Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ספיגת כולסטרול LDL Assay באמצעות תא חי הדמיה ניתוח עם התא לניטור תקינות

Published: November 17, 2018 doi: 10.3791/58564
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 4, 4,5, 6, 1,2,7,8
1Interdisciplinary Stem Cell Institute, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiology, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 3Department of Molecular and Cellular Pharmacology, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 4Dr. John T. Macdonald Foundation Department of Human Genetics, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 5John P. Hussman Institute for Human Genomics, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 6Department of Medicine, Division of Endocrinology, Metabolism and Endocrinology and the Diabetes Research Institute, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 7Vascular Biology Institute, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 8Peggy and Harold Katz Family Drug Discovery Center, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מספק גישה יעילה מדידת ספיגת כולסטרול LDL במחירים זרם בזמן אמת באמצעות תא חי הדמיה למערכת סוגי תאים שונים. טכניקה זו מספקת פלטפורמה למסך את פעילות פרמקולוגית של תרכובות להשפיע על זרם LDL תוך מעקב אחר עבור תא ומורפולוגיה cytotoxicity ומכאן פוטנציאליים.

Abstract

התקנון של ספיגת כולסטרול LDL דרך אנדוציטוזה בתיווך LDLR הוא אזור חשוב של מחקר שונים פתולוגיות העיקריים כולל הפרעות מטבוליות, מחלות לב וכלי דם, מחלת כליות. בשלב זה אין שיטה זמין כדי להעריך את ספיגת ה-LDL תוך מעקב אחר בו זמנית לבריאות של התאים. המחקר הנוכחי מציג פרוטוקול, באמצעות תא חי הדמיה ניתוח מערכת, לרכוש מדידות טורי של LDL זרם עם ניטור הבו-זמניות עבור בריאות. טכניקה חדשנית זו נבחנה שלוש שורות תאים אנושיים (תאי אנדותל הכבד, הכליות צינורי אפיתל ולאחר כלילית העורק) במהלך הזמן ארבע שעות מספר. יתר על כן, הרגישות של טכניקה זו תאומת ידועים LDL מעכבי ספיגת, Dynasore, PCSK9 חלבון רקומביננטי, כמו גם על ידי מקדם ספיגה של LDL, סימבסטטין. יחדיו, שיטה זו מספקת פלטפורמה תפוקה בינונית-גבוהה בעת ובעונה אחת הקרנות פעילות פרמקולוגית, כמו גם הפיקוח על מורפולוגיה תאים, ומכאן cytotoxicity של תרכובות ויסות זרם ה-LDL. הניתוח יכול לשמש עם מערכות הדמיה שונים ותוכנות אנליטית.

Introduction

אנדוציטוזה בתיווך LDLR קולטן של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה LDL הוא אזור חשוב של המחקר מאז במחזור רמות הכולסטרול LDL נמצאים בליבה של מחלות לב וכלי דם1, מחלת כליות2 , כמו גם מגוון רחב של דלקתיות מחלות3 והפרעות גנטיות עם מוטציות בכולסטרול תחבורה גנים4,5,6,7. לימודי בתיווך LDLR כולסטרול זרם הובילו זיהוי של כלי מחקר מרובים, כגון מעכבי Dynamin כולל את כימי Dynasore8,9,10, כמו גם מווסת LDL חלבונים כגון Proprotein Convertase סבטיליזין/Kexin הקלד 9 (PCSK9)11,12.

מסלול אנדוציטוזה LDL-LDLR מתחיל עם sequestering המתחם LDL-LDLR על פני התא לתוך בורות מצופים clathrin13. שלפוחית ואז נוצרות על-ידי invagination של קרום התא משטח הפנמת את קומפלקס LDL-LDLR וקואלות להעברה בתוך התא. כמו שלפוחית בנוי שמישראל מוקדם ומאוחר ואז endosomes, ה-pH טיפות בתוך אנדוזום מאוחר, גורם השיוך של LDL מ שלו קולטן14. בעבר, היו תלויים בשיטות של כימות של LDL זרם התווית על-ידי רדיו 125-LDL הדגירה שיתוף עם תאים, מיצוי הבאים של החלבון שאותה ניתן להתאים רדיו מתאי כימות15. ואז זה הוחלף על ידי שימוש fluorescently שכותרתה LDL חלבונים כגון DiI-LDL, ו immunostaining הבאים או חילוץ של חלבון עבור קריאות פלורסנט באמצעות ספקטרופוטומטרים או בצלחת קורא15,16. Fluorescently מתויג LDL גם שימש ב תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) לניתוח של הפנמה של LDL, תא-איגוד ה-LDL-משטח-17. בעוד ששיטות אלה לאפשר איסוף נתונים לאחר הטיפול, פיקוח על הכדאיות של התאים במהלך הטיפול אינה אפשרית.

ה-pH חומצי של אנדוזום מאוחר מאפשר השימוש של בדיקה pH מופעל LDL פלורסנט כגון pHrodo LDL האדום הזה שזוהר לאחר הפנמה18,19. מאפיין זה מאפשר לקורס זמן רציף של LDL הערכת ספיגת בתאים חיים. לכן, פרוטוקול זה מנצל pHrodo אדום-LDL הדמיה זריחה בניתוח תא חי כדי באופן סדרתי מדד ה-LDL ספיגת עם ניטור בו-זמניות לבריאות תא. התוצאות מצביעות על האמינות של טכניקה חדשנית זו, כפי שנבדקו במהלך הזמן ארבע שעות מספר שלוש שורות תאים אנושיים שונים, תאי קרצינומה של הכבד האנושי (HepG2), תאים אנושיים (HK2) כליות אפיתל, כלילית עורקי אנדותל תאים אנושיים (HCAEC ). שורות תאים אלה יש משמעות קלינית ל- LDL סיווג20,21,22,23,24,25,26,27 , כליות מחלת28,29,30,31, מחלות לב32,33, בהתאמה. בנוסף לניטור זרם LDL, פרוטוקול זה משלבת טיפול עם שני מעכבי ספיגת ידועים של LDL, מימה Dynasore, חלבון רקומביננטי PCSK9, כמו גם של משרן סטטינים של הביטוי LDLR ו LDL ספיגת, סימבסטטין. Dynasore רקומביננטי PCSK9 כל עובד דרך מסלולים שונים כדי להפחית את ספיגת ה-LDL.

