Summary
Denne protokollen gir en effektiv tilnærming til måling LDL Kolesterol opptak med sanntid tilstrømningen priser ved bruk av en levende celle imaging system i ulike celletyper. Denne teknikken gir en plattform til skjermen farmakologiske aktiviteten av stoffer påvirker LDL tilstrømningen under overvåking av cellen morfologi og dermed potensielle cytotoksisitet.
Abstract
Regulering av LDL Kolesterol opptak gjennom LDLR-mediert endocytose er et viktig område av studiet i ulike store patologi inkludert stoffskiftesykdom, hjerte-og karsykdommer og nyresykdom. Aktuelle, finnes det ingen tilgjengelig metode å vurdere LDL opptak mens samtidig overvåking for helse av cellene. Denne studien presenterer en protokoll, ved hjelp av en levende celle tenkelig analysesystem for å skaffe føljetong målinger av LDL tilstrømningen med samtidige overvåking for celle helse. Denne teknikken er testet i tre humane cellelinjer (lever, nyre rørformede epitel og coronary arterien endotelceller) over en fire-timers kurs. Videre er følsomheten på denne teknikken validert med kjente LDL opptak hemmere, Dynasore og rekombinant PCSK9 protein, samt av en LDL opptak arrangøren, Simvastatin. Samlet gir denne metoden en middels til høy gjennomstrømming plattform samtidig screening farmakologisk aktivitet, samt overvåking av cellen morfologi, derav cytotoksisitet forbindelser regulere LDL tilstrømningen. Analysen kan brukes med forskjellige imaging-systemer og analytisk programvare.
Introduction
Lav tetthet Lipoprotein reseptoren LDLR-mediert LDL endocytose er et viktig område av studiet siden sirkulerende LDL kolesterol nivåer er i kjernen av hjerte-og karsykdommer1, nyre sykdom2 samt en rekke inflammatorisk sykdommer3 og genetiske lidelser mutasjoner i kolesterol transport gener4,5,6,7. Studier i LDLR-mediert kolesterol tilstrømningen har ført til identifikasjon av flere forskningsverktøy, for eksempel Dynamin hemmere inkludert den kjemiske Dynasore8,9,10, samt LDL-regulere proteiner som Proprotein konvertasene Subtilisin/Kexin skriver 9 (PCSK9)11,12.
LDL-LDLR endocytose veien begynner med sequestering LDL-LDLR komplekset på celleoverflaten til clathrin-belagt groper13. Blemmer blir da dannet av invagination i cellemembranen for overflate som introvert LDL-LDLR komplekset i vacuoles transport i cellen. Som dannet vesicle modnes i tidlige og deretter sene endosomes, drops pH inne det sen endosome, forårsaker tilknytningene til LDL fra sin reseptor14. Tidligere avhengig metoder for kvantifisering av LDL tilstrømningen av radio-merket 125-LDL co inkubasjon celler og påfølgende utvinning av radio-merket protein fra celler for kvantifisering15. Dette ble så erstattet av bruk av fluorescently merket LDL proteiner som DiI-LDL, og etterfølgende immunostai- eller utvinning av protein for fluorescerende avlesninger med et spektrofotometer eller plate leser15,16. Fluorescently merket er LDL også brukt i fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) for analyse av internalization LDL og celle overflaten LDL bindende17. Mens disse metodene tillater samling data etter behandling, er overvåke levedyktigheten til cellene under behandling ikke mulig.
Surt pH i slutten endosome tillater bruk av en pH-aktivert fluorescerende LDL sonde som pHrodo rød LDL som fluoresces etter internalisering18,19. Denne egenskapen gir en sammenhengende tid selvfølgelig LDL opptak vurdering i levende celler. Derfor utnytter denne protokollen pHrodo Red-LDL fluorescens imaging i en levende celle analyse til serielt mål LDL opptak med samtidige overvåking for celle helse. Resultatene tyder påliteligheten av denne teknikken som testet over en fire-timers kurs i tre forskjellige humane cellelinjer, menneskelige nedsatt carcinoma (HepG2) celler, menneskelige nyre (HK2) epitelceller og menneskelige koronar arteriell endotelceller (HCAEC ). Disse linjer er klinisk signifikant til LDL klaring20,21,22,23,24,25,26,27 , nyre sykdom28,29,30,31og hjertesykdommer32,33, henholdsvis. I tillegg til overvåking LDL tilstrømningen, innlemmer denne protokollen behandling med to kjente LDL opptak hemmere, Dynasore hydrat og rekombinant PCSK9 protein samt et statin induser av LDLR uttrykk og LDL opptak, simvastatin. Dynasore og rekombinant PCSK9 hver arbeid gjennom ulike stier å redusere LDL opptak.
