Summary
Denne protokol giver en effektiv tilgang til måling af LDL kolesterol optagelse med realtid tilstrømning priser ved hjælp af en levende celle imaging system i forskellige celletyper. Denne teknik giver en platform til at screene den farmakologiske aktivitet af forbindelser der påvirker LDL tilstrømning under kontrol for celle morfologi og dermed potentielle cytotoksicitet.
Abstract
Regulering af LDL kolesterol optagelse gennem LDLR-medieret endocytose er et vigtigt område af undersøgelse i forskellige vigtige patologier herunder stofskiftesygdom, hjerte-kar-sygdom og nyresygdom. I øjeblikket er der ingen tilgængelig metode til at vurdere LDL optagelse mens samtidig overvågning af sundheden for cellerne. Den nuværende undersøgelse præsenterer en protokol, ved hjælp af en levende celle imaging analysesystem, for at erhverve serielle målinger af LDL tilstrømning med samtidige overvågning for celle sundhed. Denne nye teknik er testet i tre menneskelige cellelinjer (hepatisk, renal tubulær epitel, og koronar arterie endotelceller) over en fire-timers kursus. Derudover er følsomheden i denne teknik valideret med velkendte LDL uptake hæmmere, Dynasore og rekombinante PCSK9 protein, samt af en LDL optagelse promotor, Simvastatin. Tilsammen, giver denne metode en medium til høj overførselshastighed platform for samtidig screening farmakologiske aktivitet samt overvågning af celle morfologi, dermed cytotoksicitet af forbindelser regulering LDL tilstrømning. Analysen kan anvendes med forskellige Billeddannende systemer og analytisk software.
Introduction
Low Density Lipoprotein Receptor LDLR-medieret LDL endocytose er et vigtigt område af undersøgelse, da cirkulerende LDL kolesterolniveauer er kernen i hjerte-kar-sygdom1, nyre sygdom2 samt en bred vifte af inflammatoriske sygdomme3 og genetiske sygdomme med mutationer i kolesterol transport gener4,5,6,7. Undersøgelser i LDLR-medieret kolesterol tilstrømning har ført til identifikation af flere forskningsværktøjer, såsom Dynamin-hæmmere, herunder den kemiske Dynasore8,9,10, samt regulering af LDL proteiner som Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin type 9 (PCSK9)11,12.
LDL-LDLR endocytose pathway begynder med binding af LDL-LDLR kompleks på cellens overflade i clathrin-belagt pitten13. Vesikler er så dannet af invagination af overflade cellemembranen internalisere LDL-LDLR komplekset i vacuoles for transport inde i cellen. Som den dannede vesikel modnes i begyndelsen og derefter sent endosomes, falder pH inde den sene endosome, forårsager afstandtagen af LDL fra dens receptor14. I fortiden afhang metoder til kvantificering af LDL tilstrømning radio-mærket 125-LDL Co inkubering med celler og efterfølgende udvinding af den radioaktivt mærkede protein fra celler for kvantificering15. Dette blev derefter erstattet af brugen af fluorescently mærket LDL proteiner som DiI-LDL, og efterfølgende immunfarvning eller udvinding af protein for fluorescerende aflæsninger ved hjælp af et spektrofotometer eller plade læser15,16. Fluorescently mærket er LDL også blevet brugt i fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) til analysen af internaliseringen af LDL og celle overflade LDL bindende17. Mens disse metoder giver mulighed for indsamling af data efter behandling, er overvågning levedygtigheden af cellerne under behandling ikke muligt.