Dynasore מפחיתה את ספיגת ה-LDL על ידי חסימת clathrin תלוית אנדוציטוזה של LDL-LDLR מורכבים10,34וזה מעכב מולקולה קטנה של Dynamins10 . PCSK9 רקומביננטי, מצד שני, הוא חבר של peptidase המשפחה S8 נקשר LDLR, מעכב את מיחזור השטח תא לאחר שחרור ה-LDL מהמתחם למביטה על ידי חסימת שינויים נדרשים הסתגלותי35,36 . צפיפות LDLR פני שטח התא ירד בסופו של דבר שמוביל מופחתת ספיגת LDL על ידי התא. סטטינים, תוך ישירות חסימת האנזים רדוקטאז (HMG-CoA) 3-הידרוקסי-3-methylglutaryl-קואנזים ובכך ביוסינטזה כולסטרול, גם ידועים upregulate הביטוי של25,LDLR38 שמוביל מוגברת ספיגת LDL. הרגישות של פרוטוקול זה מאומת על ידי גילוי הפחתה משמעותית ב LDL זרם שורות שלושה תאים אנושיים הרלוונטית קלינית, HK2, HepG2, HCAECs, Dynasore ו/או רקומביננטי PCSK9, ו עלייה ניכרת LDL ספיגת בתאים HepG2 על ידי סימבסטטין מסלול זמן של 4 שעות עם ניטור לבריאות/תא מורפולוגיה. יחדיו, שיטה זו מספקת פלטפורמה תפוקה בינונית-גבוהה לסינון במקביל את פעילות פרמקולוגית ואת cytotoxicity של תרכובות מווסת את ספיגת ה-LDL ב תאים חיים.

Protocol

1. זריעת בתאים צלחת 24-ובכן

  1. האחות מדיה את התאים, לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר של Dubelco פוספט Buffered מלוחים (dPBS), וארוקן את dPBS. לשימוש HepG2 תאים בצלחת 100 מ מ, 1.5 מ של 0.25% טריפסין/EDTA, ולהשתמש עבור HK2 תאים או HCAECs 1.5 מ של 0.05% טריפסין/EDTA פתרון כדי לנתק את התאים.
  2. דגירה את הצלחת ב חממה 37 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות או עד התאים הם צמודי קרקע. לנטרל טריפסין לאחר דגירה 4 דקות על ידי הוספת 3 מ"ל של התקשורת מלאה HepG2, HK2 או 3 מ"ל של טריפסין נטרול פתרון, dPBS פלוס 5% סרום שור עוברית (FBS), עבור תאים HCAEC.
  3. להעביר את התאים לתוך צינורות חרוט 15 מ"ל צנטריפוגה ב g x 250 למשך 5 דקות, תשאף התקשורת ו מחדש להשעות בגדר תא בתקשורת מלאה.
  4. לסנן את המתלים תא בעדינות דרך מסננת רשת 40 μm כדי לשבור את התא הגושים. לא אנחנו לא שוטפים את התאים דרך מסננת.
  5. לספור את התאים, צלחת אותם בבית צפיפות ממוטבת. לדוגמה, תאים 5,000 לכל טוב של תאים HepG2 או 10,000 תאים לכל טוב של תאים HK2 או HCAECs לתוך צלחת 24-ובכן להוביל תוצאות אופטימליות.
  6. דגירה את הצלחת בן לילה ב 37 ° C כדי לאפשר תאים לצרף.
  7. למחרת, לשנות את התקשורת תא לבסיס המדיה עבור שורת תאים (ללא FBS) ובנוסף 5% Lipo-חלבון לקוי סרום (LPDS) או נמוך (2%) מדיה FBS בהתאם הטיפול (ראה 1.7). לאחר מכן, המשך הדגירה במשך 24 שעות ביממה להרעיב את התאים. השתמש μL 500 של מדיה סה כ כל טוב לתוך צלחת 24-. טוב.
  8. מתייחסים לתאים בשלוש דרכים: להוסיף 10 µg/mL rPCSK9 (או רכב) ולחזור לתאים החממה 37 מעלות צלזיוס במשך שעה, להוסיף 40 µM מימה Dynasore (או רכב, דימתיל סולפוקסיד) ולחזור התאים החממה 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות , או להוסיף 1 מיקרומטר סימבסטטין (או רכב, דימתיל סולפוקסיד) ולחזור התאים החממה 37 ° C עבור 12, 18-24 שעות. להשתמש במדיה עם 5% LPDS rPCSK9 או Dynasore טיפולים. שימוש נמוך (2%) FBS מדיה או מדיה עם 5% LPDS סימבסטטין טיפולים.
    הערה: לטיפול תאי עם תרכובות הרצוי יכול להיעשות בזמנו של שינוי מדיה עבור הרעבה ליפופרוטאין (שלב 1.6) עבור ניסויים ארוכי טווח, או לפני הניתוח לניסויים לטווח קצר. לחלופין, הטיפול מותאם אישית יכול להיבחר בהתאם לסוג המטרה של הניסויים.
  9. לאחר מכן, להוסיף 5 µL של LDL מתויג אדום pHrodo (מניות 1 מ"ג/מ"ל) מכל קידוח בריכוז הסופי של 10 µg/mL. לאחר מכן, בזהירות להסיר את בועות מן הבארות.

2. ניתוח תא גרה

  1. מיד לאחר הוספת LDL שכותרתה, למקם את הצלחת בחממה תא חי ניתוח המערכת (ראה טבלה של חומרים) ולאפשר את הצלחת אל equilibrate במשך 15 דקות להפחית עיבוי בצלחת.
  2. בינתיים, לפתוח את התוכנה ותזמן את הסריקה על-ידי הוספת הספינה מחזיקה את הצלחת. תמונה 16 תמונות לכל היטב במרווחים 1 שעה 10 X למשך 4 שעות באמצעות הערוצים אדום ושלב.
  3. ליצור מפת צלחת לשימוש עבור עיבוד נתונים.
    1. לחץ על הכרטיסיה מאפייני בחר את צלחת מפה. קלט את סוג התא וטיפולים תרכובות בכרטיסיה.
    2. לחץ על הכרטיסייה ' אזורי ', בחר כל ערכה של משכפל ולאחר שמירה בשם אזורים.

