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Biology

एलडीएल कोलेस्ट्रॉल सेल स्वास्थ्य की निगरानी के साथ लाइव सेल इमेजिंग विश्लेषण का उपयोग परख

Published: November 17, 2018 doi: 10.3791/58564
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 4, 4,5, 6, 1,2,7,8
1Interdisciplinary Stem Cell Institute, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiology, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 3Department of Molecular and Cellular Pharmacology, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 4Dr. John T. Macdonald Foundation Department of Human Genetics, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 5John P. Hussman Institute for Human Genomics, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 6Department of Medicine, Division of Endocrinology, Metabolism and Endocrinology and the Diabetes Research Institute, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 7Vascular Biology Institute, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 8Peggy and Harold Katz Family Drug Discovery Center, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल वास्तविक समय आमद विभिंन प्रकार के सेल में एक जीवित सेल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर दरों के साथ एलडीएल कोलेस्ट्रॉल को मापने के लिए एक कुशल दृष्टिकोण प्रदान करता है । यह तकनीक कोशिका आकृति विज्ञान और इसलिए संभावित cytotoxicity के लिए निगरानी करते हुए एलडीएल आमद को प्रभावित करने वाले यौगिकों की औषधीय गतिविधि को स्क्रीन करने के लिए एक मंच प्रदान करता है ।

Abstract

LDLR-मध्यस्थता endocytosis के माध्यम से एलडीएल कोलेस्ट्रॉल की अधिकता का विनियमन चयापचय विकार, हृदय रोग, और गुर्दे की बीमारी सहित विभिन्न प्रमुख विकृतियों में अध्ययन का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है । वर्तमान में, वहां कोई उपलब्ध विधि के लिए एलडीएल का आकलन करते हुए एक साथ कोशिकाओं के स्वास्थ्य के लिए निगरानी । वर्तमान अध्ययन एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, एक जीवित सेल इमेजिंग विश्लेषण प्रणाली का उपयोग कर, कोशिका स्वास्थ्य के लिए समवर्ती निगरानी के साथ एलडीएल आमद के धारावाहिक माप प्राप्त करने के लिए । इस उपंयास तकनीक तीन मानव कोशिका लाइनों (यकृत, गुर्दे ट्यूबलर उपकला, और कोरोनरी धमनी endothelial कोशिकाओं) में एक चार घंटे के समय पाठ्यक्रम पर परीक्षण किया है । इसके अलावा, इस तकनीक की संवेदनशीलता अच्छी तरह से जाना जाता है एलडीएल के साथ पुष्टि की है, Dynasore और रिकॉमबिनेंट PCSK9 प्रोटीन, के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक एलडीएल को बढ़ावा देने के द्वारा, Simvastatin । एक साथ ले लिया, इस विधि एक माध्यम से उच्च प्रवाह के लिए एक साथ औषधीय गतिविधि स्क्रीनिंग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल आकृति विज्ञान की निगरानी, इसलिए cytotoxicity के लिए एलडीएल आमद विनियमित यौगिकों प्रदान करता है । विश्लेषण अलग इमेजिंग प्रणालियों और विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

कम घनत्व लिपोप्रोटीन रिसेप्टर (LDLR)-मध्यस्थता एलडीएल endocytosis अध्ययन का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र के बाद से घूम रहा है एलडीएल कोलेस्ट्रॉल के स्तर हृदय रोग1के कोर में हैं, गुर्दे की बीमारी2 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भड़काऊ की एक किस्म 3 रोगों और कोलेस्ट्रॉल परिवहन जीन में उत्परिवर्तनों के साथ आनुवंशिक विकारों4,5,6,7। LDLR में अध्ययन-मध्यस्थता कोलेस्ट्रॉल आमद कई अनुसंधान उपकरण की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया है, रासायनिक Dynasore सहित Dynamin अवरोधकों के रूप में8,9,10, साथ ही एलडीएल-विनियमन प्रोटीन Convertase Subtilisin/Kexin प्रकार 9 (PCSK9)11,12.

एलडीएल-LDLR endocytosis मार्ग sequestering के साथ शुरू होता है एलडीएल LDLR परिसर में सेल की सतह पर clathrin-लेपित गड्ढ़े13। बुलबुले तो कक्ष के अंदर परिवहन के लिए रिक्तिकाएं में एलडीएल-LDLR परिसर internalizing कोशिका सतह झिल्ली के invagination द्वारा गठित कर रहे हैं । के रूप में गठित पुटिका जल्दी में परिपक्व और फिर देर endosomes, पीएच देर endosome के अंदर चला जाता है, इसके रिसेप्टर14से एलडीएल के कारण । अतीत में, एलडीएल आमद के ठहराव के तरीके रेडियो लेबल पर निर्भर १२५I-एलडीएल सह कोशिकाओं और ठहराव15के लिए कोशिकाओं से रेडियो लेबल वाले प्रोटीन के बाद निष्कर्षण के साथ मशीन । यह तो जैसे दिी-एलडीएल के रूप में फ्लोरोसेंट लेबल एलडीएल प्रोटीन के उपयोग की जगह थी, और बाद में immunostaining या फ्लोरोसेंट रीडिंग के लिए प्रोटीन की निकासी एक spectrophotometer या प्लेट रीडर15,16का उपयोग कर । फ्लोरोसेंट लेबल एलडीएल भी प्रतिदीप्ति में इस्तेमाल किया गया है सक्रिय कक्ष छंटाई (FACS) के internalization के विश्लेषण के लिए एलडीएल और सेल की सतह एलडीएल बाध्यकारी17। जबकि इन पद्धतियों के उपचार के बाद डेटा के संग्रह के लिए अनुमति देते हैं, उपचार के दौरान कोशिकाओं की व्यवहार्यता की निगरानी संभव नहीं है ।