Sure pH-værdi i de sene endosome tillader brug af en pH-aktiveret fluorescerende LDL sonde som pHrodo røde LDL, der fluorescerer efter internalisering18,19. Denne egenskab giver mulighed for en kontinuerlig tidsforløb af LDL optagelse vurdering i levende celler. Derfor, denne protokol udnytter pHrodo rød-LDL fluorescens imaging i en levende celle analyse seriefremstillede foranstaltning LDL optagelsen med samtidige overvågning for celle sundhed. Resultaterne indikerer pålideligheden af denne roman teknik som testet over en fire-timers kursus i tre forskellige menneskelige cellelinjer, menneskelige hepatisk karcinom (HepG2) celler, humane renal epitel (HK2) celler og menneskelige koronar arteriel endothelial celler (HCAEC ). Disse cellelinjer er klinisk signifikant til LDL clearance20,21,22,23,24,25,26,27 , nyre sygdom28,29,30,31, og hjertesygdomme32,33, henholdsvis. Ud over overvågning af LDL tilstrømningen, omfatter denne protokol behandling med to velkendte LDL uptake hæmmere, Dynasore hydrat og rekombinante PCSK9 protein samt et statin inducer af LDLR udtryk og LDL optagelse, simvastatin. Dynasore og rekombinante PCSK9 hver arbejde gennem forskellige veje til at reducere LDL optagelse.
Dynasore er et lille molekyle hæmmer af Dynamins10 og reducerer LDL optagelse ved at blokere clathrin-afhængige endocytose af LDL-LDLR komplekse10,34. Rekombinante PCSK9, på den anden side er medlem af peptidase S8 familien, der binder sig til LDLR og hæmmer dets genanvendelse til cellens overflade efter at slippe LDL fra internaliseret komplekset ved at blokere kræves konformationelle ændringer35,36 . Nedsat celle overflade LDLR tæthed fører i sidste ende til lavere LDL optagelse af cellen. Statiner, er mens direkte blokerer for 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym (HMG-CoA) reduktase enzym- og dermed kolesterol biosyntesen, også kendt for at upregulate udtryk for LDLR25,38 fører til øget LDL optagelse. Følsomheden af denne protokol er valideret ved at opdage væsentlige reduktioner i LDL tilstrømning i tre klinisk relevante menneskelige cellelinjer, HK2, HepG2 og HCAECs, af Dynasore og/eller rekombinante PCSK9, og en markant stigning i LDL optagelse i HepG2 celler ved Simvastatin i en fire-timers kursus med overvågning for celle morfologi/sundhed. Tilsammen, giver denne metode en medium til høj overførselshastighed platform for samtidigt screening farmakologiske aktivitet og cytotoksicitet af forbindelser regulering LDL optagelse i levende celler.
Protocol
1. såning celler i en 24-godt plade
- Opsug medier fra cellerne, cellerne vaskes med 5 mL af Dubelcos phosphat bufferet saltvand (dPBS) og Opsug dPBS. For HepG2 celler i en 100 mm parabol, bruge 1,5 mL 0,25% Trypsin/EDTA, og for HK2 celler eller HCAECs bruge 1,5 mL 0,05% Trypsin/EDTA-oploesning Adskil celler.
- Inkuber pladen i et 37 ° C inkubator for 4 minutter, eller indtil cellerne er frakoblet. Neutralisere trypsin efter en 4 minutters inkubation ved tilsætning af 3 mL af komplette medier for HepG2 og HK2 eller 3 mL trypsin neutralisere løsning, dPBS plus 5% føtal bovint serum (FBS), for HCAEC celler.
- Overføre cellerne i 15 mL koniske rør og centrifugeres ved 250 x g i 5 min, Aspirér medierne og genopslæmmes celle pellet i komplet media.
- Filtrere cellesuspension forsigtigt gennem et 40 μm mesh si til at bryde op celle klumper. Ikke vaske cellerne gennem sien.
- Tælle cellerne og plade dem på en optimeret tæthed. For eksempel, føre 5.000 celler pr. brønd HepG2 celler eller 10.000 celler pr. brønd HK2 celler eller HCAECs i en 24-godt plade til optimale resultater.
- Inkuber plade natten over ved 37 ° C at tillade celler til at vedhæfte.