3. הגדרת פרמטרים ניתוח

  1. לאחר הפעלה ניסיונית תושלם, צור תמונה של ערכת בתוכנה כדי לתרגל את המחשב כדי לכמת כל פרמטר הכלולים בערכה ספירה.
    1. התוכנה, פתח את התצוגה צלחת ולאחר מכן בתיבה ניתוח העבודה Utilities לבחור יצירה או הוסף לאוסף תמונות.
    2. בחרו אוסף תמונה חדשה, הקלד שם של אוסף תמונות, ובחרו את הערוצים אדום ו שלב בבדיקת בתיבות לצד הערוצים.
    3. בחר 5 תמונות נוספות ולהוסיף לאוסף תמונות על-ידי הוספת אוסף תמונות הנוכחי.
  2. ליצור הגדרה עיבוד לתאים. טבלה 1 כולל את הפרמטרים עבור תא HepG2, HK2 ו- HCAE עיבוד הגדרות עבור פרוטוקול זה זרם ה-LDL.
    1. בתיבה ניתוח העבודה Utilities , בחר הגדרה חדשה לעיבוד. בחר את האוסף תמונה בשם בשלב 2.1.2 מתוך התפריט הנפתח. קלט את הפרמטרים עבור הסוג של תאים בטבלה 1.
    2. בתיבת התצוגה המקדימה, השתמש התפריט הנפתח כדי לבחור כל תצוגה מקדימה.
    3. בתיבה מסיכת ניתוח , בדוק את המסכה הנהרות בתיבות אדום עצם מסיכה כדי להציג את האזור, כלול את הניתוח עבור ההגדרה עיבוד. ראה איור 1.
    4. גלול באוסף תמונות כדי להבטיח שהתאים ואת ה-LDL כלולים במסכה. בחר קובץ לשמור הגדרת עיבוד.
  3. לנתח את קבוצת תמונות מהפעלה ניסיונית.
    1. פתח את הניסוי בתצוגה צלחת. בתיבה ניתוח העבודה Utilities , לבחור להפעיל את העבודה ניתוח החדשה. בחר את ההגדרה עיבוד שנשמרו.
    2. שם ניתוח העבודה, בחר את טווח הזמן לניתוח, וסמן הבארות ניסיוני לנתח. לחץ על לחצן הפעלה .

4. ניתוח ועיבוד נתונים

  1. לאחר סיום העבודה ניתוח, לייצא את הנתונים:
    1. בחר את ניתוח שהושלמו ' ולחץ על ' תצוגה'. בתפריט ' כלי עזר ', בחר גרף מדד/ייצוא.
    2. בתפריט ' אזורי ', לבחור כל בארות, בתפריט ' קבוצה ', כדי לקבל הערכים כלומר עבור כל ערכה של בארות כקבוצה לבחור משכפל ו לייצוא הערכים הבודדים עבור כל טוב בחרו ' ללא'.
    3. מדד אדום אובייקט בתפריט, בחר הכולל אדום אובייקט משולבת בעוצמה (RCU x µm2/image). פרמטר זה מציין הסכום של הטיימס העוצמה (ב RCU) אדום האזור של האות האדום (ב מיקרומטר2) בכל התמונות על פני כל טוב, המתאים ספיגת ה-LDL הכולל על ידי התאים.
    4. לחץ על הלחצן ' ייצוא נתונים '. בדוק לשבור נתונים לתוך תמונות בודדות. הנתונים מועתקים באופן אוטומטי על הלוח, יכול להדביק את קובץ הגיליון האלקטרוני חדש.
    5. מדד שלב אובייקט בתפריט, בחר הנהרות (אחוזים). בדוק לשבור נתונים לתוך תמונות בודדות. לחץ על הלחצן ' ייצוא נתונים '. הנתונים מועתק באופן אוטומטי על הלוח, באפשרותך להעתיק את קובץ הגיליון האלקטרוני המכילה נתוני עוצמת משולב אובייקט האדום הכולל.
    6. להחיל ההמרה של המפגש אחוז מכלל השטח עם המשוואה הבאה.

      סה כ שטח שלב (/image2מיקרומטר) = הנהרות (%) × × (תמונה גובה (פיקסלים) × רזולוציה) (תמונה רוחב (פיקסלים) × רזולוציה)

      הערה: הפרמטר הנהרות (%) מציין המפגש אחוז של האזור שלב לכל תמונה, התואם לאזור של התאים בכל טוב. מדד זה יש להמיר לאזור שלב הכולל עבור כל אדם התמונה פעם מיוצאים. ניתן למצוא את מפרטי התמונה לערוץ שלב (תמונה גובה, רוחב ורזולוציה) לשימוש עם הנוסחה לעיל עבור כל כלי ניסיוני על ידי פנייה מאפייני הכלי תחת ערוצי הצבע בתמונה.
    7. לנרמל משולב-עוצמה הכולל של אדום אובייקט, לאזור שלב הכולל כמחושב 4.1.6 באמצעות הנוסחה הבאה עבור כל תמונה בנפרד כדי לחסל את ההשתנות צפיפות התאים על פני הבארות.
      1. לחלק את סה כ אדום אובייקט משולב (RCU x µm2/image) ערכי העוצמה של כל תמונה על-ידי המקביל שלו שלב שטח (/image2מיקרומטר) כדי להשיג ערכי LDL ספיגה (RCU) לכל תמונה.
      2. לאחר מכן, ממוצע הנתונים LDL ספיגה (RCU) של כל התמונות של כל טוב כדי להשיג את ספיגת ה-LDL הממוצע היטב כל ואת אז ממוצע של הערכים ספיגת LDL מכלל הבארות שכפל כדי לקבל קבוצה אמצעים. נתונים אלה עשויים לשמש איור, ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנת ההגדרה של הבחירה הינם הערכים הסופיים של ספיגת LDL.