Dynasore er et lite molekyl hemmer Dynamins10 , og reduserer LDL opptak ved å blokkere clathrin-avhengige endocytose av LDL-LDLR komplekse10,34. Rekombinant PCSK9, derimot, er medlem av peptidase S8 familie som binder seg til LDLR og hemmer dens resirkulering til celleoverflaten etter frigir LDL fra internalisert komplekset blokkerer nødvendige conformational endringene35,36 . Redusert cellen overflaten LDLR tetthet fører til slutt til redusert LDL opptak av cellen. Statiner, kjent mens direkte blokkerer 3-hydroxy-3-methylglutaryl-koenzym (HMG-CoA) reduktase enzymet og dermed kolesterol biosyntesen, også for å upregulate uttrykk for LDLR25,38 fører til økt LDL opptak. Følsomhetsnivået til denne protokollen valideres av oppdager betydelige reduksjoner i LDL tilstrømning av tre klinisk relevante humane cellelinjer, HK2, HepG2 og HCAECs, Dynasore og/eller rekombinant PCSK9, og en markant økning LDL opptak i HepG2 celler av Simvastatin i en fire-timers kurs med overvåking av cellen morfologi/helse. Samlet gir denne metoden en middels til høy gjennomstrømming plattform for samtidig screening farmakologisk aktivitet og cytotoksisitet forbindelser regulere LDL opptak i live celler.
Protocol
1. seeding celler i en 24-vel Plate
- Sug opp media av cellene, vaske cellene med 5 mL av Dubelcos fosfat bufret saltvann (dPBS) og Sug opp dPBS. HepG2 celler i en 100 mm parabol, bruke 1,5 mL 0,25% Trypsin/EDTA, og for HK2 celler eller HCAECs bruke 1,5 mL 0,05% Trypsin/EDTA løsning for å koble cellene.
- Inkuber platen i en 37 ° C inkubator i 4 minutter eller til cellene, kobles. Nøytralisere trypsin etter en 4 minutters inkubasjon ved å legge til 3 mL komplett for HepG2 og HK2 eller 3 mL trypsin nøytralisere løsning, dPBS pluss 5% fosterets bovin serum (FBS), for HCAEC celler.
- Overføre cellene til 15 mL konisk rør og sentrifuge 250 x g i 5 min, Sug opp media, og å suspendere celle pellet i komplett.
- Filtrere celle suspensjon forsiktig gjennom en 40 μm mesh sil å bryte opp cellen klumper. Ikke vask cellene gjennom silen.
- Telle celler og tallerkenen dem på en optimalisert tetthet. For eksempel føre 5000 celler per brønn av HepG2 celler eller 10.000 celler per brønn av HK2 celler eller HCAECs i en 24-vel plate til optimale resultater.
- Inkuber platen overnatting på 37 ° C at cellene å feste.
- Neste dag, endre cellen media vil media for cellen linje (uten FBS) pluss 5% Lipo Protein mangelfull Serum (LPDS) eller lav (2%) FBS media avhengig av behandling (se 1.7). Fortsett inkubasjon 24 h å sulte cellene. Bruke 500 μL totalt medier per brønn i en 24-vel plate.
- Behandle cellene i én av tre måter: legge til 10 µg/mL av rPCSK9 (eller kjøretøy) og returnere cellene til 37 ° C inkubator for 1 time, legger 40 µM Dynasore hydrat (eller kjøretøy, Dimethyl Sulfoxide) og returnere cellene til 37 ° C inkubator minutter , eller legge til 1 µM Simvastatin (eller kjøretøy, Dimethyl Sulfoxide) og returnere cellene til 37 ° C inkubator for 12, 18 eller 24 timer. Bruke medier med 5% LPDS for rPCSK9 eller Dynasore behandlinger. Bruk lav (2%) FBS media eller media med 5% LPDS Simvastatin behandlinger.
Merk: Behandle cellene med ønsket forbindelser kan gjøres på tidspunktet for media for lipoprotein sult (trinn 1.6) for langsiktig eksperimenter eller før analysen for kortsiktige eksperimenter. Tilpasset behandlingstider kan også velges basert på typen og formålet med eksperimenter. - Deretter legger til 5 µL av pHrodo rød-merket LDL (1 mg/mL stock) hver brønn å få en endelig konsentrasjon av 10 µg/mL. Deretter forsiktig fjerne bobler fra brønnene.
2. levende celle analyse
- Umiddelbart etter tilføyer merket LDL, Plasser platen i levende celle analyse system inkubator (se Tabell for materiale) og la platen til equilibrate i 15 minutter å redusere kondens i platen.
- I mellomtiden, åpne programvaren og planlegge søket ved å legge fartøyet holde platen. Bilde 16 bilder per brønn i timen intervaller på 10 X 4 timer med rød og fase kanalene.
- Opprette kart Plate bruke for databehandling.
- Klikk kategorien Egenskaper Velg Plate kart. Angi celle type og behandlinger i forbindelser -kategorien.
- Klikk på regioner -kategorien, merker et sett av replikat og lagre som områder.
3. Sett opp parametere for forretningsanalyse
- Når en eksperimentell kjøre er fullført, kan du opprette et bilde satt i programvaren til lære datamaskinen å kvantifisere hver parameter inkludert i teller.
- Åpne visningen plate i programvaren og velg Opprett eller Legg til bildesamlingeni boksen Analyse jobb verktøy .
- Velg Ny bildesamlingen, navngi bildesamlingen og velger rødt og fase kanalene ved merke av i boksen ved siden av kanalene.
- Velg 5 flere bilder og legge til bildesamlingen ved å legge til i gjeldende bildesamlingen.
