Summary
Dit protocol biedt een efficiënte aanpak voor het meten van LDL cholesterol opname met real-time toestroom tarieven met behulp van een levende cel imaging systeem in verschillende celtypen. Deze techniek biedt een platform voor het scherm van de farmacologische activiteit van verbindingen op het gebied van LDL toestroom terwijl monitoring voor cel morfologie en vandaar potentiële cytotoxiciteit.
Abstract
De regulering van de LDL cholesterol opname via LDLR-gemedieerde endocytose is een belangrijk gebied van studie in verschillende grote pathologieën waaronder stofwisselingsziekte, hart-en vaatziekten en nieraandoeningen. Op dit moment is er geen beschikbare methode te beoordelen LDL opname terwijl tegelijkertijd toezicht op voor de gezondheid van de cellen. De huidige studie presenteert een protocol, met behulp van een levende cel imaging analysesysteem, te verwerven van de periodieke metingen van LDL toestroom met gelijktijdige monitoring voor de gezondheid van de cel. Deze nieuwe techniek wordt in een vier uur durende tijdsverloop in drie menselijke cellijnen (hepatische, renale tubulaire epitheliale en coronaire slagader endotheliale cellen) getest. De gevoeligheid van deze techniek is bovendien gevalideerd met bekende LDL opname remmers, Dynasore en recombinant PCSK9 eiwit, alsook door een LDL opname promotor, simvastatine. Samen genomen, biedt deze methode een medium tot hoge doorvoer platform voor gelijktijdig screening farmacologische activiteit, alsmede het toezicht op de morfologie van de cel, vandaar cytotoxiciteit van verbindingen regulering van de toestroom van de LDL. De analyse kan worden gebruikt met verschillende beeldvormende systemen en analytische software.
Introduction
De LDL Low Density Lipoprotein LDLR Receptor-gemedieerde endocytose is een belangrijk gebied van studie, aangezien circulerende LDL-cholesterol waarden de kern van hart-en vaatziekten1, nier ziekte2 evenals een verscheidenheid van inflammatoire vormen 3 van de ziekten en genetische aandoeningen met mutaties in cholesterol vervoeren genen4,,5,,6,7. Studies in LDLR-gemedieerde cholesterol toestroom hebben geleid tot de identificatie van meerdere onderzoek-hulpprogramma's, zoals Dynamin-remmers waaronder de chemische Dynasore8,9,10, evenals LDL-regulering eiwitten zoals Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin Typ 9 (PCSK9)11,12.
De LDL-LDLR endocytose traject begint met het vastleggen van de LDL-LDLR-complex op het celoppervlak in clathrin beklede kuilen13. Blaasjes worden dan gevormd door invagination van de oppervlakte celmembraan internalisering van de LDL-LDLR-complex in de vacuolen voor transport binnen de cel. Aangezien de gevormde vesikel in vroege en vervolgens late Endosomen rijpt, druppels de pH in de late endosome, veroorzaakt door scheiding van het LDL uit de receptor14. In het verleden, zijn de methoden van kwantificering van LDL toestroom afhing van radio-geëtiketteerden 125-LDL co incubatie met cellen en latere extractie van de radioactief gemerkt proteïne uit cellen voor kwantificering15. Dit werd vervolgens vervangen door het gebruik van fluorescently geëtiketteerde LDL eiwitten zoals DiI-LDL, en latere immunokleuring of extractie van eiwitten voor fluorescerende lezingen met een spectrofotometer of plaat lezer15,16. Fluorescently geëtiketteerd is LDL ook gebruikt in fluorescentie-activated cell sorting (FACS) voor analyse van internalisering van de LDL en cel oppervlakte LDL bindende17. Terwijl deze methoden toestaan voor het verzamelen van gegevens na de behandeling, is toezicht op de levensvatbaarheid van de cellen tijdens de behandeling niet mogelijk.
De zure pH in de late endosome maakt het gebruik van een pH-geactiveerde fluorescerende LDL sonde zoals pHrodo Red LDL die na internalisering18,19 fluoresceert. Deze eigenschap zorgt voor een continue tijdsverloop van LDL opname beoordeling in levende cellen. Dit protocol maakt daarom gebruik van pHrodo Red-LDL fluorescentie imaging in een levende cel analyse naar serieel maatregel LDL opname met gelijktijdige monitoring voor de gezondheid van de cel. De resultaten geven de betrouwbaarheid van deze nieuwe techniek als getest in een vier uur durende tijdsverloop in drie verschillende menselijke cellijnen, menselijke hepatische carcinoom (HepG2) cellen, menselijke renale epitheliale cellen van de (HK2) en menselijke coronaire arteriële endotheliale cellen (HCAEC ). Deze cellijnen zijn klinisch significante LDL klaring20,21,22,23,24,25,26,27 , nier ziekte28,29,30,31, en hart-en vaatziekten32,33, respectievelijk. Naast het controleren van de LDL-instroom, neemt dit protocol behandeling met twee bekende remmers van de opname van het LDL, Dynasore hydraat en recombinant PCSK9 eiwit, alsmede een statine inductor van LDLR meningsuiting en LDL opname, simvastatine. Dynasore en recombinant PCSK9 elk werken via verschillende wegen te verminderen LDL opname.