Representative Results

חיים תא הדמיה מאפשר ניטור אמינה של בריאות במהלך לימודי זרם כולסטרול שלוש שורות תאים אנושיים
אנחנו לאמת שלנו assay בעוד שלוש שורות תאים אנושיים אשר כולסטרול הומאוסטזיס תקנה משחק תפקיד pathophysiological מרכזי, לרבות תאי קרצינומה של הכבד האנושי (HepG2), תאים אנושיים (HK2) כליות אפיתל תאי אנדותל עורקים אנושי (HCAECs). השתמשנו מערכת הדמיה של תא חי כדי לבצע וזמינותו ספיגת LDL במסלול זמן 4 שעות עם מדידות טורי במרווחים 1 h. התוצאות שלנו מציינים כי כל סוגי תאים שנבדקו היו תואמות זו טכניקה חדשה ולהוביל עקומות המציינת את ספיגת ה-LDL רציף משך זמן המחקר זרם עם 4.33 h בתור נקודת הקצה הסופי (איור 2). זרם הנתונים באיור 2 התקבלו על ידי נרמול pHrodo הכולל את התווית על-ידי אדום LDL קרינה פלואורסצנטית (סה כ עצם אדום משולב בעוצמה לכל תמונה ב- RCU x µm2/תמונה) לאזור בתא סכום כל תמונה של כל טוב (שלב אובייקט אזור לכל תמונה ב-? /image2מ') לחסל את ההשתנות צפיפות התאים על פני הבארות. יתר על כן, כדי לאמת את הרגישות של LDL זרם וזמינותו לצורך הקרנה תרכובות להשפיע על ספיגת הכולסטרול LDL, היינו שני פקדים חיובי ידוע לעכב LDL זרם, Dynasore, rPCSK9, בקרה חיובית אחת מוכרת LDL תפיסה, סימבסטטין. כפי לאמת את התוצאות שלנו, לאחר הטיפול עם Dynasore, rPCSK9, שלושתם נבדקו שורות תאים אנושיים (HepG2, HK2 ו- HCAEC) הראו הפחתה משמעותית LDL זרם במהלך הזמן מספר 4 שעות (איור 2A-C). לדוגמה, באיור 2A מציג זרם LDL מצטמצם בתאים HepG2 עם טיפול Dynasore במרוצת הזמן, לעומת התאים שטופלו דימתיל סולפוקסיד; בזמן דימתיל סולפוקסיד של הפקד הרכב עבור Dynasore הבקרה היה אין השפעה משמעותית על זרם LDL לעומת קבוצת הביקורת שלא טופלו. יתרה מזאת, הממצאים שלנו הראה עלייה ב- LDL ספיגת על ידי תאים HepG2 לאחר הטיפול עם סימבסטטין (איור 3), המשנה את הרגישות של שיטה זו לזהות שינויים משמעותיים זרם ה-LDL. -על נקודת הזמן 4.5 h, המהווה נקודת זמן אופייני במחקרים ספיגת LDL, זרם LDL באופן משמעותי מופחתת עם טיפול Dynasore או rPCSK9, מוגברת על ידי טיפול סימבסטטין (איור 4).

היתרון העיקרי בשימוש תא חי הדמיה ללימודי ספיגת LDL הוא מערכת זו מספקת תמונות בזמן אמת של התאים כל היטב זה יכול לשמש כדי לפקח על פוטנציאל cytotoxicity של תרכובות שנבדקו. דמויות 5-7 להמחיש להחליפן בתמונות של הקווים תא שלושה נחקרו נקודת הזמן הראשוני (0.33 h), הקצה הסופי (4.33 ח) כהפניה חזותית לזרימה הגדולה-LDL נטו. התמונות לאשר את מורפולוגיה תקינה של תאי בעקבות טיפול Dynasore או rPCSK9, המציינת הן היעילות והבטיחות של תרכובות אלו.

תא חי ניתוח נותן כולסטרול כמותיים טורי אמין זרם מדידות עם טיפולים שונים

היתרון העיקרי של שימוש בפרוטוקול זה עם תא חי מערכת הדמיה היא היכולת לאסוף נתונים לאורך זמן ולהשוות LDL זרם נקודות זמן מרובות במקום בנקודה בפעם האחרונה אחד מבוצע גם באופן מסורתי. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מסוגלים לחשב זרם reductionin אחוז LDL בנקודת זמן מסוף, כמו גם במרווחים 1 h לאורך זמן. בטבלה 2 מסכמת את צמצום הזרמת LDL ב שלושה קווי בדוקות התא האנושי לאחר 10 דקות לפני הטיפול עם 40 µM Dynasore או טיפול קדם 1 h rPCSK9 µg/mL 10. ב- h 4.33 כנקודת סיום המחקר הסופי, טיפול עם Dynasore-40 µM הקטינה באופן משמעותי זרם ה-LDL HepG2 תאים, התאים HK2, HCAECs על ידי 53%, 68% ו- 54%, בהתאמה (טבלה 2 א-ג) וכתוצאה הטיפול rPCSK9-10 µg/mL 55% צמצום LDL זרם ב HK2 תאים (טבלה 2B). בנוסף לכימות נקודת זמן מסוף כמו מבחני מסורתי, אנו מסוגלים לבצע ניתוח כמותי ההפחתה של LDL זרם עקב טיפול בכל נקודה בזמן הניסוי. לדוגמה, הטבלה 2B מראה כי טיפול עם rPCSK9 ב HK2 תאים הביאה לירידה של LDL ספיגת 79% ב- 1.33 h, 67% ב- 2.33 h, 59% ב- 3.33 h פוסט הטיפול בהשוואה לתאים ללא טיפול. פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה לניתוח כמותי של זרם ה-LDL לאחר הטיפול.