- Opprette en behandling definisjon for cellene. Tabell 1 inneholder parametere for HepG2, HK2 og HCAE cellen behandling definisjoner for denne LDL tilstrømningen protokollen.
- Velg Ny behandling definisjoni boksen Analyse jobb verktøy . Velg bildesamlingen i trinn 2.1.2 fra rullegardinmenyen. Angi parameterne for typen celler fra tabell 1.
- Bruk rullegardinmenyen til å velge Forhåndsvisning allei forhåndsvisningsboksen.
- I boksen Analyse maske sjekk Samløpet maske og boksene Red objektet maske for å vise området inkludert i analysen for behandling definisjonen. Se figur 1.
- Bla gjennom bildesamlingen å sikre celler og LDL inkluderes i masken. Velg filen og Lagre behandling definisjonen.
- Analyser bilder fra experimental kjøre.
- Åpne eksperimentet i plate visning. Velg Innlede ny analyse jobbi boksen Analyse jobb verktøy . Velg lagrede behandling definisjonen.
- Navnet analyse jobben, velge tidsintervallet for analyse, og markere eksperimentelle brønnene analysere. Klikker du Start .
4. analyser og databehandling
- Når analyse jobben er fullført, kan du eksportere dataene:
- Velg fullført analysen og trykk visning. På verktøy -menyen, velg Metrisk/graf eksportere.
- I regioner -menyen, velger Alle brønnene, på gruppe -menyen for å få mener verdiene for hvert sett med brønner som gruppe velger replikerer og for eksport av de enkelte verdiene for hver brønn velger ingen.
- I Red objektet beregning -menyen velger du Total Red objektet integrert intensitet (RCU x µm2/image). Denne parameteren angir summen av røde signalet intensitet (i RCU) ganger området av røde signalet (i µm2) i alle bildene over hver brønn, som tilsvarer totalt LDL opptaket av cellene.
- Velg knappen For dataeksport . Sjekk bryte dataene ned i enkeltbilder. Dataene kopieres automatisk på en tavle, og kan limes til en ny regnearkfil.
- I fase objektet beregning -menyen velger du samløpet (prosent). Sjekk bryte dataene ned i enkeltbilder. Velg knappen For dataeksport . Dataene kopieres automatisk på en tavle, og kan kopieres til en regnearkfil som inneholder totalt Red objektet integrert intensitet data.
- Konvertering av prosent samløpet gjelde areal med denne formelen.
Totalt fase området (µm2/image) = samløpet (%) × (bildehøyde (piksler) × Resolution) × (bredde (piksler) × Resolution)
Merk: parameteren samløpet (%) viser prosent samløpet av området fase per bilde som samsvarer med delen av cellene i hver brønn. Denne beregningen skal konverteres til totalt fase område for hver enkelt bilde når eksportert. Image-spesifikasjonene for fase kanal (bildehøyde, bredde og oppløsning) brukes med ovenfor formelen for hver eksperimentelle fartøy kan finnes ved å henvise til Fartøyet egenskaper under Bildet kanaler. - Normalisere totale Red objektet integrert intensitet til Total fase området som beregnet 4.1.6 bruker følgende formel for hvert enkelt bilde for å eliminere variasjon i cellen tetthet over brønnene.
- Del totalt Red objektet integrert (RCU x µm2/image) intensitetsverdiene for hvert bilde av det tilsvarende Fase areal (µm2/image) å få LDL opptak (RCU) verdier per bilde.
- Deretter gjennomsnittlig LDL opptak (RCU) data til alle bilder av hver brønn skaffer gjennomsnittlig LDL opptaket i hver brønn og deretter finne LDL opptak verdiene av alle Repliker hente gruppe betyr. Disse dataene er LDL opptak sluttverdiene og kan brukes for illustrasjon og statistisk analyse ved hjelp av programvaren til valg.