देर endosome में अंलीय पीएच के उपयोग की अनुमति देता है एक पीएच-इस तरह के pHrodo लाल एलडीएल के रूप में फ्लोरोसेंट एलडीएल जांच सक्रिय है कि18internalization,19के बाद fluoresces । यह गुण लाइव कोशिकाओं में एलडीएल का लगातार मूल्यांकन करने के लिए एक निरंतर समय के पाठ्यक्रम के लिए अनुमति देता है । इसलिए, इस प्रोटोकॉल एक जीवित कोशिका विश्लेषण में pHrodo लाल-एलडीएल प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग करता है प्रश्नपत्र कोशिका स्वास्थ्य के लिए समवर्ती निगरानी के साथ एलडीएल को मापने के उपाय । परिणाम तीन अलग मानव कोशिका लाइनों, मानव यकृत कार्सिनोमा (HepG2) कोशिकाओं, मानव गुर्दे उपकला (HK2) कोशिकाओं और मानव कोरोनरी धमनी endothelial कोशिकाओं में एक चार घंटे का समय पाठ्यक्रम पर परीक्षण के रूप में इस उपंयास तकनीक की विश्वसनीयता का संकेत (HCAEC ). इन सेल लाइनों के लिए नैदानिक महत्वपूर्ण है एलडीएल मंजूरी20,21,22,23,24,25,26,27 , गुर्दे की बीमारी28,29,30,31, और हृदय रोग३२,३३, क्रमशः । एलडीएल आमद की निगरानी के अलावा, इस प्रोटोकॉल दो अच्छी तरह से ज्ञात एलडीएल के साथ इलाज शामिल हैं, Dynasore हाइड्रेट और रिकॉमबिनेंट PCSK9 प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से LDLR अभिव्यक्ति और एलडीएल के एक statin उत्प्रेरण, simvastatin । Dynasore और रिकॉमबिनेंट PCSK9 एक अलग रास्ते के माध्यम से काम करने के लिए एलडीएल को कम ।

Dynasore10 Dynamins का एक छोटा सा अणु अवरोध करनेवाला है और एलडीएल के clathrin-निर्भर endocytosis को अवरुद्ध करके एलडीएल को कम कर देता है-LDLR परिसर10,३४। रिकॉमबिनेंट PCSK9, दूसरी ओर, peptidase S8 परिवार के एक सदस्य है कि LDLR को बांधता है और आवश्यक गठन परिवर्तन अवरुद्ध द्वारा आंतरिक परिसर से एलडीएल जारी करने के बाद सेल सतह के लिए अपने रिसाइकिलिंग रोकता है३५,३६ . कम सेल सतह LDLR घनत्व अंततः कोशिका द्वारा कम एलडीएल आगे बढ़ जाता है । Statins, जबकि सीधे 3-hydroxy-3-methylglutaryl-कोएंजाइम (HMG-CoA) रिडक्टेस एंजाइम और इस प्रकार कोलेस्ट्रॉल के संश्लेषण को अवरुद्ध, भी25LDLR की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए जाना जाता है,३८ वृद्धि हुई एलडीएल आगे बढ़ाने के लिए अग्रणी । इस प्रोटोकॉल की संवेदनशीलता तीन नैदानिक प्रासंगिक मानव कोशिका लाइनों में एलडीएल आमद में महत्वपूर्ण कटौती का पता लगाने के द्वारा मान्य है, HK2, HepG2 और HCAECs, Dynasore और/या रिकॉमबिनेंट PCSK9 द्वारा, और HepG2 कोशिकाओं में एलडीएल में एक उल्लेखनीय वृद्धि कक्ष आकृति विज्ञान/स्वास्थ्य के लिए निगरानी के साथ चार घंटे का समय पाठ्यक्रम में Simvastatin । एक साथ ले लिया, इस विधि एक मध्यम करने के लिए उच्च प्रवाह के लिए समवर्ती औषधीय गतिविधि और लाइव कोशिकाओं में एलडीएल तेज विनियमित यौगिकों के cytotoxicity स्क्रीनिंग के लिए मंच प्रदान करता है ।

Protocol

1. एक 24-खैर प्लेट में कोशिकाओं सीडिंग

  1. कोशिकाओं से महाप्राण मीडिया, Dubelco के फॉस्फेट बफर खारा (dPBS) के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो, और dPBS महाप्राण । एक १०० mm डिश में HepG2 कोशिकाओं के लिए, ०.२५% Trypsin/EDTA के १.५ मिलीलीटर का उपयोग करें, और HK2 कोशिकाओं या HCAECs का उपयोग १.५ एमएल के ०.०५% Trypsin/EDTA समाधान कोशिकाओं को अलग करने के लिए ।
  2. 4 मिनट या जब तक कोशिकाओं अलग कर रहे है के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में थाली मशीन । dPBS कोशिकाओं के लिए HepG2 और HK2 या trypsin बेअसर समाधान के 3 मिलीलीटर, FBS प्लस 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (HCAEC) के लिए पूरा मीडिया के 3 मिलीलीटर जोड़ने के द्वारा एक 4 मिनट की मशीन के बाद trypsin बेअसर ।
  3. 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में कोशिकाओं स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए २५० x g पर केंद्रापसारक, मीडिया महाप्राण, और फिर से पूरा मीडिया में सेल गोली निलंबित ।
  4. सेल के झुरमुट को तोड़ने के लिए एक ४० माइक्रोन जाल छलनी के माध्यम से धीरे कक्ष निलंबन फ़िल्टर. छलनी के माध्यम से कोशिकाओं को न धोएं ।
  5. कोशिकाओं गिनती और एक अनुकूलित घनत्व पर उन्हें थाली. उदाहरण के लिए, ५,००० कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से HepG2 कोशिकाओं या HK2 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से १०,००० कोशिकाओं या एक 24-अच्छी तरह से प्लेट में HCAECs इष्टतम परिणामों के लिए नेतृत्व.
  6. ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर थाली गर्मी कोशिकाओं को संलग्न करने की अनुमति है ।
  7. अगले दिन, सेल मीडिया को सेल लाइन (FBS के बिना) के लिए आधार मीडिया को बदलने के अलावा 5% लाइपो-प्रोटीन की कमी सीरम (LPDS) या कम (2%) FBS मीडिया उपचार के आधार पर (१.७ देखें) । फिर, 24 ज के लिए जारी रखें गर्मी कोशिकाओं को भूखा । ५०० μL कुल मीडिया के प्रति अच्छी तरह से एक 24-well थाली में उपयोग करें ।
  8. तीन तरीकों में से एक में कोशिकाओं का इलाज: rPCSK9 (या वाहन) के 10 µ g/एमएल जोड़ें और 1 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन के लिए कोशिकाओं को वापस, Dynasore हाइड्रेट (या वाहन, Dimethyl Sulfoxide) के ४० µ मीटर जोड़ने और 10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन के लिए कोशिकाओं को वापस , या जोड़ें 1 µ m Simvastatin (या वाहन, Dimethyl Sulfoxide) और 12, 18 या 24 घंटे के लिए ३७ ° c मशीन के लिए कक्षों को वापस । rPCSK9 या Dynasore उपचार के लिए 5% LPDS के साथ मीडिया का उपयोग करें । कम का उपयोग करें (2%) FBS मीडिया या मीडिया के साथ 5% LPDS Simvastatin उपचार ।
    नोट: वांछित यौगिकों के साथ कोशिकाओं का इलाज दीर्घकालिक प्रयोगों के लिए लिपोप्रोटीन भुखमरी (चरण १.६) के लिए मीडिया परिवर्तन के समय में किया जा सकता है, या अल्पकालिक प्रयोगों के लिए विश्लेषण करने के लिए पहले. वैकल्पिक रूप से, अनुकूलित उपचार समय प्रकार और प्रयोगों के उद्देश्य के आधार पर चुना जा सकता है ।
  9. अगले, जोड़ें 5 µ pHrodo के एल लाल-बला एलडीएल (1 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक) के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 10 µ g/mL । फिर, ध्यान से कुओं से किसी भी बुलबुले को हटा दें ।