Figure 1
איור 1 : עיבוד הגדרת מסיכת. להחליפן בתמונות של תאים HK2 מתוארים בעקבות היישום של הגדרת עיבוד מתאים (מפורט בטבלה1). הראו areHK2 תאים בלי מיסוך (A), עם שלב Maskapplied (B), עם אדום אובייקט מסכת חלה (C), או עם פאזה וגם אדום אובייקט מסכות חלה (D). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : צמצום LDL ספיגת באמצעות חי תא מערכת הדמיה במהלך הזמן מספר 4.33 h. חיים תא ניתוח המערכת משמשת למדידת זרם ה-LDL ב תאי קרצינומה של הכבד האנושי (HEPG2) (A), אנושי כליות צינורי (HK2) בתאי אפיתל (B) ותאים האנושי עורקים אנדותל (HCAE) (C). התאים טופלו Dynasore (10 דקות לפני ההפעלה) או rPCSK9 (1h לפני ההפעלה) כפקדים חיובי. דימתיל סולפוקסיד שימש ככלי טיפולי Dynasore. פקדים חיובי ירד באופן משמעותי זרם LDL כל תא 3 שורות. ערכי LDL זרם התקבלו על ידי נרמול עוצמת הכולל עצם אדום משולב (RCUxµm2/image) אל אזור אובייקט הכולל שלב (/image2מיקרומטר). הנתונים הם mean±SEM. N = 6 בארות/קבוצה. הנתונים הם נציג של 2 או 3 ניסויים עצמאית. לעומת < 0.0001 p ריק, ו- # # # vs < 0.0001p דימתיל סולפוקסיד, באמצעות ANOVA דו-כיווני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . הגברת ספיגת LDL באמצעות תא חי מערכת הדמיה במהלך הזמן מספר 4.33h. חיים תא ניתוח המערכת משמשת למדידת זרם LDL בתאי סרטן הכבד האנושי (HEPG2). ספיגת LDL הוא גדל באופן משמעותי בעקבות טיפול עם סימבסטטין h 12 (), 18 h (B) או 24 שעות (C) באמצעות המדיה המכילה 2% FBS. נקודת הזמן 24 שעות ביממה בוצעה גם עם המדיה המכילה 5% LPDS (ללא FBS). דימתיל סולפוקסיד שימש שליטה שלילי. ערכי LDL זרם התקבלו על ידי נרמול עוצמת הכולל עצם אדום משולב (RCU x µm2/image) אל אזור אובייקט הכולל שלב (/image2מיקרומטר). הנתונים הם mean±SEM. N = 6 בארות/קבוצה. הנתונים הם נציג של הניסוי עצמאי אחד. < 0.0001 p vs דימתיל סולפוקסיד, באמצעות מבחן t של סטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 . הפחתה משמעותית של זרם LDL ע י סוכנים ספיגת להורדת LDL בנקודת הזמן 4.3 h. זרם ה-LDL פוחת באופן משמעותי בתוך תאי קרצינומה של הכבד האנושי (HepG2) (A), אנושי כליות צינורי (HK2) בתאי אפיתל (B) ותאים האנושי עורקים אנדותל (HCAE) (ג) לאחר הטיפול עם ספיגת LDL מעכבי Dynasore במשך 10 דקות או rPCSK9 למשך שעה. זרם ה-LDL מתגברת בצורה ניכרת על ידי סימבסטטין בתאים HepG2 לאחר טיפולים h, 12, 18 או 24 (D). הנתונים הם mean±SEM. N = 6 בארות/קבוצה. הנתונים הם נציג של 2 או 3 ניסויים עצמאית. p < 0.0001 באמצעות ANOVA דו-כיווני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 . מופחת LDL זרם hepatocellular תאי קרצינומה (HepG2) על-ידי סוכן ה-LDL ספיגת להורדת, Dynasore. להחליפן בתמונות של שלב אובייקט, האובייקט אדום עבור תאים HepG2 מתוארים ב- 0.33 h (לוחות שמאלה) ולהציג נקודת הקצה של 4.33 h (לוחות נכון) מצב תקין של תאים. 40 µM Dynasore, ידועים כדי להפחית את ספיגת ה-LDL-כולסטרול, שימש בקרה חיובית (C). התמונות צולמו בהגדלה X 10. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 . מופחת LDL זרם בתאי אדם כליות צינורי אפיתל (HK2) על ידי סוכנים ספיגת להורדת LDL, Dynasore, rPCSK9. להחליפן בתמונות של שלב אובייקט, האובייקט אדום עבור תאים HK2 מתואר 0.33 h (לוחות שמאלה), נקודת הקצה 4.33 h (לוחות נכון) הצג מצב תקין של התאים. 40 µM Dynasore (ג), או rPCSK9 µg/mL 10 (ד), ידועים כדי להפחית את ספיגת הכולסטרול LDL, שימשו השליטה חיובי. תמונות נלקחים בהגדלה X 10. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7 . מופחת LDL זרם בתאים אנושיים עורקים אנדותל (HCAECs) על-ידי סוכן ה-LDL ספיגת להורדת, Dynasore. להחליפן בתמונות של שלב אובייקט ואובייקט אדום עבור HCAECs מתואר 0.33 h (לוחות שמאלה), נקודת הקצה 4.33 h (לוחות נכון) הצג מצב תקין של התאים. 40 µM Dynasore, ידועים כדי להפחית את ספיגת ה-LDL-כולסטרול, שימש בקרה חיובית (C). התמונות צולמו בהגדלה X 10. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. הנתונים הם mean±SEM. N = 6 בארות/קבוצה. הנתונים הם נציג של 2 או 3 ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Table 1
טבלה 1: עיבוד הגדרת פרמטרים. פרמטרים אלה הם ספציפיים עבור מערכת ניתוח שימוש בפרוטוקול זה. צריך להגדיר פרמטרים כדי לנתח אדום באזור הערוץ האדום ואת האזור של התא בערוץ שלב. הגדרות הפרמטר עבור HepG2, HK2, HCAE תא קווים מוצגים.

Table 2
בטבלה 2: שינוי ב- LDL זרם בתאים HepG2, HK2, HCAE שטופלו Dynasore, rPCSK9 או סימבסטטין ב ה 4.3 (א) HepG2 תאים, תאים HK2 (B), HCAE (ג) תאים ותאים HepG2 (D).

Discussion

בפרוטוקול הנוכחי, נדגים את הניצול של תא חי הדמיה כשיטה חדש ויעיל יותר למדידת זמן אמת LDL ספיגת מעל הזמן קורס שורות תאים אנושיים שונים. תאי קרצינומה של הכבד האנושי (HepG2) משמשים במחקרים הקרנת עבור הורדת כולסטרול הרפוי21,22,23,24,25,26, 39,40. לכן, בחרנו את סוג התא לבדיקת היכולת של מערכת הדמיה של תא חי ללימודי זרם ה-LDL. התוצאות שלנו מציינים כי תאים HepG2 תואמים זו טכניקה חדשה והתוצאה בעקומה סיגמואיד דמוי המציין ספיגת LDL רציף משך זמן וזמינותו זרם עד 4.33 h בתור נקודת הקצה הסופי (איור 2A ו- איור 3 ).