Representative Results
Live celle Imaging tillater pålitelige overvåking av Cell Helse under kolesterol tilstrømningen studier i tre humane cellelinjer
Vi validert analysen vår i tre humane cellelinjer i hvilke kolesterol homeostase regulering spiller en stor patofysiologiske rolle, inkludert menneskelige nedsatt carcinoma (HepG2) celler, menneskelige nyre (HK2) epitelceller og menneskelige koronar endotelceller (HCAECs). Vi brukte en levende celle tenkelig system for å utføre opptaksanalyse LDL i en 4 h klokkeslett kurs med føljetong mål på 1t intervaller. Våre resultater indikerer at alle celletyper testet var kompatible med denne nye teknikken og resultatet i kurver viser kontinuerlig LDL opptak for varigheten av tilstrømningen studien med 4.33 h som siste sluttpunktet (figur 2). Tilstrømningen dataene i figur 2 ble oppnådd ved å normalisere den totale pHrodo Red-merket LDL fluorescens (totalt røde objektet integrert intensitet per bilde i RCU x µm2/bilde) til total-celle området i hvert bilde av hver brønn (fase objektområdet per bilde i μ m2avbildningsbane) å eliminere variasjon i cellen tetthet over brønnene. Videre for å validere sensitiviteten av LDL tilstrømningen analysen for screening forbindelser påvirker LDL Kolesterol opptak, brukte vi to positiv kontroller kjent for å hemme LDL tilstrømningen, Dynasore og rPCSK9, og en positiv kontroll kjent å indusere LDL opptak, Simvastatin. Som godkjent av våre resultater, etter behandling med Dynasore og rPCSK9, testet alle tre humane cellelinjer (HepG2, HK2 og HCAEC) viste betydelige reduksjoner i LDL tilstrømningen en 4 h klokkeslett løpet (figur 2Vekselstrøm). Figur 2A viser for eksempel at LDL tilstrømningen er redusert i HepG2 celler med behandling av Dynasore gjennom tid, sammenlignet med cellene behandlet med DMSO; mens DMSO som kontrollen kjøretøy for Dynasore kontroll hadde ingen signifikant effekt på LDL strøm sammenlignet med ubehandlet kontrollgruppen. Videre våre funn viste en markant økning i LDL opptak av HepG2 celler etter behandling med Simvastatin (Figur 3), støtter følsomhetsnivået til denne metoden å oppdage viktige endringer i LDL tilstrømningen. Om tidspunktet 4.5 h, som er en typisk tidspunkt i LDL opptak studier, er LDL tilstrømningen betydelig redusert med enten Dynasore eller rPCSK9 og økt med Simvastatin behandling (Figur 4).
En stor fordel å bruke levende celle imaging for LDL opptak studier er at dette systemet gir sanntid bilder av cellene i hver brønn som kan brukes til å overvåke mulige cytotoksisitet av undersøkt forbindelser. Tallene 5-7 illustrerer representant bilder av de tre linjene undersøkt på første punkt (0,33 h) og endelige endepunkt (4.33 h) som en visuell referanse for netto LDL tilstrømningen. Bildene bekrefter normal morfologi av cellene etter Dynasore eller rPCSK9 behandlinger, som viser både effektiviteten og sikkerheten til disse forbindelsene.
Levende celle analyse gir pålitelig føljetong kvantitative kolesterol tilstrømningen målinger med ulike behandlinger
En stor fordel med å bruke denne protokollen med en levende celle tenkelig system er muligheten til å samle inn data gjennom tid og sammenligne LDL tilstrømningen flere tidspunkt i stedet for bare ett siste punkt som tradisjonelt gjort. Bruker denne protokollen, er vi i stand til å beregne prosent reductionin LDL tilstrømningen på terminal tidspunktet og 1t mellomrom gjennom tiden. Tabell 2 oppsummerer reduksjon i LDL tilstrømning av tre testet humane cellelinjer etter 10 min forbehandling med 40 µM Dynasore eller 1t pre-behandling med 10 µg/mL rPCSK9. 4.33 h som endepunktet siste studie, behandling med Dynasore på 40 µM betydelig redusert LDL tilstrømningen i HepG2 celler og HK2 celler HCAECs 53%, 68% og 54%, henholdsvis (Tabell 2A-C) og behandling med rPCSK9 på 10 µg/mL resultert i 55% reduksjon i LDL tilstrømning av HK2 celler (tabell 2B). I tillegg til kvantifisere terminal tidspunktet som tradisjonelle analyser, er vi i stand til å utføre en kvantitativ analyse i reduksjon av LDL tilstrømningen på grunn av behandling på hvert punkt av eksperimentet. Tabellen 2B viser for eksempel at behandling med rPCSK9 i HK2 celler resultert i en reduksjon av LDL opptak av 79% på 1,33 h, 67% på 2,33 h, 59% på 3,33 t legge behandling sammenlignet med ubehandlet celler. Denne protokollen gir en pålitelig metode for kvantitativ analyse av LDL tilstrømningen etter behandling.