Dynasore is een klein molecuul inhibitor van Dynamins10 en LDL opname vermindert door het blokkeren van clathrin-afhankelijke endocytose van LDL-LDLR complex10,34. Recombinant PCSK9, aan de andere kant, is een lid van peptidase S8 familie die bindt aan LDLR en remt de recycling naar het celoppervlak na het loslaten van LDL van de verinnerlijkte complex door het blokkeren van de vereiste conformationele veranderingen35,36 . Verminderde oppervlakte LDLR celdichtheid leidt uiteindelijk tot lagere LDL opname door de cel. Statines, zijn terwijl het direct blokkeren van de 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym (HMG-CoA) reductase enzymen en dus de biosynthese van cholesterol, ook bekend te upregulate de expressie van LDLR25,38 leidt tot verhoogde LDL opname. De gevoeligheid van dit protocol is gevalideerd door het detecteren van aanzienlijke vermindering in LDL toestroom in drie klinisch relevante menselijke cellijnen, HK2, HepG2 en HCAECs, door Dynasore en/of recombinant PCSK9, en een duidelijke stijging van de LDL opname in de cellen van de HepG2 door Simvastatine in een vier uur durende tijd cursus met monitoring voor cell morfologie/gezondheid. Tezamen, biedt deze methode een platform voor medium tot hoge doorvoersnelheid om gelijktijdig te screenen de farmacologische activiteit en de cytotoxiciteit van verbindingen regulering van LDL opname in levende cellen.
Protocol
1. het zaaien van cellen in een 24-well-Plate
- Media uit de cellen gecombineerd, wassen van de cellen met 5 mL van Dubelco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (dPBS) en de dPBS gecombineerd. Voor HepG2 cellen in een schotel van 100 mm, gebruik van 0,25% 1,5 mL trypsine/EDTA, en voor HK2 cellen of HCAECs met 1,5 mL trypsine/EDTA-oplossing 0,05% los van de cellen.
- Incubeer de plaat in een incubator 37 ° C gedurende 4 minuten of totdat de cellen zijn vrijstaand. Neutraliseer trypsine na een incubatie van 4 minuten door toevoeging van 3 mL van volledige media voor HepG2 en HK2 of 3 mL trypsine neutraliseren van oplossing, dPBS plus 5% foetale runderserum (FBS), voor HCAEC cellen.
- Breng de cellen in 15 mL conische buizen en centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 min, gecombineerd de media en resuspendeer de pellet cel in volledige media.
- Filtreer de celsuspensie zachtjes door een zeef mesh 40 μm te breken cel klontjes. De cellen niet door de zeef wassen.
- Cellen tellen en ze op een geoptimaliseerde dichtheid plaat. Bijvoorbeeld leiden 5.000 cellen per putje van HepG2 cellen of 10.000 cellen per putje van HK2 cellen of HCAECs in een 24-well-plate tot optimale resultaten.
- Incubeer de plaat 's nachts bij 37 ° C om de cellen te koppelen.
- De volgende dag, wijzigt de cel media als u wilt baseren van media voor de cellijn (zonder FBS) plus 5% Lipo-eiwit tekort Serum (LPDS) of laag (2%) FBS media afhankelijk van de behandeling (zie 1.7). Vervolgens blijven incubatie gedurende 24u de cellen verhongeren. Gebruik 500 μL van totale media per putje in een 24-well-plate.
- De cellen in één van drie manieren behandelen: toevoegen van 10 µg/mL rPCSK9 (of voertuig) en de cellen aan de incubator van de 37 ° C gedurende 1 uur, 40 µM van Dynasore hydraat (of voertuig, dimethylsulfoxide) toevoegen en de cellen terug te keren naar de incubator 37 ° C gedurende 10 minuten terug te keren , of Voeg 1 µM simvastatine (of voertuig, dimethylsulfoxide) en de cellen terug te keren naar de 37 ° C incubator voor 12, 18 of 24 uur. Gebruik van media met 5% LPDS voor rPCSK9 of Dynasore behandelingen. Gebruik laag (2%) FBS media of media met 5% LPDS simvastatine behandelingen.
Opmerking: Behandeling van de cellen met de gewenste verbindingen kan worden gedaan op het moment van media wijzigen voor de hongerdood van lipoproteïne (stap 1.6) voor experimenten op lange termijn, of vóór de analyse voor korte termijn experimenten. U kunt ook kunnen aangepaste behandeling tijden op basis van het type en het doel van de experimenten worden gekozen. - Voeg vervolgens 5 µL van pHrodo rood gemerkte LDL (1 mg/mL stockoplossing) toe aan elk putje te verkrijgen van een eindconcentratie van 10 µg/mL. Verwijder alle bubbels daarna, voorzichtig de putjes.
2. levende cel analyse
- Onmiddellijk na het toevoegen van de gelabelde LDL, plaatst u de plaat in de levende cel analyse systeem incubator (Zie Tabel van materialen) en laat de plaat naar equilibreer gedurende 15 minuten om condensatie in de plaat.
- In de tussentijd, open de software en de scan te plannen door het vaartuig bezit van de plaat toe te voegen. Afbeelding 16 beelden per putje op 10 X voor 4 uur met de kanalen rood en fase intervallen 1 uur.
- De plattegrond van een plaat te gebruiken voor verwerking van de gegevens maken.
- Klik op de tab Eigenschappen Kies de plaat kaart. Ingang van het celtype en behandelingen in het tabblad verbindingen .
- Klik op het tabblad van de regio's , selecteer elke set wordt gerepliceerd en opslaan als regio's.
3. analyseparameters instellen
- Zodra een experimentele run voltooid is, maakt u een afbeelding instellen in de software naar de computer te kwantificeren van elke parameter opnemen in het tellen van de trein.
- In de software, opent u de weergave van de plaat in het vak Analyse baan Utilities en kies vervolgens maken of toevoegen aan de foto collectie.
- Nieuwe foto collectieselecteren, typ een naam voor de foto-collectie en de kanalen rood en fase door het controleren van de selectievakjes in naast de kanalen kiezen.