כולסטרול הומאוסטזיס ממלא תפקיד מרכזי הפתופיזיולוגיה של nephropathies שונים. אכן, הצטברות כולסטרול ברקמת הכליה הוא תורם מרכזי סיסטיק כליות למחלות כליות כרונית והוא פתולוגיה העיקריים ב-30,29,28,nephropathies שונים31. ומכאן, בדקנו את השיטה שלנו בתאי אדם כליות אפיתל (HK2) כקו תא פופולרי ואמין מנוצל בתחום נפרולוגיה. הנתונים שלנו נתמך גם את הכדאיות של מערכת ההדמייה תא חי כדי למדוד זרם LDL בתאים HK2. כפי שמוצג באיור 2B, תאים HK2 לקח את ה-LDL כולסטרול באופן ליניארי לאורך משך המחקר זרם (4 שעות).

בשל חשיבות המטבוליזם כולסטרול פיתוח, ההתקדמות של טרשת עורקים32,33,41, הגורם המוביל של מחלות לב וכלי דם, אשר בתורו הרוצח מספר אחת בעולם 42, כיוונו כדי לאמת את השיטה שלנו בסוג התא טרשת עורקים-רלוונטי. השתמשנו כלילית עורקי אנדותל תאים אנושיים (HCAECs), שכן הן אחד מסוגי התא הראשון להיחשף עלבון כולסטרול בלומן עורקים של חולים טרשת עורקים. הנתונים שלנו שמוצג באיור 2C מציין כי שיטה זו זרם LDL גם עובד ביעילות עם HCAECs. זהו גרף תוצאות עקומה דמויית סיגמואיד דומה לזה של תאים HepG2.

כדי לבדוק את תוקפו ואת הרגישות של זה וזמינותו זרם LDL משופר לסינון תרכובות להשפיע על ספיגת LDL-כולסטרול, השתמשנו שלושה פקדים, סוכנים ספיגת להורדת LDL Dynasore ו rPCSK9 ו LDL זרם activator סימבסטטין. . הנה, התייחסנו לעיל הזכיר שורות תאים (HepG2, HK2 ו- HCAECs) עם ריכוזים מיטביים של Dynasore או rPCSK9 לפני וזמינותו זרם. התוצאות שלנו הראה כי כל שלושה קווי בדוקות התא הגיב הטיפולים עם הפחתות משמעותיות LDL זרם מעל 4 שעות קורס (איור 2). למשל, ב- h 4.33 כנקודת בפעם האחרונה, טיפול עם Dynasore-40 µM הקטינה באופן משמעותי זרם ה-LDL HepG2 תאים, התאים HK2, HCAECs על ידי 53%, 68% ו- 54%, בהתאמה (p < 0.0001; איור 2 A-C ו לטבלה 2A-C). בנוסף, rPCSK9-10 µg/mL גרם הפחתה 55% מסומן ב- LDL זרם בתאים HK2 (p < 0.0001; איור 2 B ו לטבלה 2B). יתרה מזאת, הממצאים שלנו הראה כי טיפול HepG2 תאים עם סימבסטטין הביא עלייה ניכרת ספיגת LDL (איור 3), המשנה את הרגישות של שיטה זו לזהות שינויים משמעותיים זרם ה-LDL. מחקרים של הטיפול עם rPCSK9 בתאים HepG2 ו- HCAEC לא נכללות פרוטוקול זה כמו rPCSK9 משמש כטיפול בקרה נוספים עם תוצאות מתועדת היטב, אבל הוא יקר לקנות בכמויות קטנות. לכן rPCSK9 שימשה רק כדי לאמת את פרוטוקול זה בתאים HK2.

חיים תא הדמיה ניתוח, יחד עם המידה פונקציונלי ומתוזמן של זרם LDL, המותר עבור ניטור רציף של בריאות מורפולוגיה של התאים. יתרון זה יכול לזהות ביעילות cytotoxicity הפוטנציאליים של תרכובות יישומית, הופך שיטה זו טכניקה אידיאלית עבור בו-זמנית ניטור פעילות פרמקולוגית של cytotoxicity. דמויות 5-7 להמחיש להחליפן בתמונות של שלושת הקווים תא שנבדקו על נקודת הקצה הסופי (4.33 ח) כהפניה חזותית עבור האפקט של הטיפולים ב- net זרם LDL ו גם מראה בריא המורפולוגיה של תאי בעקבות של נבדק טיפולים. אנו ממליצים על בדיקה ויזואלית של כל תמונות מכל קידוח כדי להבטיח heathy המורפולוגיה של תאי לתקופת המחקר. לדוגמה, בנתונים לא מוצג, כאשר תמונות של HepG2 תאים שטופלו 80 μM Dynasore נבדקו, נצפו סימנים של ניתוק התא קצות התאים הופיעה להיות הרמת רלוונטי, רומז ניתוק התא בריכוזים גבוהים של Dynasore. יתר על כן, ריכוזים גבוהים של סימבסטטין (3-10 μM) גם הובילה מורפולוגיה שונה המציינת המושרה אפופטוזיס כפי שדווח על מינונים גבוהים של סטטינים45. פרוטוקול זה שימש לביצוע טיטור הטיפול Dynasore של 20-80 μM, סימבסטטין ב 0.5-10 μM ריכוז, בעקבות ששימשו התמונות תא לניתוח הבריאות של התאים ולקביעת ctotoxicity הפוטנציאליים של הטיפולים- ריכוזים שונים. תוצאות הציע את השימוש 40 μM עבור Dyansore ו- 1 μM של סימבסטטין כמו ריכוז אופטימלי.