Figur 1 : Behandling definisjon maske. Representant bilder av HK2 celler er avbildet etter anvendelsen av riktig behandling definisjonen (beskrevet i tabell 1). Vises areHK2 celler uten maskering (A), med fasen Maskapplied (B), Red objektet maske brukt (C) eller både fase og røde objekt masker brukt (D). Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Redusert LDL opptak bruker live celle tenkelig system en 4.33 h klokkeslett løpet. Live celle analyse systemet brukes til å måle LDL tilstrømning av menneskelig nedsatt carcinoma (HEPG2) celler (A), menneskelige nyre rørformede (HK2) epitelceller (B) og menneskelige koronar (HCAE) endotelceller (C). Cellene ble behandlet med Dynasore (10 min før oppløpet) eller rPCSK9 (1 time før oppløpet) som positive kontroller. DMSO ble brukt som et redskap for Dynasore behandlinger. Positiv kontroller betydelig redusert LDL tilstrømningen i alle 3 linjer. LDL tilstrømningen verdier ble oppnådd ved å normalisere totale røde objektet integrert intensiteten (RCUxµm2/image) totalt fase området (µm2/image). Dataene er mean±SEM. N = 6 brønner/gruppe. Dataene er representant for 2 eller 3 uavhengige eksperimenter. p < 0,0001 vs tom, og ###p < 0,0001 vs DMSO med toveis VARIANSANALYSE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Økning i LDL opptak med levende celle tenkelig system en 4.33h klokkeslett løpet. Live celle analyse systemet brukes til å måle LDL tilstrømning av menneskelig nedsatt carcinoma (HEPG2) celler. LDL opptak er betydelig økt etter behandling med Simvastatin for 12 h (en), 18 h (B) eller 24 h (C) bruke mediet som inneholder 2% FBS. 24 h tidspunktet ble også fremført med mediet som inneholder 5% LPDS (uten FBS). DMSO ble brukt som negativ kontroll. LDL tilstrømningen verdier ble oppnådd ved å normalisere totale røde objektet integrert intensiteten (RCU x µm2/image) totalt fase området (µm2/image). Dataene er mean±SEM. N = 6 brønner/gruppe. Dataene er representant for et uavhengig eksperiment. p < 0,0001 vs DMSO bruke Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Betydelig LDL tilstrømningen reduksjon av LDL opptak-senkende medikamenter på 4,3 h tidspunkt. LDL tilstrømningen er betydelig redusert i menneskelig nedsatt carcinoma (HepG2) celler (A), menneskelige nyre rørformede (HK2) epitelceller (B) og menneskelige koronar (HCAE) endotelceller (C) etter behandling med LDL opptak hemmere Dynasore for 10 min eller rPCSK9 i 1 time. LDL tilstrømningen økes markert med Simvastatin i HepG2 celler etter 12, 18 eller 24 h behandlinger (D). Dataene er mean±SEM. N = 6 brønner/gruppe. Dataene er representant for 2 eller 3 uavhengige eksperimenter. p < 0,0001 med toveis VARIANSANALYSE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Redusert LDL tilstrømning av hepatocellulært karsinom (HepG2) celler av LDL opptak-senking agent, Dynasore. Representant bilder av fase objektet og røde objekt for HepG2 celler er avbildet på 0,33 h (venstre panel) og 4.33 h sluttpunktet (høyre panel) viser statusen OK celler. 40 µM Dynasore, kjent for å redusere LDL-Kolesterol opptak, ble brukt som positive kontroll (C). Bildene ble tatt på 10 X forstørrelse. Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Redusert LDL tilstrømning av menneskelig nyre rørformede (HK2) epitelceller LDL opptak-senkende medikamenter, Dynasore og rPCSK9. Representant bilder av fase objektet og røde objekt for HK2 celler avbildet på 0,33 h (venstre panel) og 4.33 h sluttpunktet (høyre panel) viser statusen OK cellene. 40 µM Dynasore (C), eller 10 µg/mL rPCSK9 (D), kjent for å redusere LDL Kolesterol opptak, ble brukt som positiv. Bildene er tatt på 10 X forstørrelse. Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 . Redusert LDL tilstrømning av menneskelig koronar endotelceller (HCAECs) av LDL opptak-senking agent, Dynasore. Representant bilder av fase objektet og røde objekt for HCAECs avbildet på 0,33 h (venstre panel) og 4.33 h sluttpunktet (høyre panel) viser statusen OK cellene. 40 µM Dynasore, kjent for å redusere LDL-Kolesterol opptak, ble brukt som positive kontroll (C). Bildene ble tatt på 10 X forstørrelse. Skala bar = 100 µm. Data er mean±SEM. N = 6 brønner/gruppe. Dataene er representant for 2 eller 3 uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: behandle definisjon parametere. Disse parameterne er spesifikke for analyse systemet brukes i denne protokollen. Parametere bør settes opp til å analysere rød i den røde kanalen og området til cellen i fase kanalen. Parameterinnstillingene for HepG2, HK2, HCAE cellelinjer presenteres.
Tabell 2: prosentendring i LDL tilstrømning av HepG2, HK2 og HCAE-cellene behandlet med Dynasore, rPCSK9 eller Simvastatin på 4,3 h. (A) HepG2 celler, (B) HK2 celler, (C) HCAE celler, og (D) HepG2 celler.
Discussion
I gjeldende protokollen viser vi utnyttelsen av levende celle imaging som en ny og mer effektiv metode for å måle sanntid LDL opptak en gang løpet i ulike humane cellelinjer. Menneskelige nedsatt carcinoma (HepG2) celler blir ofte brukt i studier screening for kolesterolsenkende therapeutics21,22,23,24,25,26, 39,40. Derfor valgte vi dette celle type for å teste funksjonaliteten til en levende celle tenkelig system for LDL tilstrømningen studier. Våre resultater viser at HepG2 celler er kompatibel med denne nye teknikken og resultere i en sigmoid-lignende kurve som angir kontinuerlig LDL opptak for varigheten av tilstrømningen analysen til 4.33 h som siste sluttpunktet (figur 2A og Figur 3 ).
Kolesterol homeostase spiller en viktig rolle i Patofysiologien ved ulike nephropathies. Faktisk kolesterol akkumulering i nyre vev er en stor bidragsyter til nyre fibrose fører til kronisk nyresykdom og er en stor patologi i ulike nephropathies28,29,30,31. Derfor, undersøkte vi vår metode i menneskelig nyre (HK2) epitelceller som en populær og pålitelig cellen linje benyttes innen nephrology. Våre data også støttet muligheten av levende celle tenkelig system for å måle LDL tilstrømning av HK2 celler. Som vist i figur 2B, tok HK2 celler LDL Kolesterol lineært gjennom hele tilstrømningen studien (4 timer).