- 5 meer foto's te selecteren en toevoegen aan foto collectie door toe te voegen aan de huidige afbeelding-collectie.
- Een definitie van verwerking voor de cellen maken. Tabel 1 bevat de parameters voor de cel van het HepG2, HK2 en HCAE verwerking van definities voor deze LDL toestroom protocol.
- Kies in het vak Analyse baan Utilities Nieuwe definitie van de verwerking. Kies de foto-collectie met de naam in stap 2.1.2 van de drop-down menu. Voer de parameters voor het soort cellen uit tabel 1.
- Gebruik de drop-down menu om te selecteren Alle Previewin het voorbeeldvak.
- Controleer in het vak Analyse masker Rood Object masker vakken en de Samenvloeiing masker om het gebied opgenomen in de analyse voor de verwerking definitie weer te geven. Zie Figuur 1.
- Blader door de foto-collectie om ervoor te zorgen dat de cellen en LDL zijn opgenomen in het masker. Selecteer bestand en Opslaan van de definitie van de verwerking.
- Het analyseren van de reeks beelden van de experimentele run.
- Open het experiment in plaat weergave. Kies in het vak Analyse baan Utilities Lanceren nieuwe analyse baan. Selecteer de opgeslagen verwerking definitie.
- Naam van de analyse-baan, kies het tijdsbereik voor analyse en markeer de experimentele putten te analyseren. Klik op de knop starten .
4. analyse en verwerking van gegevens
- Zodra de analyse-uptaak voltooid is, moet u de gegevens exporteren:
- Selecteer de voltooide analysis en druk op bekijken. Kies Metrisch/grafiek exporterenin het menu hulpprogramma's .
- In de regio's -menu, kies Alle putjes, en in het menu groep om te krijgen de gemiddelde waarden voor elke set van putten als een groep kies wordt gerepliceerd en voor het exporteren van de individuele waarden van elk putje Kies geen.
- Kies in het menu rood Object metrisch de Totale rood Object geïntegreerde intensiteit (RCU x µm2/image). Deze parameter geeft de som van de tijd rood signaal intensiteit (in RCU) op het gebied van het rode signaal (in µm2) in alle afbeeldingen in elk putje, die correspondeert met de totale LDL ICT door de cellen.
- Klik op de knop Gegevens exporteren . Controleer gegevens opsplitsen in afzonderlijke beelden. De gegevens automatisch gekopieerd op een Klembord en kan worden geplakt in een nieuwe spreadsheet-bestand.
- Kies in het menu fase Object metrisch de Confluence (procent). Controleer gegevens opsplitsen in afzonderlijke beelden. Klik op de knop Gegevens exporteren . De gegevens automatisch gekopieerd op een Klembord en kan worden gekopieerd naar het werkbladbestand dat totale rood Object geïntegreerde intensiteit gegevens bevat.
- De omzetting van de percentage samenvloeiing van toepassing op totale oppervlakte met de volgende vergelijking.
Total fase gebied (µm2/image) = Confluence (%) × (hoogte van de afbeelding (Pixels) × resolutie) × (de breedte van de afbeelding (Pixels) × resolutie)
Opmerking: de samenvloeiing (%) parameter geeft aan de percentage samenvloeiing van de fase-oppervlakte per beeld dat overeenkomt met het gebied van de cellen in elk putje. Deze statistiek moet worden omgezet in de totale fase gebied voor elk individu beeld eens geëxporteerd. De afbeelding specificaties voor fase kanaal (afbeeldingshoogte, breedte en resolutie) moet worden gebruikt met de bovenstaande formule voor elk experimenteel vaartuig kunnen worden gevonden door te verwijzen naar Eigenschappen van het vaartuig onder Afbeelding kanalen. - Normaliseren totale rood Object geïntegreerde intensiteit aan de oppervlakte van de fase als berekende in 4.1.6 met behulp van de volgende formule voor elke afzonderlijke afbeelding te elimineren van de variabiliteit in de celdichtheid in de putjes.
- Verdeel de totale rood Object geïntegreerde (RCU x µm2/image) intensiteitswaarden van elke afbeelding door de overeenkomstige Fase oppervlakte (µm2/image) om LDL opname (RCU) waarden per beeld te verkrijgen.
- Vervolgens, gemiddelde de LDL opname (RCU) gegevens van alle beelden van elk putje te verkrijgen van de gemiddelde LDL-opname in elk putje en dan gemiddelden de LDL opname van alle de repliceren putten groep middelen te verkrijgen. Deze gegevens zijn de resultaatwaarden van de LDL-opname en kan worden gebruikt voor illustratie en statistische analyse met behulp van de software van keuze.