- Den næste dag, ændre celle medier for at basere medier for cellelinje (uden FBS) plus 5% Lipo-Protein mangelfuld Serum (LPDER) eller lav (2%) FBS media afhængigt af behandlingen (Se 1.7). Derefter fortsætte inkubation i 24 timer til at sulte cellerne. Bruge 500 μL af total media pr. brønd i en 24-godt plade.
- Behandling af celler i en af tre måder: tilføje 10 µg/mL af rPCSK9 (eller køretøjet) og returnere celler til 37 ° C inkubator for 1 time, tilføje 40 µM af Dynasore hydrat (eller køretøj, dimethylsulfoxid) og returnere cellerne til 37 ° C inkubator i 10 minutter , eller tilføje 1 µM Simvastatin (eller køretøj, dimethylsulfoxid) og vende tilbage cellerne til 37 ° C inkubator 12, 18 eller 24 timer. Brug media med 5% LPDER til rPCSK9 eller Dynasore behandlinger. Vælg lav (2%) FBS medier eller medier med 5% LPDER Simvastatin behandlinger.
Bemærk: Behandling af celler med ønskede forbindelser kan ske på tidspunktet for media ændring af lipoprotein sult (trin 1,6) for langsigtet eksperimenter eller før analysen til kortsigtede forsøg. Alternativt kan tilpasset behandling gange vælges baseret på typen og formålet med forsøgene. - Næste, tilsæt 5 µL af pHrodo rød-mærket LDL (1 mg/mL stock) til hver brønd til at opnå en endelig koncentration på 10 µg/mL. Derefter forsigtigt fjerne eventuelle bobler fra brøndene.
2. levende celle analyse
- Straks efter tilsætning mærket LDL, pladen anbringes i den levende celle analyse system inkubator (Se Tabel af materialer) og tillade plade til blandingen henstår i 15 minutter til at reducere kondensering i pladen.
- I mellemtiden, åbne softwaren og planlægge scanningen ved at tilføje fartøjet holder pladen. Billede 16 billeder pr. brønd med 1 times intervaller på 10 X i 4 timer ved hjælp af røde og fase-kanaler.
- Oprette en plade kort til brug for databehandling.
- Klik på fanen Egenskaber vælge plade kort. Input celletype og behandlinger i forbindelser tab.
- Klik på fanen områder , Marker hvert sæt af replikater, og gemme som regioner.
3. opsætning af analyseparametre
- Når en eksperimentel run er færdig, skal du oprette et billede indstillet i softwaren til at træne computeren til at kvantificere hver parameter medtages i optællingen.
- I softwaren, åbne visningen plade og derefter i boksen Analyse Job Utilities vælge Opret eller Føj til billedsamling.
- Vælg Ny billedsamling, Skriv et navn til samlingen billede, og vælge de røde og fase kanaler ved at markere afkrydsningsfelterne ud for kanalerne.
- Vælg 5 flere billeder og tilføje til billedsamling ved at tilføje den aktuelle billedsamling.
- Oprette en forarbejdning Definition for cellerne. Tabel 1 indeholder parametre for cellen HepG2, HK2 og HCAE forarbejdning definitioner for protokollens LDL tilstrømning.
- Vælg Ny behandling Definitioni boksen Analyse Job Utilities . Vælg billede samlingen opkaldt taktfast 2.1.2 fra drop down menuen. Input parametre for typen celler fra tabel 1.
- Brug rullemenuen til at vælge Preview allei eksempelboksen.
- I boksen Analyse maske kontrollere Sammenløbet maske og boksene Rødt objekt maske for at se området inkluderet i analysen for forarbejdning definition. Se figur 1.
- Rul gennem billedsamling at sikre celler og LDL er inkluderet i masken. Vælg filen og gemme forarbejdning Definition.
- Analysere sæt af billeder fra den eksperimentelle kørsel.
- Åbn eksperimentet i plade visning. Vælg Lancere nye analyse Jobi boksen Analyse Job Utilities . Vælg den gemte forarbejdning Definition.