På grunn av viktigheten av kolesterol stoffskiftet i utvikling og progresjon av aterosklerose32,33,41, den ledende årsaken til hjerte sykdom, som igjen er den fremste killer verdensomspennende 42, vi som mål å validere vår metode i en aterosklerose relevante celle type. Vi brukte menneskelige koronar Arterial endotelceller (HCAECs), da disse er en av de første celletyper utsettes et kolesterol fornærmelse i koronar lumen av en aterosklerose pasient. Våre data vises i figur 2C indikerer at denne LDL tilstrømningen metoden også fungerer effektivt med HCAECs. Resulterende grafen er en sigmoid-lignende kurve lik som HepG2 celler.
For å teste gyldigheten og følsomhet for denne forbedret LDL tilstrømningen analysen for screening forbindelser påvirker LDL-Kolesterol opptak, brukte vi tre kontroller, LDL opptak-senkende medikamenter Dynasore og rPCSK9 og LDL tilstrømningen aktivator Simvastatin. Her vi behandlet ovenfor nevnte linjer (HepG2, HK2 og HCAECs) med optimalisert konsentrasjoner av Dynasore eller rPCSK9 før tilstrømningen analysen. Resultatene viste at alle tre testet cellelinjer svarte på behandlinger med betydelige reduksjoner i LDL tilstrømningen over en 4-timers kurs (figur 2). For eksempel, på 4.33 h som siste gang, behandling med Dynasore på 40 µM betydelig redusert LDL tilstrømningen i HepG2 celler og HK2 celler HCAECs 53%, 68% og 54%, henholdsvis (p < 0,0001; Figur 2 A-C og Tabellen 2A-C). I tillegg rPCSK9 på 10 µg/mL forårsaket en markert 55% reduksjon i LDL tilstrømning av HK2 celler (p < 0,0001; Figur 2 B og tabellen 2B). Dessuten viste våre funn at behandling av HepG2 celler med Simvastatin resulterte i en markert økning i LDL opptak (Figur 3), støtter følsomhetsnivået til denne metoden å oppdage viktige endringer i LDL tilstrømningen. Studier av behandling med rPCSK9 i HepG2 og HCAEC celler er ikke inkludert i denne protokollen rPCSK9 brukes som en ekstra kontroll behandling med godt dokumenterte resultater, men er kostbart å kjøpe i små mengder. Derfor ble rPCSK9 bare brukt til å validere denne protokollen i HK2 celler.
Live celle imaging analyse, sammen med funksjonell og rettidig måling av LDL pågangen, tillatt for kontinuerlig overvåking av helse og morfologi av cellene. Denne fordelen kan effektivt oppdage potensielle cytotoksisitet av anvendt forbindelser, gjør denne metoden en ideell teknikk for samtidig overvåking farmakologisk aktivitet og cytotoksisitet. Tallene 5-7 illustrerer representant bilder av tre testet celle linjene på siste sluttpunktet (4.33 h) som en visuell referanse for effekten av behandlinger på netto LDL tilstrømningen og viser også sunn morfologi av cellene etter den testet behandlinger. Vi anbefaler visuell inspeksjon av alle bildene fra hver brønn å sikre heathy morfologi av cellene for varigheten av studien. For eksempel i data ikke vises, når bilder av HepG2 cellene behandlet med 80 μM Dynasore ble kontrollert, observerte vi indikasjoner på cellen avdeling som kantene av cellene syntes å løfte av platen, tyder celle avdeling på høyere konsentrasjoner av Dynasore. Videre indusert høye konsentrasjoner av simvastatin (3-10 μM) førte også til endrede morfologi indikerer apoptose som rapporterte høye doser av statiner45. Denne protokollen ble brukt til å utføre en titrering Dynasore behandling på 20-80 μM, og Simvastatin på 0,5-10 μM konsentrasjon, etter celle bildene ble brukt til å analysere tilstanden til cellene og se potensielle ctotoxicity behandlingene på ulike konsentrasjoner. Resultatene foreslått bruk av 40 μM for Dyansore og 1 μM for simvastatin optimal konsentrasjoner.
Til slutt anbefaler vi utfører en celle tetthet titrering studie hvis en annen celle testes med denne metoden for å finne det optimale celle nummeret per brønn for å oppnå konsistente resultater. Vår celle tetthet optimalisering studie viste at 10.000 celler/godt i en 24-vel plate føre til konsekvent LDL tilstrømningen resultater for HK2 og HCAE celler. Det er viktig å merke seg at for denne LDL tilstrømningen analysen med levende celle tenkelig system, en monolayer av ikke-confluent celler jevnt fordelt på brønnene er ønskelig som klumper av celler kan gi opphav til feil i normalisert LDL tilstrømningen sluttverdiene. Grunnen til dette er at for normalisering av tilstrømningen dataene, fase området brukes som et mål på cellen tetthet og denne parameteren kan påvirkes negativt når cellen klumper er dannet. Vi observerte at HepG2 celler har en tendens til danner klumper når seeded på tettheter høyere enn 5000 celler/vel forårsaker strid tilstrømningen resultater; Derfor brukte vi 5000 celler per brønn i en 24-vel plate som optimal tetthet for HepG2 celler.
Kollektivt, gir vår metode en middels til høy gjennomstrømming plattform for screening farmakologisk aktivitet og cytotoksisitet forbindelser regulere LDL tilstrømningen samtidig. Denne metoden kan være lett tilpasset for bruk med andre fluorescently-merket ligander angir lysosomale rommet for å evaluere ligand opptak i sanntid. Mens denne protokollen tilbyr spesifikasjoner for InCucyte live bildebehandling og analysesystem protokollen kan tilpasses for alternative tenkelig systemer som Cellomics.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd til LAS: National Institute of Health (R56HL132209 og 1R01HL140468) og Miami hjertet Research Institute. KY er en mottaker av American Heart Association Predoctoral fellesskap (18PRE33960070). HepG2 celler fotograferingen av Dr. Emmanuel Thomas, Universitetet i Miami-Miller skolen av medisin46,47,48.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pHrodo Red-LDL | ThermoFisher Scientific | L34356 | |
| HepG2 cells | E. Thomas Lab, U. Miami | HB-8065 | |
| MEM | Sigma | M0325 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Sigma | G7513 | |
| FBS | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| HK2 cells | ATCC | CRL-2190 | |
| Keratinocyte SFM media kit | Gibco | 17005-042 | |
| Primary Coronary Artery Endothelial Cells | ATCC | PCS-100-020 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-VEGF | ATCC | PCS-100-041 | |
| Human Lipoprotein Deficient Serum | Millipore | LP4 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gemini Bio-Products | 400-150 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | ATCC | PCS-999-004 | |
| 24 well plate | Falcon | 353226 | |
| 40 μM mesh cell strainer | VWR | 10199-654 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
| Trypan Blue Staining (0.4%) | Life Technologies | T10282 | |
| Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | Zoom | Imaging and analysis platform |
| Dynasore Hydrate | Sigma | D7693 | |
| PCSK9 Recombinant Protein | Cayman Chemicals | 20631 |
References
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
- Trevisan, R., Dodesini, A. R., Lepore, G.
- Tall, A. R., Yvan-Charvet, L. Cholesterol, inflammation and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 15 (2), 104 (2015).
- Dedoussis, G. V., Schmidt, H., Genschel, J. LDL-receptor mutations in Europe. Human Mutation. 24 (6), 443-459 (2004).
- Sasaki, K., et al. ATP-binding cassette transporter A subfamily 8 is a sinusoidal efflux transporter for cholesterol and taurocholate in mouse and human liver. Molecular Pharmaceutics. , (2018).
- Storch, J., Xu, Z. Niemann-Pick C2 (NPC2) and intracellular cholesterol trafficking. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (7), 671-678 (2009).
- Jansen, P. J., et al. Absence of ApoE upregulates murine brain ApoD and ABCA1 levels, but does not affect brain sterol levels, while human ApoE3 and human ApoE4 upregulate brain cholesterol precursor levels. Journal of Alzheimer's Disease. 18 (2), 319-329 (2009).
- Girard, E., et al. The dynamin chemical inhibitor dynasore impairs cholesterol trafficking and sterol-sensitive genes transcription in human HeLa cells and macrophages. PLoS One. 6 (12), 29042 (2011).
- Robinet, P., et al. Dynamin is involved in endolysosomal cholesterol delivery to the endoplasmic reticulum: role in cholesterol homeostasis. Traffic. 7 (7), 811-823 (2006).
- Macia, E., et al. Dynasore, a cell-permeable inhibitor of dynamin. Developmental Cell. 10 (6), 839-850 (2006).
- Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the LDLR and LDL-cholesterol. Journal of Biological Chemistry. , (2004).
- Qian, Y. -W., et al. Secreted PCSK9 downregulates low density lipoprotein receptor through receptor-mediated endocytosis. Journal of Lipid Research. 48 (7), 1488-1498 (2007).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. History of discovery: the LDL receptor. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (4), 431 (2009).
- Stephan, Z. F., Yurachek, E. C. Rapid fluorometric assay of LDL receptor activity by DiI-labeled LDL. Journal of Lipid Research. 34 (2), 325-330 (1993).
- Fisher, T. S., et al. Effects of pH and low density lipoprotein (LDL) on PCSK9-dependent LDL receptor regulation. Journal of Biological Chemistry. 282 (28), 20502-20512 (2007).
- Atrahimovich, D., Khatib, S., Sela, S., Vaya, J., Samson, A. O. Punicalagin induces serum low-density lipoprotein influx to macrophages. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, (2016).
- Xu, M., et al. δ-Tocopherol reduces lipid accumulation in Niemann-Pick type C1 and Wolman cholesterol storage disorders. Journal of Biological Chemistry. 112, (2012).
- Bonilla, D. L., et al. Autophagy regulates phagocytosis by modulating the expression of scavenger receptors. Immunity. 39 (3), 537-547 (2013).
- Guo, M., et al. Apelin-13 Decreases Lipid Storage in Hypertrophic Adipocytes In vitro Through the Upregulation of AQP7 Expression by the PI3K Signaling Pathway. Medical Science Monitor : International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 20, 1345-1352 (2014).
- Guillemot, J., Asselin, M. C., Susan-Resiga, D., Essalmani, R., Seidah, N. G. Deferoxamine stimulates LDLR expression and LDL uptake in HepG2 cells. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (3), 600-608 (2016).
- Javitt, N. B. Hep G2 cells as a resource for metabolic studies: lipoprotein, cholesterol, and bile acids. The FASEB Journal. 4 (2), 161-168 (1990).
- Mullen, P. J., Lüscher, B., Scharnagl, H., Krähenbühl, S., Brecht, K. Effect of simvastatin on cholesterol metabolism in C2C12 myotubes and HepG2 cells, and consequences for statin-induced myopathy. Biochemical Pharmacology. 79 (8), 1200-1209 (2010).
- McNutt, M. C., et al. Antagonism of secreted PCSK9 increases low density lipoprotein receptor expression in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (16), 10561-10570 (2009).
- Scharnagl, H., et al. Effect of atorvastatin, simvastatin, and lovastatin on the metabolism of cholesterol and triacylglycerides in HepG2 cells. Biochemical Pharmacology. 62 (11), 1545-1555 (2001).
- Scharnagl, H., et al. The effects of lifibrol (K12. 148) on the cholesterol metabolism of cultured cells: evidence for sterol independent stimulation of the LDL receptor pathway. Atherosclerosis. 153 (1), 69-80 (2000).
- Chan, J. C., et al. A proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 neutralizing antibody reduces serum cholesterol in mice and nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (24), 9820-9825 (2009).
- Ding, W., et al. Osteopontin deficiency ameliorates Alport pathology by preventing tubular metabolic deficits. JCI Insight. 3 (6), (2018).
- Herman-Edelstein, M., Scherzer, P., Tobar, A., Levi, M., Gafter, U. Altered renal lipid metabolism and renal lipid accumulation in human diabetic nephropathy. Journal of Lipid Research. 55 (3), 561-572 (2014).
- Su, H., et al. Lipid Deposition in Kidney Diseases: Interplay Among Redox, Lipid Mediators, and Renal Impairment. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (10), 1027-1043 (2018).
- Agrawal, S., Zaritsky, J. J., Fornoni, A., Smoyer, W. E. Dyslipidaemia in nephrotic syndrome: mechanisms and treatment. Nature Reviews Nephrology. 14 (1), 57 (2018).
- Babiak, J., Rudel, L. L. Lipoproteins and atherosclerosis. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 1 (3), 515-550 (1987).
- Wang, H. H., Garruti, G., Liu, M., Portincasa, P., Wang, D. Cholesterol and Lipoprotein Metabolism and Atherosclerosis: Recent Advances in Reverse Cholesterol Transport. Annals of Hepatology. 16 (1), 28-42 (2018).
- Preta, G., Cronin, J. G., Sheldon, I. M.
- Horton, J. D., Cohen, J. C., Hobbs, H. H. Molecular biology of PCSK9: its role in LDL metabolism. Trends in Biochemical Sciences. 32 (2), 71-77 (2007).
- Abifadel, M., et al. Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia. Nature Genetics. 34 (2), 154 (2003).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. Regulation of the mevalonate pathway. Nature. 343 (6257), 425 (1990).
- Dong, B., Wu, M., Cao, A., Li, H., Liu, J. Suppression of Idol expression is an additional mechanism underlying statin-induced up-regulation of hepatic LDL receptor expression. International Journal of Molecular Medicine. 27 (1), 103-110 (2011).
- Song, K. H., Kim, Y. H., Im, A. -R., Kim, Y. H. Black Raspberry Extract Enhances LDL Uptake in HepG2 Cells by Suppressing PCSK9 Expression to Upregulate LDLR Expression. Journal of Medicinal Food. , (2018).
- Chan, J. C., et al. A proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 neutralizing antibody reduces serum cholesterol in mice and nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9820-9825 (2009).
- Tabas, I., Williams, K. J., Borén, J. Subendothelial lipoprotein retention as the initiating process in atherosclerosis: update and therapeutic implications. Circulation. 116 (16), 1832-1844 (2007).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell. 89 (3), 331-340 (1997).
- Horton, J. D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver. The Journal of Clinical Investigation. 109 (9), 1125-1131 (2002).
- Tavintharan, S., et al. Reduced mitochondrial coenzyme Q10 levels in HepG2 cells treated with high-dose simvastatin: A possible role in statin-induced hepatotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. 223 (2), 173-179 (2007).
- Thomas, E., et al. HCV infection induces a unique hepatic innate immune response associated with robust production of type III interferons. Gastroenterology. 142 (4), 978-988 (2012).
- Thomas, E., Liang, T. J. Experimental models of hepatitis B and C-new insights and progress. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (6), 362 (2016).
- Yoneda, M., et al. Hepatitis B Virus and DNA Stimulation Trigger a Rapid Innate Immune Response through NF-κB. The Journal of Immunology. , 1502677 (2016).