Representative Results
Live cel Imaging zorgt voor een betrouwbare bewaking van Cell gezondheid tijdens Cholesterol toestroom Studies in drie menselijke cellijnen
We gevalideerd onze assay in drie menselijke cellijnen die cholesterol homeostase verordening een grote pathofysiologische rol speelt, met inbegrip van menselijke hepatische carcinoom (HepG2) cellen, menselijke renale epitheliale cellen van de (HK2) en menselijke coronaire endotheliale cellen (HCAECs). We een levende cel imaging systeem gebruikt voor het uitvoeren van de bepaling van de opname LDL in een tijdsverloop van 4 h met seriële metingen met tussenpozen van 1 h. Onze resultaten wijzen erop dat alle celtypes getest verenigbaar waren met deze nieuwe techniek en het resultaat in de bochten met de continu opname van de LDL vermelding voor de duur van de studie van de toestroom met 4.33 h als het definitieve eindpunt (afbeelding 2). De gegevens van de toestroom afgebeeld in Figuur 2 werden verkregen door het normaliseren van de totale pHrodo Red-geëtiketteerden LDL fluorescentie (totaal rood object geïntegreerd intensiteit per beeld in RCU x µm2/afbeelding) aan de cel totaal gebied in elke afbeelding van elk putje (fase objectgebied per beeld in µ m2/image) te elimineren van de variabiliteit in de celdichtheid in de putjes. Bovendien, voor het valideren van de gevoeligheid van de LDL toestroom test met het oog op de screening van verbindingen op het gebied van LDL cholesterol opname, we gebruikten twee positieve controles bekend dat remt LDL toestroom, Dynasore en rPCSK9, en een positieve controle bekend voor het opwekken van LDL opname, simvastatine. Gevalideerd door onze resultaten, na behandeling met Dynasore en rPCSK9, alledrie getest menselijke cellijnen (HepG2, HK2 en HCAEC) toonde aanzienlijke vermindering in LDL instroom over een tijdsverloop van 4 h (Figuur 2A-C). Figuur 2 ziet u bijvoorbeeld dat de toestroom van LDL is verminderd in HepG2 cellen met behandeling van de Dynasore in de tijdsverloop, in vergelijking met de cellen die zijn behandeld met DMSO; terwijl de DMSO als het voertuig besturingselement voor Dynasore controle geen significant effect op LDL toestroom in vergelijking met de onbehandelde controlegroep hadden. Bovendien, onze bevindingen toonde een duidelijke toename in LDL opname door cellen van de HepG2 na de behandeling met simvastatine (Figuur 3), ter ondersteuning van de gevoeligheid van deze methode voor het detecteren van belangrijke wijzigingen in de LDL-instroom. Over het punt 4.5 h tijd, dat een typische tijd in LDL opname studies is, is de toestroom van LDL aanzienlijk verminderd met ofwel Dynasore ofwel rPCSK9 behandeling en steeg met Simvastatin behandeling (Figuur 4).
Een groot voordeel aan het gebruik van levende cellen imaging voor LDL opname studies is dat dit systeem biedt real-time beelden van de cellen in elk putje die kunnen worden gebruikt om te controleren van potentiële cytotoxiciteit van de onderzochte verbindingen. 5-7 cijfers illustreren representatieve beelden van de drie cellijnen onderzocht bij de eerste tijd (0.33 h) en definitieve eindpunt (4.33 h) als een visuele referentie voor de netto instroom van de LDL. De beelden bevestigen de normale morfologie van de cellen na Dynasore of rPCSK9 behandelingen, met vermelding van zowel de doeltreffendheid en de veiligheid van deze verbindingen.
Levende cel analyse geeft betrouwbare seriële kwantitatieve Cholesterol toestroom metingen met diverse behandelingen
Een groot voordeel van het gebruik van dit protocol met een levende cel imaging systeem is de mogelijkheid om het verzamelen van gegevens in de tijdsverloop en vergelijk LDL toestroom op meerdere tijdstippen in plaats van slechts één punt van de laatste tijd zo traditioneel gedaan. Met behulp van dit protocol, we kunnen zijn voor de berekening van het percentage reductionin LDL toestroom op de RD Session Host tijdstip en op 1U tijdstippen gedurende het tijdsverloop. Tabel 2 geeft een overzicht van de verlaging van LDL toestroom in drie geteste menselijke cellijnen na voorbehandeling van het 10 min met 40 µM Dynasore of 1 h voorbehandeling met 10 µg/mL rPCSK9. 4.33 uur als het eindpunt van de definitieve studie, behandeling met Dynasore op 40 µM aanzienlijk verminderd LDL toestroom in HepG2 cellen, HK2 cellen en HCAECs door 53, 68% tot 54%, respectievelijk (Tabel 2A-C) en behandeling met rPCSK9 bij 10 µg/mL geleid tot 55% vermindering LDL instroom in de HK2 cellen (tabel 2B). Naast het kwantificeren van de terminal tijdstip zoals in traditionele testen, kunnen we een kwantitatieve analyses uit te voeren in de verlaging van de LDL toestroom als gevolg van behandeling op elk tijdstip van het experiment. Tabel 2B ziet u bijvoorbeeld dat behandeling met rPCSK9 in de HK2 cellen in een daling van LDL opname door 79% bij 1,33 h, 67% bij 2,33 h resulteerden, 59% bij 3,33 h behandeling in vergelijking met onbehandelde cellen post. Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor de kwantitatieve analyse van LDL instroom na de behandeling.