- Navngive analyse jobbet, vælge tidsintervallet for analyse og fremhæve de eksperimentelle wells til at analysere. Klik på knappen Start .
4. analyse og databearbejdning
- Når analyse Job er fuldført, skal du eksportere dataene:
- Vælg den gennemførte analyse og tryk på Vis. Vælg Metrisk/graf eksporterei menuen hjælpeprogrammer .
- I menuen regioner vælge Alle brønde, og gruppen Vælg i menuen for at opnå de gennemsnitlige værdier for hvert sæt af brønde som en gruppe replikater, og for at eksportere de individuelle værdier for hver brønd vælge ingen.
- Vælg Samlede rødt objekt integreret intensitet (RCU x µm2afbildningsstien)i menuen Red objekt metriske . Denne parameter angiver summen af rødt signal intensitet (i RCU) gange området af det røde signal (i µm2) i alle billeder på tværs af hver brønd, som svarer til den samlede LDL optagelse af celler.
- Klik på knappen Dataeksport . Kontrollere opdele data i individuelle billeder. Oplysningerne kopieres automatisk på en Udklipsholder og kan indsættes til en ny regnearkfil.
- I menuen fase objekt metriske vælge sammenløbet (procent). Kontrollere opdele data i individuelle billeder. Klik på knappen Dataeksport . Dataene kopieres automatisk på en Udklipsholder og kan kopieres til den regnearksfil, der indeholder samlede rødt objekt integreret intensitet data.
- Gælde omstilling af procent sammenløbet for samlede areal med følgende ligning.
Samlet fase areal (µm2afbildningsstien) = sammenløbet (%) × (billedets højde (pixel) × dagsorden) × (billedbredde (pixel) × opløsning)
Bemærk: parameteren sammenløbet (%) angiver det procent sammenløbet af fase areal pr. billede, der svarer til området af celler i hver brønd. Denne parameter skal konverteres til total fase område for hver enkelt billede en gang eksporteret. Billede specifikationer for fase kanal (billedets højde, bredde og opløsning) skal anvendes med den ovenstående formel for hvert fartøj, eksperimentelle kan findes ved at henvise til Fartøj egenskaber under Billedet kanaler. - Normalisere samlede rødt objekt integreret intensitet til den samlede fase område som beregnet i 4.1.6 ved hjælp af følgende formel for hvert enkelte billede for at eliminere variabilitet i celle tæthed på tværs af brøndene.
- Dividere de Samlede røde objekt integreret intensitet (RCU x µm2afbildningsstien) værdier af hvert billede med dens tilsvarende Samlede fase område (µm2afbildningsstien) at opnå LDL optagelse (RCU) værdier pr. billede.
- Derefter, gennemsnitlig LDL optagelse (RCU) data for alle billeder af hver brønd til at få den gennemsnitlige LDL optagelse i hver brønd og derefter gennemsnitlig LDL optagelse værdier af alle Repliker brøndene at opnå gruppe betyder. Disse data er de endelige LDL optagelse værdier og kan bruges til illustration og statistisk analyse ved hjælp af softwaren valg.