2. लाइव सेल विश्लेषण

  1. तुरंत लेबल एलडीएल जोड़ने के बाद, लाइव सेल विश्लेषण प्रणाली मशीन में थाली प्लेस ( सामग्री की तालिकादेखें) और थाली 15 मिनट के लिए equilibrate करने के लिए प्लेट में संघनित्र कम करने की अनुमति ।
  2. इस बीच, सॉफ्टवेयर खोलने के लिए और प्लेट पकड़े पोत जोड़कर स्कैन अनुसूची । छवि के प्रति अच्छी तरह से 16 छवियों 1 घंटे के अंतराल पर 4 घंटे के लिए लाल और चरण चैनलों का उपयोग कर के लिए 10x ।
  3. डेटा संसाधन के लिए उपयोग करने के लिए एक प्लेट मैप बनाएं ।
    1. गुण टैब पर क्लिक करें. प्लेट का नक्शाचुनें । इनपुट यौगिकों टैब में सेल प्रकार और उपचार ।
    2. क्षेत्र टैब पर क्लिक करें, प्रतिकृति के प्रत्येक सेट का चयन करें, और क्षेत्र के रूप में सहेजें ।

3. विश्लेषण पैरामीटर सेट करें

  1. एक प्रयोगात्मक रन पूरा हो गया है, एक बार कंप्यूटर को प्रशिक्षित करने के लिए प्रत्येक पैरामीटर गिनती सेट में शामिल करने के लिए सॉफ्टवेयर में एक छवि सेट बनाएँ ।
    1. सॉफ़्टवेयर में, प्लेट दृश्य खोलें, फिर विश्लेषण कार्य उपयोगिताओं बॉक्स में बनाएँ या छवि संग्रह में जोड़ेंचुनें ।
    2. नए छवि संग्रहका चयन करें, छवि संग्रह के लिए एक नाम लिखें, और चैनलों के बगल में बक्से की जाँच करके लाल और चरण चैनल चुनें.
    3. 5 और छवियों का चयन करें और वर्तमान छवि संग्रह करने के लिए जोड़कर छवि संग्रह में जोड़ें ।
  2. कक्षों के लिए कोई संसाधन परिभाषा बनाएं । तालिका 1 इस एलडीएल आमद प्रोटोकॉल के लिए HepG2, HK2, और HCAE सेल प्रोसेसिंग परिभाषाओं के लिए पैरामीटर्स शामिल हैं ।
    1. विश्लेषण कार्य उपयोगिताओं बॉक्स में, नई संसाधन परिभाषाचुनें । ड्रॉप डाउन मेनू से चरण 2.1.2 में नाम का छवि संग्रह चुनें । तालिका 1से कक्षों के प्रकार के लिए पैरामीटर्स इनपुट करें ।
    2. पूर्वावलोकन बॉक्समें, सभी पूर्वावलोकनका चयन करने के लिए ड्रॉप डाउन मेनू का उपयोग करें ।
    3. विश्लेषण मास्क बॉक्स में, संसाधन परिभाषा के लिए विश्लेषण में शामिल क्षेत्र को देखने के लिए संगम मास्क और लाल ऑब्जेक्ट मास्क बक्सों की जांच करें । चित्र 1देखें ।
    4. छवि संग्रह के माध्यम से स्क्रॉल कोशिकाओं और एलडीएल सुनिश्चित करने के लिए मुखौटा में शामिल हैं । फ़ाइल का चयन करें और संसाधन परिभाषा सहेजें ।
  3. प्रयोगात्मक भागो से छवियों के सेट का विश्लेषण ।
    1. थाली दृश्य में प्रयोग खोलें । विश्लेषण कार्य उपयोगिताओं बॉक्स में, नए विश्लेषण कार्य लॉंचकरें चुनें । सहेजी गई संसाधन परिभाषा का चयन करें ।
    2. विश्लेषण कार्य का नाम, विश्लेषण के लिए समय श्रेणी चुनें, और विश्लेषण करने के लिए प्रायोगिक कुओं को हाइलाइट करें. लॉंच बटन क्लिक करें ।