Figuur 1 : Verwerking van definitie masker. Representatieve beelden van HK2 cellen worden afgebeeld na de toepassing van de definitie van de geschikte procédés (Zie tabel 1). AreHK2 cellen zonder (A), maskeren met fase-Maskapplied (B), weergegeven met rood Object masker is toegepast (C), of met zowel de fase en de rode Object maskers toegepast (D). Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Verlaging van het LDL opname met behulp van live cell imaging systeem over een tijdsverloop 4.33 h. Live cell analyse systeem wordt gebruikt voor het meten van LDL toestroom in menselijke hepatische carcinoom (HEPG2) cellen (A), menselijke renale tubulaire epitheliale (HK2) cellen (B) en menselijke coronaire de endotheliale cellen van de (HCAE) (C). De cellen werden behandeld met Dynasore (10 minuten vóór de run) of rPCSK9 (1 uur vóór de vlucht) als positieve controle. DMSO werd gebruikt als een voertuig voor Dynasore behandelingen. Positieve controles aanzienlijk daalde de LDL toestroom in alle 3 cellijnen. LDL toestroom waarden werden verkregen door het normaliseren van de intensiteit van de totale rood object geïntegreerd (RCUxµm2/image) naar de totale fase-objectgebied (µm2/image). Gegevens zijn mean±SEM N = 6 putten/groep. Gegevens zijn representatief voor 2 of 3 onafhankelijke experimenten. p < 0,0001 vs leeg, en ###p < 0,0001 vs DMSO, met two-way ANOVA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Stijging van de LDL-opname met behulp van levende cellen imaging systeem over een tijdsverloop 4.33h. Live cell analyse systeem wordt gebruikt voor het meten van LDL toestroom in menselijke hepatische carcinoom (HEPG2) cellen. LDL opname is aanzienlijk verhoogd na behandeling met simvastatine voor 12u (A), 18 h (B) of 24 h (C) gebruik van media met 2% FBS. De punt van de tijd 24 h werd ook uitgevoerd met media met 5% LPDS (zonder FBS). DMSO werd gebruikt als negatieve controle. LDL toestroom waarden werden verkregen door het normaliseren van de intensiteit van de totale rood object geïntegreerd (RCU x µm2/image) naar de totale fase-objectgebied (µm2/image). Gegevens zijn mean±SEM N = 6 putten/groep. Gegevens zijn representatief voor een onafhankelijke experiment. p < 0,0001 vs DMSO, met behulp van de Student t-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Significante vermindering van de toestroom van de LDL door LDL opname-verlagende agenten op 4.3 h tijdstip. LDL toestroom is aanzienlijk verminderd in menselijke hepatische carcinoom (HepG2) cellen (A), menselijke renale tubulaire epitheliale (HK2) cellen (B) en menselijke coronaire endothelial (HCAE) cellen (C) na behandeling met LDL opname remmers Dynasore voor 10 min of rPCSK9 voor 1 uur. LDL toestroom is aanzienlijk gestegen met simvastatine in HepG2 cellen na 12, 18 of 24 h behandelingen (D). Gegevens zijn mean±SEM N = 6 putten/groep. Gegevens zijn representatief voor 2 of 3 onafhankelijke experimenten. p < 0,0001 met two-way ANOVA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Verminderd LDL toestroom in hepatocellulaire carcinoom (HepG2) cellen door LDL opname-verlagende agent, Dynasore. Representatieve beelden van de fase-object en een rood object voor HepG2 cellen zijn afgebeeld bij 0.33 h (linker panelen) en het eindpunt van de 4.33 h (juiste panelen) tonen gezonde status van cellen. 40 µM Dynasore, bekend te verminderen LDL-cholesterol de opname, werd gebruikt als positieve controle (C). Beelden werden genomen bij 10 X vergroting. Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 . Verminderd LDL toestroom in menselijke renale tubulaire epitheliale (HK2) cellen door LDL opname-verlagende agenten, Dynasore en rPCSK9. Representatieve beelden van de fase-object en een rood object voor HK2 cellen afgebeeld bij 0.33 h (linker panelen) en het eindpunt van de 4.33 h (juiste panelen) tonen status in orde krijgt van de cellen. 40 µM Dynasore (C), of 10 µg/mL rPCSK9 (D), bekend om te verminderen LDL cholesterol opname, werden gebruikt als positieve controle. Images zijn geschoten op 10 X vergroting. Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 . Verminderd LDL toestroom in menselijke coronaire endotheliale cellen (HCAECs) door LDL opname-verlagende agent, Dynasore. Representatieve beelden van de fase-object en een rood object voor HCAECs afgebeeld bij 0.33 h (linker panelen) en het eindpunt van de 4.33 h (juiste panelen) tonen status in orde krijgt van de cellen. 40 µM Dynasore, bekend te verminderen LDL-cholesterol de opname, werd gebruikt als positieve controle (C). Beelden werden genomen bij 10 X vergroting. Schaal bar = 100 µm. gegevens zijn mean±SEM N = 6 putten/groep. Gegevens zijn representatief voor 2 of 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Tabel 1: definitie verwerkingsparameters. Deze parameters zijn specifiek voor het systeem van de analyse in dit protocol gebruikt. Parameters moeten worden ingesteld om rode gebied in het rode kanaal en het gebied van de cel in het fase-kanaal te analyseren. Parameterinstellingen voor HepG2, HK2, HCAE cellijnen worden gepresenteerd.
Tabel 2: percentage verandering in LDL toestroom in HepG2, HK2 en HCAE cellen behandeld met Dynasore, rPCSK9, of simvastatine 4.3 h. (A) HepG2 cellen, cellen (B) HK2, (C) HCAE cellen en (D) HepG2 cellen.
Discussion
In het huidige protocol, we laten zien op het gebruik van levende cellen imaging als een nieuwe en effectievere methode voor het meten van real-time LDL opname in een tijdsverloop in verschillende menselijke cellijnen. Menselijke hepatische carcinoom (HepG2) cellen worden vaak gebruikt in studies screening voor cholesterol-verlagende therapeutics21,22,23,24,25,26, 39,40. Daarom kozen we dit celtype voor het testen van het vermogen van een levende cel imaging systeem voor LDL toestroom studies. Onze resultaten wijzen erop dat HepG2 cellen verenigbaar zijn met deze nieuwe techniek en het resultaat in een bocht van de sigmoid-achtige continu LDL-opname voor de duur van de toestroom bepaling die aangeeft tot 4.33 h als het definitieve eindpunt (figuur 2A en Figuur 3 ).
Homeostase van cholesterol speelt een belangrijke rol in de pathofysiologie van verschillende nephropathies. Inderdaad, cholesterol accumulatie in renal weefsel is een belangrijke bijdrage aan de renale fibrose leiden tot chronische nierziekte en is een grote pathologie in verschillende nephropathies28,29,30,31. Vandaar, wij onze methode in menselijke renale epitheliale cellen van de (HK2) onderzocht als een populaire en betrouwbare cellijn gebruikt op het gebied van Nefrologie. Onze gegevens ondersteunde ook de haalbaarheid van de levende cel imaging systeem voor het meten van LDL toestroom in HK2 cellen. Zoals afgebeeld in Figuur 2B, pakte HK2 cellen LDL cholesterol lineair gedurende de looptijd van de toestroom studie (4 uur).
Vanwege het belang van het metabolisme van cholesterol in de ontwikkeling en de progressie van aderverkalking32,33,41, de belangrijkste oorzaak van hart-en vaatziekten, die op zijn beurt de nummer 1 moordenaar wereldwijd is 42, we gericht op het valideren van onze werkwijze in een atherosclerose-relevante celtype. We gebruikten menselijke coronaire arteriële endotheliale cellen (HCAECs), zoals dit een van de eerste celtypen zijn te worden blootgesteld aan een belediging van de cholesterol in het lumen van de kransslagader van een patiënt van atherosclerose. Onze gegevens weergegeven in Figuur 2C geeft aan dat deze LDL toestroom methode ook effectief met HCAECs werkt. De resulterende grafiek is een sigmoid-achtige kromme vergelijkbaar met die van HepG2 cellen.
Om te testen op de geldigheid en de gevoeligheid van deze verbeterde LDL toestroom assay voor het screenen van stoffen beïnvloeden de opname van de LDL-cholesterol, gebruikten we drie besturingselementen, LDL opname-verlagende agenten Dynasore en rPCSK9 en LDL toestroom activator simvastatine. Hier, we de bovenstaande getrakteerd cellijnen (HepG2, HK2 en HCAECs) met geoptimaliseerde concentraties van Dynasore of rPCSK9 voorafgaand aan de toestroom bepaling vermeld. Onze resultaten toonden dat alle drie geteste cellijnen gereageerd op de behandelingen met aanzienlijke verlagingen in de LDL instroom in een 4-uur loop (Figuur 2). Bijvoorbeeld bij 4.33 h als het punt van de laatste keer, behandeling met Dynasore op 40 µM aanzienlijk verminderd LDL toestroom in HepG2 cellen, HK2 cellen en HCAECs door 53, 68% tot 54%, respectievelijk (p < 0,0001; Figuur 2 A-C en Tabel 2A-C). Daarnaast rPCSK9 bij 10 µg/mL veroorzaakt een duidelijke vermindering van 55% in LDL toestroom in HK2 cellen (p < 0,0001; Figuur 2 B en tabel 2B). Onze bevindingen bleek bovendien dat behandeling van HepG2 cellen met Simvastatin in een aanzienlijke stijging LDL opname (Figuur 3) resulteerde, ter ondersteuning van de gevoeligheid van deze methode voor het detecteren van belangrijke wijzigingen in de LDL-instroom. Studies van behandeling met rPCSK9 in HepG2 en HCAEC cellen zijn niet opgenomen in dit protocol als rPCSK9 wordt gebruikt als een extra controle behandeling met goed gedocumenteerde resultaten, maar is duur om te kopen in kleine hoeveelheden. RPCSK9 werd daarom alleen gebruikt voor het valideren van dit protocol in HK2 cellen.
Levende cel imaging analyse, samen met de functionele en tijdige meting van LDL toestroom, toegestaan voor het continue monitoring van de gezondheid en de morfologie van de cellen. Dit voordeel kan efficiënt mogelijke cytotoxiciteit van de toegepaste verbindingen, waardoor deze methode een ideale techniek voor gelijktijdig toezicht farmacologische activiteit en cytotoxiciteit detecteren. Cijfers 5-7 illustreren representatieve beelden van de drie geteste cellijnen aan het definitieve eindpunt (4.33 h) als een visuele referentie voor het effect van de behandelingen op de netto instroom van de LDL en toont ook de gezonde morfologie van de cellen na de geteste behandelingen. Wij raden de visuele inspectie van alle afbeeldingen van elk putje te verzekeren van de Heide morfologie van de cellen voor de duur van de studie. Bijvoorbeeld in de gegevens niet weergegeven, wanneer de beelden van HepG2 cellen met 80 μM behandeld Dynasore werden geïnspecteerd, we aanwijzingen van mobiele-detachement waargenomen zoals de randen van de cellen leek te worden opstijgen van de plaat, suggereren mobiele-Detachement bij de hogere concentraties van Dynasore. Bovendien, hoge concentraties van simvastatine (3-10 μM) ook geleid tot een gewijzigde morfologie die aangeeft veroorzaakte apoptosis zoals gemeld voor hoge doseringen van statines45. Dit protocol werd gebruikt voor het uitvoeren van een titratie van de behandeling van de Dynasore bij 20-80 μM, en Simvastatin bij 0.5-10 μM concentratie, waarna de cel-beelden werden gebruikt voor het analyseren van de gezondheid van de cellen en bepalen potentiële ctotoxicity van de behandelingen op verschillende concentraties. Resultaten voorgesteld het gebruik van 40 μM voor Dyansore en 1 μM voor simvastatine als optimale concentraties.
Tot slot, is het raadzaam een cel dichtheid titratie studie uitvoeren als een andere cellijn wil met deze methode worden getest teneinde de optimale celaantal per putje om consistente resultaten te verkrijgen. Onze cel dichtheid optimalisatie studie toonde aan dat 10.000 cellen per putje in een 24-well-plate tot consistente resultaten van de toestroom van de LDL voor HK2 en HCAE cellen leiden. Het is belangrijk op te merken dat voor deze LDL toestroom assay met behulp van levende cellen imaging systeem, een monolayer van niet-heuvels cellen gelijkmatig verdeeld op de putten wenselijk is aangezien bosjes van cellen aanleiding tot fouten in de genormaliseerde LDL toestroom resultaatwaarden geven kunnen. De reden hiervoor is dat voor de normalisatie van de gegevens van de toestroom, de fase-objectgebied wordt gebruikt als een maatregel van de celdichtheid en deze parameter nadelig kan worden beïnvloed wanneer cel bosjes worden gevormd. We hebben vastgesteld dat cellen van de HepG2 hebben de neiging om vorm bosjes wanneer ontpit op dichtheid hoger dan 5.000 cellen per putje waardoor inconsistente toestroom resultaten; Dus, we gebruikten 5.000 cellen per putje in een 24-well-plate als optimale dichtheid voor HepG2 cellen.
Collectief, biedt onze methode een medium tot hoge doorvoer-platform voor het screenen van de farmacologische activiteit en de cytotoxiciteit van verbindingen LDL toestroom gelijktijdig te reguleren. Deze methode kan worden gemakkelijk aangepast voor gebruik met andere fluorescently-geëtiketteerden liganden die worden ingevoerd door de lysosomale compartiment te evalueren ligand opname in real-time. Terwijl dit protocol biedt specificaties voor InCucyte leven beeldvorming en analysesysteem, het protocol kan worden aangepast voor alternatieve imaging systemen zoals Cellomics.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies aan LAS: National Institute of Health (R56HL132209 en 1R01HL140468) en het onderzoeksinstituut voor hart van Miami. KY is een ontvanger van de American Heart Association predoctoraal Fellowship (18PRE33960070). HepG2 cellen werden beschikbaar gesteld door Dr Emmanuel Thomas, Universiteit van Miami-Miller School van geneeskunde46,47,48.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pHrodo Red-LDL | ThermoFisher Scientific | L34356 | |
| HepG2 cells | E. Thomas Lab, U. Miami | HB-8065 | |
| MEM | Sigma | M0325 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Sigma | G7513 | |
| FBS | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| HK2 cells | ATCC | CRL-2190 | |
| Keratinocyte SFM media kit | Gibco | 17005-042 | |
| Primary Coronary Artery Endothelial Cells | ATCC | PCS-100-020 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-VEGF | ATCC | PCS-100-041 | |
| Human Lipoprotein Deficient Serum | Millipore | LP4 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gemini Bio-Products | 400-150 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | ATCC | PCS-999-004 | |
| 24 well plate | Falcon | 353226 | |
| 40 μM mesh cell strainer | VWR | 10199-654 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
| Trypan Blue Staining (0.4%) | Life Technologies | T10282 | |
| Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | Zoom | Imaging and analysis platform |
| Dynasore Hydrate | Sigma | D7693 | |
| PCSK9 Recombinant Protein | Cayman Chemicals | 20631 |
References
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
- Trevisan, R., Dodesini, A. R., Lepore, G. Lipids and renal disease. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (4), Suppl 2 145-147 (2006).
- Tall, A. R., Yvan-Charvet, L. Cholesterol, inflammation and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 15 (2), 104 (2015).
- Dedoussis, G. V., Schmidt, H., Genschel, J. LDL-receptor mutations in Europe. Human Mutation. 24 (6), 443-459 (2004).
- Sasaki, K., et al. ATP-binding cassette transporter A subfamily 8 is a sinusoidal efflux transporter for cholesterol and taurocholate in mouse and human liver. Molecular Pharmaceutics. , (2018).
- Storch, J., Xu, Z. Niemann-Pick C2 (NPC2) and intracellular cholesterol trafficking. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (7), 671-678 (2009).
- Jansen, P. J., et al. Absence of ApoE upregulates murine brain ApoD and ABCA1 levels, but does not affect brain sterol levels, while human ApoE3 and human ApoE4 upregulate brain cholesterol precursor levels. Journal of Alzheimer's Disease. 18 (2), 319-329 (2009).
- Girard, E., et al. The dynamin chemical inhibitor dynasore impairs cholesterol trafficking and sterol-sensitive genes transcription in human HeLa cells and macrophages. PLoS One. 6 (12), 29042 (2011).
- Robinet, P., et al. Dynamin is involved in endolysosomal cholesterol delivery to the endoplasmic reticulum: role in cholesterol homeostasis. Traffic. 7 (7), 811-823 (2006).
- Macia, E., et al. Dynasore, a cell-permeable inhibitor of dynamin. Developmental Cell. 10 (6), 839-850 (2006).
- Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the LDLR and LDL-cholesterol. Journal of Biological Chemistry. , (2004).
- Qian, Y. -W., et al. Secreted PCSK9 downregulates low density lipoprotein receptor through receptor-mediated endocytosis. Journal of Lipid Research. 48 (7), 1488-1498 (2007).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. History of discovery: the LDL receptor. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (4), 431 (2009).
- Stephan, Z. F., Yurachek, E. C. Rapid fluorometric assay of LDL receptor activity by DiI-labeled LDL. Journal of Lipid Research. 34 (2), 325-330 (1993).
- Fisher, T. S., et al. Effects of pH and low density lipoprotein (LDL) on PCSK9-dependent LDL receptor regulation. Journal of Biological Chemistry. 282 (28), 20502-20512 (2007).
- Atrahimovich, D., Khatib, S., Sela, S., Vaya, J., Samson, A. O. Punicalagin induces serum low-density lipoprotein influx to macrophages. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, (2016).