לבסוף, אנו ממליצים לבצע מחקר טיטור צפיפות תא אם קו תא אחר להיבדק בשיטה זו כדי לזהות את מספר התא האופטימלי לכל טוב כדי להשיג תוצאות עקביות. מחקר אופטימיזציה צפיפות שלנו סלולרי הראה כי 10,000 תאים/היטב לתוך צלחת 24-ובכן להוביל לתוצאות זרם LDL עקבית עבור תאים HK2 ו- HCAE. חשוב לציין כי עבור זה LDL זרם assay באמצעות תא חי מערכת הדמיה, טפט של תאים שאינם confluent מופץ באופן שווה על הבארות רצוי כמו גושים של תאים עשוי להצמיח שגיאות הערכים הסופיים LDL מנורמל זרם. הסיבה לכך היא כי על נירמול הנתונים זרם, שטח אובייקט בשלב זה משמש כאמצעי של צפיפות התאים, פרמטר זה יושפעו לרעה כאשר התא גושים נוצרות. הבחנו כי תאים HepG2 יש נטייה גושים טופס כאשר נזרע על צפיפות גבוהה יותר 5,000 תאים/טוב גרימת התוצאות זרם לא עקבי; לכן, השתמשנו תאים 5,000 לכל טוב לתוך צלחת 24-טוב כמו צפיפות מיטבית עבור תאים HepG2.

באופן קולקטיבי, השיטה שלנו מספק פלטפורמה תפוקה בינונית-גבוהה לסינון את פעילות פרמקולוגית ואת cytotoxicity של תרכובות ויסות זרם LDL בו-זמנית. בשיטה זו ניתן להתאים בקלות לשימוש עם אחרים ליגנדים שכותרתו fluorescently מזין תא lysosomal כדי להעריך את ספיגת ליגנד בזמן אמת. פרוטוקול זה מציע מפרט עבור InCucyte חיים הדמיה, ניתוח מערכת, הפרוטוקול ניתן להתאים למערכות הדמיה חלופיים, כגון Cellomics.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים כדי בלאס: המכון הלאומי לבריאות (R56HL132209 ו- 1R01HL140468), מכון המחקר של הלב מיאמי. KY היא נמען האחווה האמריקאי הלב האגודה Predoctoral (18PRE33960070). תאים HepG2 נמסרו באדיבות מאת ד ר עמנואל תומאס, אוניברסיטת מיאמי-מילר הספר לרפואה46,47,48.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pHrodo Red-LDL ThermoFisher Scientific L34356
HepG2 cells E. Thomas Lab, U. Miami HB-8065
MEM Sigma M0325
Sodium Pyruvate Sigma P5280
L-Glutamine 200 mM solution Sigma G7513
FBS Atlas Biologicals FP-0500-A
HK2 cells ATCC CRL-2190
Keratinocyte SFM media kit Gibco 17005-042
Primary Coronary Artery Endothelial Cells ATCC PCS-100-020
Vascular Cell Basal Medium ATCC PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-VEGF ATCC PCS-100-041
Human Lipoprotein Deficient Serum Millipore LP4
PBS Sigma D8537
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056
Trypsin-EDTA (0.05%) Gemini Bio-Products 400-150
Trypsin Neutralizing Solution ATCC PCS-999-004
24 well plate Falcon 353226
40 μM mesh cell strainer VWR 10199-654
15 mL conical tubes VWR 89039-666
50 mL conical tubes VWR 89039-658
Trypan Blue Staining (0.4%) Life Technologies T10282
Counting Slides Bio-Rad 145-0011
Incucyte Zoom Sartorius Zoom Imaging and analysis platform
Dynasore Hydrate Sigma D7693
PCSK9 Recombinant Protein Cayman Chemicals 20631