4. विश्लेषण और डेटा प्रोसेसिंग

  1. विश्लेषण कार्य पूर्ण होने के बाद, डेटा निर्यात करें:
    1. पूर्ण विश्लेषण और प्रेस दृश्यका चयन करें । उपयोगिताएं मेनू में, मीट्रिक/ग्राफ निर्यातचुनें ।
    2. क्षेत्र मेनू में, सभी कुओंका चयन करें, और समूह मेनू में, कुओं के प्रत्येक सेट के लिए मतलब मूल्यों को प्राप्त करने के लिए एक समूह के रूप में चुनें दोहराने और प्रत्येक अच्छी तरह से कोई भीचुनने के लिए व्यक्तिगत मूल्यों के निर्यात के लिए ।
    3. लाल ऑब्जेक्ट मीट्रिक मेनू में, कुल लाल ऑब्जेक्ट एकीकृत तीव्रता (̈रकू x µm2/image)चुनें । यह पैरामीटर लाल सिग्नल तीव्रता (̈रकू में) बार लाल सिग्नल (µm2में) के क्षेत्र में सभी छवियों में एक अच्छी तरह से, जो कोशिकाओं द्वारा कुल एलडीएल के अनुरूप से मेल खाती है का योग इंगित करता है ।
    4. डेटा निर्यात बटन क्लिक करें । तोड़ डेटा व्यक्तिगत छवियों में नीचेकी जांच करें । डेटा स्वचालित रूप से एक क्लिपबोर्ड पर प्रतिलिपि बनाई है और एक नई स्प्रेडशीट फ़ाइल को चिपकाया जा सकता है ।
    5. चरण ऑब्जेक्ट मैट्रिक मेनू में, संगम (प्रतिशत)चुनें. तोड़ डेटा व्यक्तिगत छवियों में नीचेकी जांच करें । डेटा निर्यात बटन क्लिक करें । डेटा स्वचालित रूप से एक क्लिपबोर्ड पर की नकल की है और स्प्रेडशीट फ़ाइल कुल लाल वस्तु एकीकृत तीव्रता डेटा युक्त करने के लिए कॉपी किया जा सकता है ।
    6. प्रतिशत संगम का रूपांतरण निम्न समीकरण के साथ कुल क्षेत्र पर लागू करें.

      कुल चरण क्षेत्र (µm2/image) = संगम (%) × (छवि ऊंचाई (पिक्सल) × संकल्प) × (छवि चौड़ाई (पिक्सल) × संकल्प)

      नोट: संगम (%) पैरामीटर प्रति छवि चरण क्षेत्र का प्रतिशत संगम इंगित करता है जो प्रत्येक कुआं में कक्षों के क्षेत्र के संगत होता है । इस मीट्रिक को एक बार निर्यात किए जाने पर प्रत्येक व्यक्तिगत छवि के लिए कुल चरण क्षेत्र में परिवर्तित किया जाना चाहिए. चरण चैनल के लिए छवि विनिर्देशों (छवि ऊंचाई, चौड़ाई और संकल्प) प्रत्येक प्रयोगात्मक पोत के लिए उपरोक्त सूत्र के साथ इस्तेमाल किया जा करने के लिए छवि चैनलोंके तहत पोत संपत्तियों की चर्चा करते हुए पाया जा सकता है ।
    7. कुल चरण क्षेत्र में समग्र लाल वस्तु एकीकृत तीव्रता के रूप में 4.1.6 में गणना के रूप में प्रत्येक व्यक्ति छवि के लिए निंनलिखित सूत्र का उपयोग कर कुओं के पार कोशिका घनत्व में परिवर्तनशीलता को समाप्त करने के लिए ।
      1. कुल लाल वस्तु एकीकृत तीव्रता (̈रकू एक्स µm2/image) प्रत्येक छवि के मूल्यों के अपने इसी कुल चरण क्षेत्र (µm2/image) से विभाजित करने के लिए एलडीएल (̈रकू) छवि प्रति मूल्यों प्राप्त करते हैं ।
      2. तो, औसत एलडीएल (̈रकू) एक अच्छी तरह से प्रत्येक के सभी छवियों के डेटा को एक अच्छी तरह से और फिर औसत एलडीएल सभी कुओं की प्रतिकृति के मूल्यों को प्राप्त करने के लिए समूह का मतलब है की नकल करने के लिए एलडीएल में ले औसत प्राप्त करने के लिए । इन आंकड़ों को अंतिम एलडीएल अधिक मूल्यों रहे है और चित्रण और सांख्यिकीय विकल्प के सॉफ्टवेयर का उपयोग विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Representative Results

लाइव सेल इमेजिंग तीन मानव कोशिका लाइनों में कोलेस्ट्रॉल आमद अध्ययन के दौरान सेल स्वास्थ्य की विश्वसनीय निगरानी के लिए अनुमति देता है
हम तीन मानव कोशिका लाइनों में जो कोलेस्ट्रॉल homeostasis विनियमन मानव यकृत कार्सिनोमा (HepG2) कोशिकाओं, मानव गुर्दे उपकला (HK2) कोशिकाओं, और मानव कोरोनरी धमनी endothelial कोशिकाओं सहित एक प्रमुख pathophysiological भूमिका निभाता है में हमारे परख मान्य (HCAECs) । हम एक जीवित सेल इमेजिंग प्रणाली का इस्तेमाल किया 1 एच अंतराल पर सीरियल माप के साथ एक 4 घंटे के समय पाठ्यक्रम में एलडीएल को बेहतर परख प्रदर्शन । हमारे परिणाम संकेत मिलता है कि सभी सेल प्रकार का परीक्षण इस नई तकनीक के साथ संगत थे और घटता में परिणाम अंतिम समापन बिंदु (चित्रा 2) के रूप में ४.३३ ज के साथ आमद अध्ययन की अवधि के लिए निरंतर एलडीएल का संकेत है । चित्र 2 में दिखाया गया तांता डेटा कुल pHrodo लाल लेबल वाले एलडीएल प्रतिदीप्ति (कुल लाल वस्तु प्रति छवि ̈रकू एक्स µ m2/छवि) में कुल सेल क्षेत्र के लिए एक अच्छी तरह से प्रत्येक छवि (चरण वस्तु क्षेत्र में छवि प्रति µ में) को सामान्य करके प्राप्त किया गया एम2/image) कुओं के पार कोशिका घनत्व में परिवर्तनशीलता को समाप्त करने के लिए । इसके अलावा, स्क्रीनिंग के प्रयोजन के लिए एलडीएल भाटा परख की संवेदनशीलता को मांय करने के लिए एलडीएल कोलेस्ट्रॉल को प्रभावित करने यौगिकों, हम दो सकारात्मक ज्ञात करने के लिए एलडीएल तांता, Dynasore और rPCSK9, और एक सकारात्मक नियंत्रण के लिए एलडीएल प्रेरित ज्ञात नियंत्रित करता था Simvastatin । के रूप में हमारे परिणामों द्वारा मान्य, Dynasore और rPCSK9 के साथ उपचार के बाद, सभी तीन मानव कोशिका लाइनों का परीक्षण (HepG2, HK2 और HCAEC) एक 4 घंटे से अधिक एलडीएल आमद में महत्वपूर्ण कटौती से पता चला पाठ्यक्रम (चित्रा 2ए सी). उदाहरण के लिए, चित्रा 2एक से पता चलता है कि एलडीएल आमद HepG2 कोशिकाओं में समय पाठ्यक्रम पर Dynasore के उपचार के साथ कम है, DMSO के साथ इलाज किया कोशिकाओं की तुलना में; जबकि Dynasore नियंत्रण के लिए वाहन नियंत्रण के रूप में DMSO के अनुपचारित नियंत्रण समूह की तुलना में एलडीएल आमद पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव था । इसके अलावा, हमारे निष्कर्षों Simvastatin (चित्रा 3) के साथ उपचार के बाद HepG2 कोशिकाओं द्वारा एलडीएल को आगे बढ़ाने में एक उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई, इस पद्धति की संवेदनशीलता का समर्थन करने के लिए एलडीएल आमद में महत्वपूर्ण परिवर्तन का पता लगाने । के बारे में ४.५ ज समय बिंदु है, जो एलडीएल में एक ठेठ समय बिंदु है अध्ययन, एलडीएल आमद या तो Dynasore या rPCSK9 उपचार के साथ काफी कम है, और Simvastatin उपचार (चित्रा 4) द्वारा वृद्धि हुई है ।

एक प्रमुख लाभ के लिए लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग करने के लिए एलडीएल ऊपर अध्ययन है कि इस प्रणाली की कोशिकाओं के वास्तविक समय छवियों को प्रदान करता है प्रत्येक अच्छी तरह से जांच की यौगिकों के संभावित cytotoxicity पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । आंकड़े 5-7 एक दृश्य संदर्भ के रूप में नेट एलडीएल आमद के लिए प्रारंभिक समय बिंदु (०.३३ ज) और अंतिम समापन बिंदु (४.३३ h) पर जांच की तीन सेल लाइनों के प्रतिनिधि छवियों का वर्णन । छवियों Dynasore या rPCSK9 उपचार निम्नलिखित कोशिकाओं की सामान्य आकृति विज्ञान की पुष्टि, दोनों प्रभावशीलता और इन यौगिकों की सुरक्षा का संकेत.

लाइव सेल विश्लेषण विभिन्न उपचार के साथ विश्वसनीय धारावाहिक मात्रात्मक कोलेस्ट्रॉल आमद माप देता है

एक लाइव सेल इमेजिंग प्रणाली के साथ इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने का एक प्रमुख लाभ के लिए समय पाठ्यक्रम भर में डेटा इकट्ठा करने की क्षमता है और कई समय अंकों में एलडीएल आमद की तुलना में बजाय सिर्फ एक अंतिम समय बिंदु के रूप में परंपरागत रूप से किया । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, हम टर्मिनल समय बिंदु पर प्रतिशत reductionin एलडीएल आमद की गणना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से समय पाठ्यक्रम भर में 1 घंटे के अंतराल पर कर रहे हैं । तालिका 2 में एलडीएल आमद में कमी को संक्षेप में प्रस्तुत करता है तीन परीक्षण मानव कोशिका लाइनों के बाद 10 मिनट पूर्व उपचार के साथ ४० µ m Dynasore या 1 h पूर्व उपचार के साथ 10 µ g/mL rPCSK9. अंतिम अध्ययन समाप्ति बिंदु के रूप में ४.३३ ज पर, ४० µ मीटर में Dynasore के साथ उपचार काफी HepG2 कोशिकाओं में एलडीएल आमद कम, HK2 कोशिकाओं और HCAECs ५३%, ६८% और ५४%, क्रमशः (तालिका 2a-सी) और rPCSK9 के साथ उपचार पर 10 µ g/मिलीलीटर में एलडीएल में ५५% की कमी के परिणामस्वरूप HK2 कोशिकाओं (टेबल बी)में आमद । पारंपरिक परख के रूप में टर्मिनल समय बिंदु को बढ़ाता है के अलावा, हम एक प्रयोग के समय बिंदु पर उपचार के कारण एलडीएल आमद की कमी में एक मात्रात्मक विश्लेषण करने में सक्षम हैं । उदाहरण के लिए, तालिका बी + HK2 कोशिकाओं में rPCSK9 के साथ कि उपचार से पता चलता है एलडीएल की कमी के परिणामस्वरूप ७९% से १.३३ एच, ६७% पर २.३३ एच, ५९% पर ३.३३% अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में इलाज । इस प्रोटोकॉल उपचार के बाद एलडीएल आमद के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक विश्वसनीय विधि प्रदान करता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : परिभाषा मास्क संसाधित कर रहा है । HK2 कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों ( तालिका 1में विस्तृत) उपयुक्त प्रसंस्करण परिभाषा के आवेदन के बाद चित्रित कर रहे हैं. मास्किंग के बिना areHK2 कोशिकाओं दिखाया (A), चरण Maskapplied के साथ (B), लागू किया गया लाल ऑब्जेक्ट मास्क के साथ (C), या दोनों चरण और लाल ऑब्जेक्ट मास्क लागू (D) के साथ. स्केल बार = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : एलडीएल में कमी एक ४.३३ ज समय पाठ्यक्रम पर लाइव सेल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर । लाइव सेल विश्लेषण प्रणाली मानव यकृत कार्सिनोमा (HEPG2) कोशिकाओं (ए), मानव गुर्दे ट्यूबलर उपकला (HK2) कोशिकाओं (ख), और मानव कोरोनरी धमनी endothelial (HCAE) कोशिकाओं (सी) में एलडीएल आमद को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है । कोशिकाओं Dynasore (चलाने से पहले 10 मिनट) या rPCSK9 सकारात्मक नियंत्रण के रूप में (चलाने से पहले 1 एच) के साथ इलाज किया गया । DMSO Dynasore उपचार के लिए एक वाहन के रूप में इस्तेमाल किया गया था । सकारात्मक नियंत्रण काफी सभी 3 सेल लाइनों में एलडीएल आमद में कमी आई । कुल चरण ऑब्जेक्ट क्षेत्र (µm2/image) के लिए कुल लाल ऑब्जेक्ट एकीकृत तीव्रता (rcux µm2/image) को सामान्य करके एलडीएल इकडे मान प्राप्त किए गए. डेटा मतलब ± SEM. N = 6 कुओं/ डेटा 2 या 3 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. दो-तरफा ANOVA का उपयोग करके p < ०.०००१ बनाम रिक्त, और # # # #p < ०.०००१ vs DMSO । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . एक 4.33 एच समय पाठ्यक्रम पर लाइव सेल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर एलडीएल में वृद्धि । लाइव सेल विश्लेषण प्रणाली मानव यकृत कार्सिनोमा (HEPG2) कोशिकाओं में एलडीएल आमद को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है । एलडीएल आगे काफी Simvastatin के साथ उपचार के बाद 12 ज (ए), 18 ज (ख), या 24 (सी) एच 2% FBS युक्त मीडिया का उपयोग कर के लिए वृद्धि हुई है । 24 घंटे का समय बिंदु भी 5% LPDS (बिना FBS) युक्त मीडिया के साथ किया गया था । DMSO नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । एलडीएल भाटा मूल्यों कुल चरण वस्तु क्षेत्र (µm2/image) को समग्र लाल वस्तु एकीकृत तीव्रता (̈रकू एक्स µm2/image) सामांय द्वारा प्राप्त किए गए । डेटा मतलब ± SEM. N = 6 कुओं/ डेटा एक स्वतंत्र प्रयोग के प्रतिनिधि हैं । p < ०.०००१ vs DMSO, Student ' s t-test का उपयोग करते हुए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . ४.३ h समय बिंदु पर एलडीएल को कम करने वाले एजेंटों द्वारा महत्वपूर्ण एलडीएल आमद में कमी । एलडीएल आमद मानव यकृत कार्सिनोमा (HepG2) कोशिकाओं में काफी कम है (क), मानव गुर्दे ट्यूबलर उपकला (HK2) कोशिकाओं (ख), और मानव कोरोनरी धमनी endothelial (HCAE) कोशिकाओं (ग) एलडीएल के साथ उपचार के बाद 1 घंटे के लिए 10 मिनट या rPCSK9 के लिए अवरोधकों Dynasore । एलडीएल आमद स्पष्ट रूप से 12, 18 या 24 एच उपचार (डी) के बाद HepG2 कोशिकाओं में Simvastatin द्वारा वृद्धि हुई है । डेटा मतलब ± SEM. N = 6 कुओं/ डेटा 2 या 3 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. दो-तरफा ANOVA का उपयोग करके p < ०.०००१ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 . एलडीएल को कम करके hepatocellular कार्सिनोमा (HepG2) कोशिकाओं में कम एलडीएल आमद एजेंट, Dynasore । चरण वस्तु और HepG2 कोशिकाओं के लिए लाल वस्तु के प्रतिनिधि छवियों ०.३३ ज (बाएं पैनलों) और ४.३३ h समापन बिंदु (सही पैनल) कोशिकाओं की स्वस्थ स्थिति दिखाने में चित्रित कर रहे हैं । ४० µ एम Dynasore, एलडीएल कोलेस्ट्रॉल को कम करने के लिए जाना जाता है, सकारात्मक नियंत्रण (सी) के रूप में इस्तेमाल किया गया था । छवियां 10x आवर्धन पर ले जाया गया । स्केल बार = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6 . एलडीएल को कम करने के द्वारा मानव गुर्दे ट्यूबलर उपकला (HK2) कोशिकाओं में एलडीएल तांता कम एजेंटों, Dynasore और rPCSK9 । चरण वस्तु और HK2 कोशिकाओं के लिए लाल वस्तु के प्रतिनिधि छवियों ०.३३ ज में चित्रित (बाएं पैनलों) और ४.३३ h समापन बिंदु (सही पैनल) कोशिकाओं की स्वस्थ स्थिति दिखाते हैं । ४० µ m Dynasore (C), या 10 µ g/एमएल rPCSK9 (D), एलडीएल कोलेस्ट्रॉल को कम करने के लिए जाना जाता है, सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । छवियां 10x आवर्धन पर लिया जाता है । स्केल बार = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7 . एलडीएल को कम करने से मानव कोरोनरी धमनी endothelial कोशिकाओं (HCAECs) में एलडीएल तांता घटा-कम एजेंट, Dynasore । HCAECs के लिए चरण वस्तु और लाल वस्तु के प्रतिनिधि छवियां ०.३३ ज (बाएं पैनलों) और ४.३३ एच समापन बिंदु (सही पैनलों) में चित्रित कोशिकाओं की स्वस्थ स्थिति दिखाते हैं । ४० µ एम Dynasore, एलडीएल कोलेस्ट्रॉल को कम करने के लिए जाना जाता है, सकारात्मक नियंत्रण (सी) के रूप में इस्तेमाल किया गया था । छवियां 10x आवर्धन पर ले जाया गया । स्केल बार = १०० µm. Data मतलब ± SEM. N = 6 कुओं/ डेटा 2 या 3 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Table 1
तालिका 1: परिभाषा पैरामीटर्स संसाधित कर रहा है । इन पैरामीटर्स को इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए विश्लेषण सिस्टम के लिए विशिष्ट हैं । पैरामीटर लाल चैनल और चरण चैनल में कक्ष के क्षेत्र में लाल क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए सेट अप किया जाना चाहिए । HepG2, HK2, HCAE कक्ष रेखाओं के लिए पैरामीटर सेटिंग्स प्रस्तुत की गई हैं ।

Table 2
तालिका 2: HepG2, HK2 और HCAE कोशिकाओं में एलडीएल आमद में प्रतिशत परिवर्तन ४.३ ज पर Dynasore, rPCSK9, या Simvastatin के साथ इलाज किया । (A) HepG2 कक्ष, (B) HK2 कक्ष, (C) HCAE कक्ष, और (D) HepG2 कक्ष ।

Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम विभिन्न मानव कोशिका लाइनों में एक समय पाठ्यक्रम पर वास्तविक समय एलडीएल को मापने के लिए एक नया और अधिक प्रभावी विधि के रूप में लाइव सेल इमेजिंग के उपयोग को प्रदर्शित करता है । मानव यकृत कार्सिनोमा (HepG2) कोशिकाओं को आमतौर पर अध्ययन में प्रयोग किया जाता है कोलेस्ट्रॉल कम करने वाली चिकित्सीय चिकित्सा के लिए स्क्रीनिंग21,22,23,24,25,26, ३९,४०. इसलिए, हम एलडीएल आमद अध्ययन के लिए एक जीवित सेल इमेजिंग प्रणाली की क्षमता के परीक्षण के लिए इस सेल प्रकार चुना । हमारे परिणाम से संकेत मिलता है कि HepG2 कोशिकाओं को इस नई तकनीक के साथ संगत कर रहे है और एक अवग्रह में परिणाम की तरह वक्र के लिए तांता परख की अवधि के लिए सतत एलडीएल का संकेत अंतिम समापन बिंदु के रूप में ४.३३ ज (चित्रा 2a और चित्रा 3 ).

कोलेस्ट्रोल homeostasis विभिन्न nephropathies के pathophysiology में प्रमुख भूमिका निभाता है । वास्तव में, गुर्दे के ऊतकों में कोलेस्ट्रॉल संचय गुर्दे फाइब्रोसिस क्रोनिक गुर्दे की बीमारी के लिए अग्रणी करने के लिए एक प्रमुख योगदानकर्ता है और विभिन्न nephropathies28,29,30,31में एक प्रमुख विकृति है । इसलिए, हम नेफ्रोलॉजी के क्षेत्र में उपयोग एक लोकप्रिय और विश्वसनीय सेल लाइन के रूप में मानव गुर्दे उपकला (HK2) कोशिकाओं में हमारे विधि की जांच की । हमारे डेटा भी HK2 कोशिकाओं में एलडीएल आमद को मापने के लिए लाइव सेल इमेजिंग प्रणाली की व्यवहार्यता का समर्थन किया । जैसा कि चित्रा 2बीमें दिखाया गया है, HK2 कोशिकाओं का तांता अध्ययन की अवधि (4 घंटे) में एलडीएल कोलेस्ट्रॉल रैखिक लिया ।

atherosclerosis के विकास और प्रगति में कोलेस्ट्रॉल चयापचय के महत्व के कारण३२,३३,४१, हृदय रोग का प्रमुख कारण है, जो बारी में संख्या-एक हत्यारा दुनिया भर में है ४२, हम एक atherosclerosis-प्रासंगिक कक्ष प्रकार में हमारी पद्धति को मांय करने के उद्देश्य से । हम मानव कोरोनरी धमनी Endothelial कोशिकाओं (HCAECs) का इस्तेमाल किया, के रूप में इन पहले कोशिका प्रकार में से एक एक atherosclerosis रोगी की कोरोनरी धमनी लुमेन में एक कोलेस्ट्रॉल अपमान करने के लिए उजागर हो रहे हैं । हमारे डेटा चित्रा 2सी में दिखाया गया है कि इस एलडीएल फ्लक्स विधि भी प्रभावी ढंग से HCAECs के साथ काम करता है । परिणामी ग्राफ एक अवग्रह की तरह वक्र HepG2 कोशिकाओं के समान है ।

को वैधता और स्क्रीनिंग के लिए यह सुधार एलडीएल भाटा परख की संवेदनशीलता परीक्षण यौगिकों को प्रभावित करने के लिए एलडीएल कोलेस्ट्रॉल, हम तीन नियंत्रण, एलडीएल का उपयोग कम एजेंटों Dynasore और rPCSK9, और एलडीएल आमद उत्प्रेरक Simvastatin । यहां, हम Dynasore या rPCSK9 के अनुकूलित सांद्रता के साथ उपर्युक्त सेल लाइनों (HepG2, HK2 और HCAECs) का इलाज किया तांता परख करने से पहले । हमारे परिणामों से पता चला कि सभी तीन परीक्षण सेल लाइनों एक 4 घंटे के समय पाठ्यक्रम (चित्रा 2) पर एलडीएल आमद में महत्वपूर्ण कटौती के साथ उपचार के लिए जवाब दिया । उदाहरण के लिए, अंतिम समय बिंदु के रूप में ४.३३ ज पर, ४० µ मीटर में Dynasore के साथ उपचार काफी HepG2 कोशिकाओं में एलडीएल आमद कम, HK2 कोशिकाओं और HCAECs ५३%, ६८% और ५४%, क्रमशः (पी < 0.0001; चित्रा 2 A-c और Table 2a-c). इसके अलावा, rPCSK9 पर 10 µ g/mL के कारण HK2 कोशिकाओं में एलडीएल आमद में एक चिन्हित ५५% की कमी आई (p < 0.0001; चित्रा 2 B और तालिकाबी) । इसके अलावा, हमारे निष्कर्षों से पता चला कि Simvastatin के साथ HepG2 कोशिकाओं के इलाज में एलडीएल (चित्रा 3) में एक उल्लेखनीय वृद्धि के परिणामस्वरूप, इस पद्धति की संवेदनशीलता का समर्थन करने के लिए एलडीएल आमद में महत्वपूर्ण परिवर्तन का पता लगाने । HepG2 और HCAEC कोशिकाओं में rPCSK9 के साथ उपचार के अध्ययन के रूप में rPCSK9 अच्छी तरह से प्रलेखित परिणाम के साथ एक अतिरिक्त नियंत्रण उपचार के रूप में प्रयोग किया जाता है इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं हैं, लेकिन कम मात्रा में खरीदने के लिए महंगा है । इसलिए rPCSK9 केवल HK2 कक्षों में इस प्रोटोकॉल को मांय करने के लिए उपयोग किया गया था ।

लाइव सेल इमेजिंग विश्लेषण, साथ कार्यात्मक और समय पर एलडीएल आमद के मापन, स्वास्थ्य और कोशिकाओं की आकृति विज्ञान की सतत निगरानी के लिए अनुमति दी । यह लाभ कुशलतापूर्वक लागू यौगिकों की संभावित cytotoxicity का पता लगा सकता है, इस विधि को एक साथ औषधीय गतिविधि और cytotoxicity की निगरानी के लिए एक आदर्श तकनीक बना रही है । आंकड़े 5-7 अंतिम समापन बिंदु पर तीन परीक्षण कक्ष लाइनों के प्रतिनिधि छवियों का वर्णन (४.३३ एच) नेट एलडीएल आमद पर उपचार के प्रभाव के लिए एक दृश्य संदर्भ के रूप में और भी परीक्षण के बाद कोशिकाओं की स्वस्थ आकृति विज्ञान से पता चलता है उपचार. हम एक अच्छी तरह से सभी छवियों के दृश्य निरीक्षण की सिफारिश करने के लिए अध्ययन की अवधि के लिए कोशिकाओं की हीथ आकृति विज्ञान आश्वासन । उदाहरण के लिए, डेटा में नहीं दिखाया गया है, जब HepG2 कोशिकाओं की छवियों ८० माइक्रोन Dynasore के साथ इलाज का निरीक्षण किया गया, हम कोशिकाओं के किनारों के रूप में सेल टुकड़ी के संकेत मनाया बंद थाली उठाने के लिए दिखाई दिया, के उच्च सांद्रता पर सेल टुकड़ी का सुझाव Dynasore । इसके अलावा, simvastatin (3-10 माइक्रोन) के उच्च सांद्रता भी statins४५की उच्च खुराक के लिए रिपोर्ट के रूप में प्रेरित apoptosis का संकेत करने के लिए परिवर्तित आकृति विज्ञान का नेतृत्व किया. इस प्रोटोकॉल के लिए 20-80 माइक्रोन पर Dynasore उपचार के एक अनुमापन प्रदर्शन किया गया था, और 0.5 में Simvastatin-10 माइक्रोन एकाग्रता, जो सेल छवियों के बाद कोशिकाओं के स्वास्थ्य का विश्लेषण और उपचार के संभावित ctotoxicity निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया विभिंन सांद्रता । परिणाम Dyansore के लिए ४० माइक्रोन और इष्टतम सांद्रता के रूप में simvastatin के लिए 1 माइक्रोन के उपयोग का सुझाव दिया ।

अंत में, हम एक सेल घनत्व अनुमापन अध्ययन करने का सुझाव अगर एक और सेल लाइन के लिए इस विधि के साथ परीक्षण के लिए अच्छी तरह से प्रति इष्टतम सेल संख्या अनुरूप परिणाम प्राप्त करने की पहचान है । हमारे सेल घनत्व अनुकूलन अध्ययन से पता चला है कि १०,००० कोशिकाओं में एक 24 अच्छी तरह से प्लेट HK2 और HCAE कोशिकाओं के लिए लगातार एलडीएल आमद परिणामों के लिए नेतृत्व में/ यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि इस एलडीएल तांता परख लाइव सेल इमेजिंग प्रणाली, गैर-धाराप्रवाह कोशिकाओं के एक monolayer के समान रूप से कुओं पर वितरित का उपयोग करने के लिए अंतिम सामान्यीकृत एलडीएल आमद मूल्यों में त्रुटियों को जंम दे सकता है । इस के लिए कारण है कि आमद डेटा के सामान्यीकरण के लिए, चरण वस्तु क्षेत्र कोशिका घनत्व का एक उपाय के रूप में प्रयोग किया जाता है और सेल के झुरमुट का गठन कर रहे हैं जब इस पैरामीटर प्रतिकूल रूप से प्रभावित किया जा सकता है. हमने देखा है कि HepG2 कोशिकाओं के झुरमुट के रूप में एक प्रवृत्ति है जब घनत्व से अधिक ५,००० कोशिकाओं में वरीयता प्राप्त/ इसलिए, हम HepG2 कोशिकाओं के लिए इष्टतम घनत्व के रूप में एक 24 अच्छी तरह से थाली में प्रति अच्छी तरह से ५,००० कोशिकाओं का इस्तेमाल किया ।

सामूहिक रूप से, हमारी विधि औषधीय गतिविधि और एलडीएल प्रवाह को विनियमित यौगिकों के cytotoxicity स्क्रीनिंग के लिए एक माध्यम से उच्च प्रवाह मंच प्रदान करता है समवर्ती । इस विधि आसानी से अंय फ्लोरोसेंट-लेबल लाइगैंडों कि lysosomal डिब्बे में प्रवेश के लिए वास्तविक समय में ligand का मूल्यांकन के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । हालांकि इस प्रोटोकॉल InCucyte लाइव इमेजिंग और विश्लेषण प्रणाली के लिए विनिर्देशों प्रदान करता है, प्रोटोकॉल ऐसे Cellomics के रूप में वैकल्पिक इमेजिंग प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

यह काम लास के लिए निंनलिखित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया: राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R56HL132209 और 1R01HL140468) और मियामी हार्ट रिसर्च इंस्टीट्यूट । KY अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन डॉक्टरेट फैलोशिप (18PRE33960070) के एक प्राप्तकर्ता है । HepG2 सेल कृपया डॉ Emmanuel थॉमस, मियामी विश्वविद्यालय के मिलर स्कूल ऑफ मेडिसिन४६,४७,४८द्वारा प्रदान की गई ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pHrodo Red-LDL ThermoFisher Scientific L34356
HepG2 cells E. Thomas Lab, U. Miami HB-8065
MEM Sigma M0325
Sodium Pyruvate Sigma P5280
L-Glutamine 200 mM solution Sigma G7513
FBS Atlas Biologicals FP-0500-A
HK2 cells ATCC CRL-2190
Keratinocyte SFM media kit Gibco 17005-042
Primary Coronary Artery Endothelial Cells ATCC PCS-100-020
Vascular Cell Basal Medium ATCC PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-VEGF ATCC PCS-100-041
Human Lipoprotein Deficient Serum Millipore LP4
PBS Sigma D8537
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056
Trypsin-EDTA (0.05%) Gemini Bio-Products 400-150
Trypsin Neutralizing Solution ATCC PCS-999-004
24 well plate Falcon 353226
40 μM mesh cell strainer VWR 10199-654
15 mL conical tubes VWR 89039-666
50 mL conical tubes VWR 89039-658
Trypan Blue Staining (0.4%) Life Technologies T10282
Counting Slides Bio-Rad 145-0011
Incucyte Zoom Sartorius Zoom Imaging and analysis platform
Dynasore Hydrate Sigma D7693
PCSK9 Recombinant Protein Cayman Chemicals 20631

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References

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जीव विज्ञान अंक १४१ कम घनत्व लिपोप्रोटीन LDLR एलडीएल लोंढे एलडीएल लो Dynasore Simvastatin रिकॉमबिनेंट PCSK9 dynamin रक्तदाब कोलेस्ट्रोल atherosclerosis.
एलडीएल कोलेस्ट्रॉल सेल स्वास्थ्य की निगरानी के साथ लाइव सेल इमेजिंग विश्लेषण का उपयोग परख
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Ritter, P., Yousefi, K., Ramirez, J., Dykxhoorn, D. M., Mendez, A. J., Shehadeh, L. A. LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring. J. Vis. Exp. (141), e58564, doi:10.3791/58564 (2018).

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