- Xu, M., et al. δ-Tocopherol reduces lipid accumulation in Niemann-Pick type C1 and Wolman cholesterol storage disorders. Journal of Biological Chemistry. 112, (2012).
- Bonilla, D. L., et al. Autophagy regulates phagocytosis by modulating the expression of scavenger receptors. Immunity. 39 (3), 537-547 (2013).
- Guo, M., et al. Apelin-13 Decreases Lipid Storage in Hypertrophic Adipocytes In vitro Through the Upregulation of AQP7 Expression by the PI3K Signaling Pathway. Medical Science Monitor : International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 20, 1345-1352 (2014).
- Guillemot, J., Asselin, M. C., Susan-Resiga, D., Essalmani, R., Seidah, N. G. Deferoxamine stimulates LDLR expression and LDL uptake in HepG2 cells. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (3), 600-608 (2016).
- Javitt, N. B. Hep G2 cells as a resource for metabolic studies: lipoprotein, cholesterol, and bile acids. The FASEB Journal. 4 (2), 161-168 (1990).
- Mullen, P. J., Lüscher, B., Scharnagl, H., Krähenbühl, S., Brecht, K. Effect of simvastatin on cholesterol metabolism in C2C12 myotubes and HepG2 cells, and consequences for statin-induced myopathy. Biochemical Pharmacology. 79 (8), 1200-1209 (2010).
- McNutt, M. C., et al. Antagonism of secreted PCSK9 increases low density lipoprotein receptor expression in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (16), 10561-10570 (2009).
- Scharnagl, H., et al. Effect of atorvastatin, simvastatin, and lovastatin on the metabolism of cholesterol and triacylglycerides in HepG2 cells. Biochemical Pharmacology. 62 (11), 1545-1555 (2001).
- Scharnagl, H., et al. The effects of lifibrol (K12. 148) on the cholesterol metabolism of cultured cells: evidence for sterol independent stimulation of the LDL receptor pathway. Atherosclerosis. 153 (1), 69-80 (2000).
- Chan, J. C., et al. A proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 neutralizing antibody reduces serum cholesterol in mice and nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (24), 9820-9825 (2009).
- Ding, W., et al. Osteopontin deficiency ameliorates Alport pathology by preventing tubular metabolic deficits. JCI Insight. 3 (6), (2018).
- Herman-Edelstein, M., Scherzer, P., Tobar, A., Levi, M., Gafter, U. Altered renal lipid metabolism and renal lipid accumulation in human diabetic nephropathy. Journal of Lipid Research. 55 (3), 561-572 (2014).
- Su, H., et al. Lipid Deposition in Kidney Diseases: Interplay Among Redox, Lipid Mediators, and Renal Impairment. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (10), 1027-1043 (2018).
- Agrawal, S., Zaritsky, J. J., Fornoni, A., Smoyer, W. E. Dyslipidaemia in nephrotic syndrome: mechanisms and treatment. Nature Reviews Nephrology. 14 (1), 57 (2018).
- Babiak, J., Rudel, L. L. Lipoproteins and atherosclerosis. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 1 (3), 515-550 (1987).
- Wang, H. H., Garruti, G., Liu, M., Portincasa, P., Wang, D. Cholesterol and Lipoprotein Metabolism and Atherosclerosis: Recent Advances in Reverse Cholesterol Transport. Annals of Hepatology. 16 (1), 28-42 (2018).
- Preta, G., Cronin, J. G., Sheldon, I. M. Dynasore-not just a dynamin inhibitor. Cell Communication and Signaling. 13 (1), 24 (2015).
- Horton, J. D., Cohen, J. C., Hobbs, H. H. Molecular biology of PCSK9: its role in LDL metabolism. Trends in Biochemical Sciences. 32 (2), 71-77 (2007).
- Abifadel, M., et al. Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia. Nature Genetics. 34 (2), 154 (2003).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. Regulation of the mevalonate pathway. Nature. 343 (6257), 425 (1990).
- Dong, B., Wu, M., Cao, A., Li, H., Liu, J. Suppression of Idol expression is an additional mechanism underlying statin-induced up-regulation of hepatic LDL receptor expression. International Journal of Molecular Medicine. 27 (1), 103-110 (2011).
- Song, K. H., Kim, Y. H., Im, A. -R., Kim, Y. H. Black Raspberry Extract Enhances LDL Uptake in HepG2 Cells by Suppressing PCSK9 Expression to Upregulate LDLR Expression. Journal of Medicinal Food. , (2018).
- Chan, J. C., et al. A proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 neutralizing antibody reduces serum cholesterol in mice and nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9820-9825 (2009).
- Tabas, I., Williams, K. J., Borén, J. Subendothelial lipoprotein retention as the initiating process in atherosclerosis: update and therapeutic implications. Circulation. 116 (16), 1832-1844 (2007).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell. 89 (3), 331-340 (1997).
- Horton, J. D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver. The Journal of Clinical Investigation. 109 (9), 1125-1131 (2002).
- Tavintharan, S., et al. Reduced mitochondrial coenzyme Q10 levels in HepG2 cells treated with high-dose simvastatin: A possible role in statin-induced hepatotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. 223 (2), 173-179 (2007).
- Thomas, E., et al. HCV infection induces a unique hepatic innate immune response associated with robust production of type III interferons. Gastroenterology. 142 (4), 978-988 (2012).
- Thomas, E., Liang, T. J. Experimental models of hepatitis B and C-new insights and progress. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (6), 362 (2016).
- Yoneda, M., et al. Hepatitis B Virus and DNA Stimulation Trigger a Rapid Innate Immune Response through NF-κB. The Journal of Immunology. , 1502677 (2016).