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
  2. Trevisan, R., Dodesini, A. R., Lepore, G. Lipids and renal disease. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (4), Suppl 2 145-147 (2006).
  3. Tall, A. R., Yvan-Charvet, L. Cholesterol, inflammation and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 15 (2), 104 (2015).
  4. Dedoussis, G. V., Schmidt, H., Genschel, J. LDL-receptor mutations in Europe. Human Mutation. 24 (6), 443-459 (2004).
  5. Sasaki, K., et al. ATP-binding cassette transporter A subfamily 8 is a sinusoidal efflux transporter for cholesterol and taurocholate in mouse and human liver. Molecular Pharmaceutics. , (2018).
  6. Storch, J., Xu, Z. Niemann-Pick C2 (NPC2) and intracellular cholesterol trafficking. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (7), 671-678 (2009).
  7. Jansen, P. J., et al. Absence of ApoE upregulates murine brain ApoD and ABCA1 levels, but does not affect brain sterol levels, while human ApoE3 and human ApoE4 upregulate brain cholesterol precursor levels. Journal of Alzheimer's Disease. 18 (2), 319-329 (2009).
  8. Girard, E., et al. The dynamin chemical inhibitor dynasore impairs cholesterol trafficking and sterol-sensitive genes transcription in human HeLa cells and macrophages. PLoS One. 6 (12), 29042 (2011).
  9. Robinet, P., et al. Dynamin is involved in endolysosomal cholesterol delivery to the endoplasmic reticulum: role in cholesterol homeostasis. Traffic. 7 (7), 811-823 (2006).
  10. Macia, E., et al. Dynasore, a cell-permeable inhibitor of dynamin. Developmental Cell. 10 (6), 839-850 (2006).
  11. Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the LDLR and LDL-cholesterol. Journal of Biological Chemistry. , (2004).
  12. Qian, Y. -W., et al. Secreted PCSK9 downregulates low density lipoprotein receptor through receptor-mediated endocytosis. Journal of Lipid Research. 48 (7), 1488-1498 (2007).
  13. Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
  14. Goldstein, J. L., Brown, M. S. History of discovery: the LDL receptor. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (4), 431 (2009).
  15. Stephan, Z. F., Yurachek, E. C. Rapid fluorometric assay of LDL receptor activity by DiI-labeled LDL. Journal of Lipid Research. 34 (2), 325-330 (1993).
  16. Fisher, T. S., et al. Effects of pH and low density lipoprotein (LDL) on PCSK9-dependent LDL receptor regulation. Journal of Biological Chemistry. 282 (28), 20502-20512 (2007).
  17. Atrahimovich, D., Khatib, S., Sela, S., Vaya, J., Samson, A. O. Punicalagin induces serum low-density lipoprotein influx to macrophages. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, (2016).
  18. Xu, M., et al. δ-Tocopherol reduces lipid accumulation in Niemann-Pick type C1 and Wolman cholesterol storage disorders. Journal of Biological Chemistry. 112, (2012).
  19. Bonilla, D. L., et al. Autophagy regulates phagocytosis by modulating the expression of scavenger receptors. Immunity. 39 (3), 537-547 (2013).
  20. Guo, M., et al. Apelin-13 Decreases Lipid Storage in Hypertrophic Adipocytes In vitro Through the Upregulation of AQP7 Expression by the PI3K Signaling Pathway. Medical Science Monitor : International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 20, 1345-1352 (2014).
  21. Guillemot, J., Asselin, M. C., Susan-Resiga, D., Essalmani, R., Seidah, N. G. Deferoxamine stimulates LDLR expression and LDL uptake in HepG2 cells. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (3), 600-608 (2016).
  22. Javitt, N. B. Hep G2 cells as a resource for metabolic studies: lipoprotein, cholesterol, and bile acids. The FASEB Journal. 4 (2), 161-168 (1990).
  23. Mullen, P. J., Lüscher, B., Scharnagl, H., Krähenbühl, S., Brecht, K. Effect of simvastatin on cholesterol metabolism in C2C12 myotubes and HepG2 cells, and consequences for statin-induced myopathy. Biochemical Pharmacology. 79 (8), 1200-1209 (2010).
  24. McNutt, M. C., et al. Antagonism of secreted PCSK9 increases low density lipoprotein receptor expression in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (16), 10561-10570 (2009).
  25. Scharnagl, H., et al. Effect of atorvastatin, simvastatin, and lovastatin on the metabolism of cholesterol and triacylglycerides in HepG2 cells. Biochemical Pharmacology. 62 (11), 1545-1555 (2001).
  26. Scharnagl, H., et al. The effects of lifibrol (K12. 148) on the cholesterol metabolism of cultured cells: evidence for sterol independent stimulation of the LDL receptor pathway. Atherosclerosis. 153 (1), 69-80 (2000).
  27. Chan, J. C., et al. A proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 neutralizing antibody reduces serum cholesterol in mice and nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (24), 9820-9825 (2009).
  28. Ding, W., et al. Osteopontin deficiency ameliorates Alport pathology by preventing tubular metabolic deficits. JCI Insight. 3 (6), (2018).
  29. Herman-Edelstein, M., Scherzer, P., Tobar, A., Levi, M., Gafter, U. Altered renal lipid metabolism and renal lipid accumulation in human diabetic nephropathy. Journal of Lipid Research. 55 (3), 561-572 (2014).
  30. Su, H., et al. Lipid Deposition in Kidney Diseases: Interplay Among Redox, Lipid Mediators, and Renal Impairment. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (10), 1027-1043 (2018).
  31. Agrawal, S., Zaritsky, J. J., Fornoni, A., Smoyer, W. E. Dyslipidaemia in nephrotic syndrome: mechanisms and treatment. Nature Reviews Nephrology. 14 (1), 57 (2018).
  32. Babiak, J., Rudel, L. L. Lipoproteins and atherosclerosis. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 1 (3), 515-550 (1987).
  33. Wang, H. H., Garruti, G., Liu, M., Portincasa, P., Wang, D. Cholesterol and Lipoprotein Metabolism and Atherosclerosis: Recent Advances in Reverse Cholesterol Transport. Annals of Hepatology. 16 (1), 28-42 (2018).
  34. Preta, G., Cronin, J. G., Sheldon, I. M. Dynasore-not just a dynamin inhibitor. Cell Communication and Signaling. 13 (1), 24 (2015).
  35. Horton, J. D., Cohen, J. C., Hobbs, H. H. Molecular biology of PCSK9: its role in LDL metabolism. Trends in Biochemical Sciences. 32 (2), 71-77 (2007).
  36. Abifadel, M., et al. Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia. Nature Genetics. 34 (2), 154 (2003).
  37. Goldstein, J. L., Brown, M. S. Regulation of the mevalonate pathway. Nature. 343 (6257), 425 (1990).
  38. Dong, B., Wu, M., Cao, A., Li, H., Liu, J. Suppression of Idol expression is an additional mechanism underlying statin-induced up-regulation of hepatic LDL receptor expression. International Journal of Molecular Medicine. 27 (1), 103-110 (2011).
  39. Song, K. H., Kim, Y. H., Im, A. -R., Kim, Y. H. Black Raspberry Extract Enhances LDL Uptake in HepG2 Cells by Suppressing PCSK9 Expression to Upregulate LDLR Expression. Journal of Medicinal Food. , (2018).
  40. Chan, J. C., et al. A proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 neutralizing antibody reduces serum cholesterol in mice and nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9820-9825 (2009).
  41. Tabas, I., Williams, K. J., Borén, J. Subendothelial lipoprotein retention as the initiating process in atherosclerosis: update and therapeutic implications. Circulation. 116 (16), 1832-1844 (2007).
  42. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
  43. Brown, M. S., Goldstein, J. L. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell. 89 (3), 331-340 (1997).
  44. Horton, J. D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver. The Journal of Clinical Investigation. 109 (9), 1125-1131 (2002).
  45. Tavintharan, S., et al. Reduced mitochondrial coenzyme Q10 levels in HepG2 cells treated with high-dose simvastatin: A possible role in statin-induced hepatotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. 223 (2), 173-179 (2007).
  46. Thomas, E., et al. HCV infection induces a unique hepatic innate immune response associated with robust production of type III interferons. Gastroenterology. 142 (4), 978-988 (2012).
  47. Thomas, E., Liang, T. J. Experimental models of hepatitis B and C-new insights and progress. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (6), 362 (2016).
  48. Yoneda, M., et al. Hepatitis B Virus and DNA Stimulation Trigger a Rapid Innate Immune Response through NF-κB. The Journal of Immunology. , 1502677 (2016).

Tags

ביולוגיה גיליון 141 ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה LDLR זרם LDL ספיגת LDL Dynasore סימבסטטין PCSK9 רקומביננטי dynamin ליפידים כולסטרול טרשת עורקים.
ספיגת כולסטרול LDL Assay באמצעות תא חי הדמיה ניתוח עם התא לניטור תקינות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ritter, P., Yousefi, K., Ramirez,… More

Ritter, P., Yousefi, K., Ramirez, J., Dykxhoorn, D. M., Mendez, A. J., Shehadeh, L. A. LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring. J. Vis. Exp. (141), e58564, doi:10.3791/58564 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter