度,3+:强)。
- 使用评分系统(H-评分)计算肿瘤和相邻非肿瘤区域的病理评分。
注: H-分数 = (弱强度的单元格的百分比 x 1) = (中等强度的单元格的百分比 x 2) = (强度强的单元格的百分比 x 3)。因此,如果100%的细胞以强强度量化,则最大H得分为300。
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Representative Results
通过IHC,我们测量了28对非小细胞肺癌(NSCLC)标本(肿瘤和相邻非肿瘤组织)的ZWINT表达水平,包括14个鳞状细胞癌(SCC)和14个腺癌(ADC)。幻灯片全滑动数字扫描提供了高质量的数字图像(图1A)。结果表明,肺癌的H-评分明显高于相邻非癌组织(P<0.0001,双尾t-test)(图1A和1B)。此外,我们发现CCC中的ZWINT表达水平明显高于ADC(图1C)。
图 1:肺癌组织免疫组织化学染色。这个数字已由袁等人修改。5经鸽子出版社许可。(A) 这个面板显示肺癌患者的代表性免疫组织化学图像(放大倍数:10倍和40倍)。(B) 这个面板显示肺癌和邻近非癌组织的H-分数。(C) 此面板显示 ADC 和 ADC 的 H 得分。误差条指示标准偏差。• P < 0.05;P < 0.001.请点击此处查看此图的较大版本。
| 最小(毫米) | 最大(毫米) | |
| 宽度 | 25 | 26 |
| 长度 | 75 | 76 |
| 厚度 | 0.9 | 1.2 |
表 1:幻灯片大小。
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Discussion
全幻灯片扫描正成为一个热门话题,其强大的扫描和生产高品质的图像,用于临床和研究目的11,12,13。图像可以在11、12、13分钟之内通过滑动扫描显微镜产生。通过应用该方法,我们获得了ZWINT IHC幻灯片的高质量图像,并比较了肿瘤组织和非肿瘤组织的H-分数。在此介绍的协议中,最关键的步骤是制备高质量的IHC幻灯片,图像采集,以及肿瘤和非肿瘤区域的规范,在病理评分13,14,15,16.
与 CLM 相比,当前方法具有一些优点。数字扫描速度足够快(约 20 张幻灯片/小时),可以扫描一叠幻灯片并生成高质量的数字图像。它可以产生与 CLM 一致的结果,但花费的时间相对较少。数字图像的可用性使得多人可以同时观察到同一张幻灯片。幻灯片的数字图像可以存储在数据库中,这意味着玻璃幻灯片的长期恶化是可以避免的。
该技术的局限性包括需要高质量的组织和IHC幻灯片6,8,11和技术专业知识,以指定肿瘤或非肿瘤组织样本之前,使用成像软件进行分析,为了避免在评分6,7期间肿瘤或非肿瘤区域的任何混淆。操作员还需要在整个幻灯片成像17中监控整个数字化过程中的色彩再现。
该方法可积极应用于FISH、TMA和药物发现和开发6,18。塔巴塔等人已经调查了WSI在原发性病理诊断中的使用。他们追溯分析了来自日本9家医院的1070个WSI样本,并确认了WSI在原发诊断中的使用验证。WSI的主要优点之一是它允许多个学生同时观看幻灯片20。因此,整张扫描图像的验证可能有助于发展数字诊断,用于教育和研究目的6、18、21。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目得到了中国国家自然基金会(第81500151号、81400121号、81270607、81541027和81501352)和湖北省自然基金会(中国)(第2017CFB631号)的支持。作者对郭勤、常敏、李辉及其武汉谷歌生物科技有限公司同事的技术支持表示感谢。作者还感谢穆罕默德·贾迈勒的语言编辑。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pannoramic MIDI | 3D HISTECH | Cat: PMIDI-040709 | An automated digital slide scanner with a remarkable feature set :12-slide capacity, fluorescence scanning, and many more. |
| QuantCenter | 3D HISTECH | Downloaded from the official website of the company | The framework for 3DHISTCH's image analysis applications. |
| LEICA RM2235 | Leica Microsystems | Cat: 14050038604 | The enhanced precision of the new accessories will add convenience to block to knife approach as well as specimen orientation. |
| Rabbit anti-human Anti-ZWINT antibody | Abcam | Cat: ab197794 | Immunohistochemical analysis of ZWINT in human lung tissue. |
| Anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Goodbio Technology | Cat:GB23303-1 | Secondary antibody for IHC staining. |
| Phosphate-buffered saline | Wuhan Goodbio Technology | Cat:G0002 | A solution containing a phosphate buffer. |
| OLYMPUS CX23 | OLYMPUS | Cat:6M87620 | Microscope for detection of H&E or IHC slides. |
| Dimethylbenzene | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent | Cat:1330-20-7 | A colorless, flammable fluid used as a solvent and clarifying agent in the preparation of tissue sections for microscopic study. |
| Hematoxylin Staining Solution | Wuhan Servicebio technology | Cat:G1039 | It is commonly used for histologic studies, oftern colors the nuclei of cells blue. |
| Tween 20 | Baitg | Cat:2005-64-5 | It is a polysorbate-type nonionic surfactant formed by the ethoxylation of sorbitan before the addition of lauric acid. It is used as a deterent and emulsifier in pharmacological applications. |
| Citric acid repair liquid | Wuhan Servicebio technology | Cat:G1202 | Is is used to repair antigen after fixation during IHC procedure. |
| LEICA ASP200s | Leica | Cat: 14048043626 | It was designed for routine and research histopathology of up to 200 cassettes. |
| LEICA Arcadia H | Leica | Cat: 14039354103 | It is a heated paraffin embedding station and allows for simple operation and precise control, resulting in improved quality, a smooth workflow and reliability. |
| LEICA Arcadia C | Leica | Cat: 14039354102 | It is a cold plate holding more than 60/65 cassettes on its large working surface. It was designed with an environment adaptive control module to make sure the operating temperature is always stabilized at -6°C. |
| CaseViewer Software | 3DHISTECH |
References
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