Representative Results
Live celle Imaging giver mulighed for pålidelig overvågning af celle sundhed under kolesterol tilstrømning studier i tre menneskelige cellelinjer
Vi validerede vores analyse i tre menneskelige cellelinjer som kolesterol homøostase forordning spiller en stor patofysiologiske rolle, herunder menneskelige hepatisk karcinom (HepG2) celler, humane renal epitel (HK2) celler og menneskelige koronararterie endotelceller (HCAECs). Vi brugte en levende celle imaging system til at udføre LDL optagelse assay i en 4 h tidsforløb med serielle målinger på 1 h intervaller. Vores resultater viser, at alle celletyper testet var forenelige med denne nye teknik og resultat i kurver angiver løbende LDL optagelse for varigheden af tilstrømning undersøgelse med 4,33 Hansen som den endelige slutpunkt (figur 2). Tilstrømning data vist i figur 2 blev opnået ved at normalisere den samlede pHrodo rød-mærket LDL fluorescens (total rød objekt integreret intensitet pr. billede i RCU x µm2/billede) til området cellen total i hvert billede i hver brønd (fase objekt areal pr. billede i µ m2afbildningsstien) at eliminere variabilitet i celle tæthed på tværs af brøndene. Derudover for at validere følsomhed af LDL tilstrømning analysen med henblik på screening forbindelser påvirker LDL kolesterol optagelse, brugte vi to positive kontroller kendt for at hæmme LDL tilstrømning, Dynasore og rPCSK9, og en positiv kontrol kendt for at inducere LDL optagelse, Simvastatin. Godkendt af vores resultater, efter behandling med Dynasore og rPCSK9, testet alle tre humane cellelinjer (HepG2, HK2 og HCAEC) viste signifikant reduktion i LDL tilstrømning over en 4 h tidsforløb (figur 2A-C). For eksempel, viser figur 2A , at LDL tilstrømning er reduceret i HepG2 celler med behandling af Dynasore over tidsforløb, i forhold til de celler, der er behandlet med DMSO; mens DMSO som kontrolelementet køretøj for Dynasore kontrol havde ingen signifikant effekt på LDL tilstrømning i forhold til den ubehandlede kontrolgruppe. Desuden vores resultater viste en markant stigning i LDL optagelse af HepG2 celler efter behandling med Simvastatin (figur 3), der understøtter følsomheden af denne metode til at påvise betydelige ændringer i LDL tilstrømning. På omkring 4,5 h tid-punktet, som er en typisk tidspunkt i LDL optagelse undersøgelser, LDL tilstrømningen er væsentligt reduceret med enten Dynasore eller rPCSK9 behandling, og steg med Simvastatin behandling (figur 4).
En stor fordel ved at bruge levende celle imaging for LDL optagelse undersøgelser er, at dette system giver realtid billeder af celler i hver brønd, der kunne bruges til at overvåge potentielle cytotoksicitet af de undersøgte stoffer. Tallene 5-7 illustrere repræsentative billeder af de tre cellelinjer undersøgt på første gang punkt 0,33 h og endelige slutpunkt (4,33 h) som en visuel reference til den netto LDL tilstrømning. Billederne bekræfter den normale morfologi af celler efter Dynasore eller rPCSK9 behandlinger, der angiver både effektiviteten og sikkerheden af disse forbindelser.
Levende celle analyse giver pålidelig serie kvantitative kolesterol tilstrømning målinger med forskellige behandlinger
En stor fordel ved at bruge denne protokol med en levende celle imaging system er evnen til at indsamle data i hele tid kurset og sammenligne LDL tilstrømning på flere tidspunkter i stedet for blot en sidste gang punkt som traditionelt udført. Ved hjælp af denne protokol, er vi i stand til at beregne den procentvise reductionin LDL tilstrømning for terminal tidspunkt samt 1 h mellemrum under hele tiden. Tabel 2 opsummeres reduktion i LDL tilstrømning i tre testede menneskelige cellelinjer efter 10 min før behandling med 40 µM Dynasore eller 1 h forbehandling med 10 µg/mL rPCSK9. På 4,33 Hansen som den endelige undersøgelse endepunkt, behandling med Dynasore på 40 µM betydeligt reduceret LDL tilstrømning i HepG2 celler, HK2 celler og HCAECs 53%, 68% og 54%, henholdsvis (Tabel 2A-C) og behandling med rPCSK9 på 10 µg/mL resulterede i 55% reduktion i LDL tilstrømningen i HK2 celler (tabel 2B). Ud over at kvantificere terminal tidspunkt som i traditionelle assays, er vi købedygtig præstere en kvantitativ analyse i reduktion af LDL tilstrømning på grund af behandling på hvert tidspunkt af eksperimentet. For eksempel, viser tabel 2B at behandling med rPCSK9 i HK2 celler resulterede i en reduktion af LDL optagelse af 79% på 1,33 h, 67% på 2,33 Hansen, 59% på 3,33 h efter behandling i forhold til ubehandlede celler. Denne protokol giver en pålidelig metode til kvantitativ analyse af LDL tilstrømning efter behandling.
Figur 1 : Forarbejdning Definition maske. Repræsentative billeder af HK2 celler er afbildet, efter anvendelse af den relevante behandling definition (detaljeret oversigt i tabel 1). Vist areHK2 celler uden afmaskning (A), med fase Maskapplied (B), med rødt objekt maske anvendt (C), eller med både fase og rødt objekt masker anvendes (D). Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Reduktion i LDL optagelse bruger live celle billedbehandlingssystem over en 4,33 h tidsforløb. Live-celle analyse system bruges til at måle LDL tilstrømning i menneskelige hepatisk karcinom (HEPG2) celler (A), human renal tubulær (HK2) epitelceller (B) og menneskelige koronararterie (HCAE)-endotelceller (C). Cellerne blev behandlet med Dynasore (10 min før løbet) eller rPCSK9 (1 h før løbet) som positive kontroller. DMSO blev brugt som et redskab til Dynasore behandlinger. Positive kontroller faldt betydeligt LDL tilstrømning i alle 3 cellelinjer. LDL tilstrømning værdier blev opnået ved at normalisere samlede rød objekt integreret intensitet (RCUxµm2afbildningsstien) til området samlede fase objekt (µm2afbildningsstien). Data er mean±SEM. N = 6 wells/gruppe. Data er repræsentative for 2 eller 3 uafhængige forsøg. p < 0,0001 vs tomme, og ###p < 0,0001 vs DMSO, ved hjælp af to-vejs ANOVA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Stigning i LDL optagelse ved hjælp af levende celle imaging system over en 4,33 h tidsforløb. Live-celle analyse system bruges til at måle LDL tilstrømning i menneskelige hepatisk karcinom (HEPG2) celler. LDL optagelse er steget betydeligt efter behandling med Simvastatin til 12 h (A), 18 h (B) eller 24 h (C) ved hjælp af medier indeholdende 2% FBS. 24 h tidspunkt blev også udført med medier indeholdende 5% LPDER (uden FBS). DMSO blev brugt som negativ kontrol. LDL tilstrømning værdier blev opnået ved at normalisere samlede rød objekt integreret intensitet (RCU x µm2afbildningsstien) til området samlede fase objekt (µm2afbildningsstien). Data er mean±SEM. N = 6 wells/gruppe. Data er repræsentative for et uafhængigt eksperiment. p < 0,0001 vs DMSO, brug af Student's t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Betydelig LDL tilstrømning reduktion af LDL optagelse-sænkende stoffer for 4,3 h tidspunkt. LDL tilstrømning er betydeligt reduceret i menneskelige hepatisk karcinom (HepG2) celler (A), human renal tubulær (HK2) epitelceller (B) og menneskelige koronararterie (HCAE) endotelceller (C) efter behandling med LDL optagelse hæmmere Dynasore for 10 min eller rPCSK9 i 1 time. LDL tilstrømning øges markant af Simvastatin i HepG2 celler efter 12, 18 eller 24 h behandlinger (D). Data er mean±SEM. N = 6 wells/gruppe. Data er repræsentative for 2 eller 3 uafhængige forsøg. p < 0,0001 ved hjælp af to-vejs ANOVA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Reducerede LDL tilstrømning i hepatocellulært carcinom (HepG2) celler af LDL optagelse-sænkende middel, Dynasore. Repræsentative billeder i fase- og røde objektet for HepG2 celler er afbildet på 0,33 h (venstre paneler) og 4,33 h slutpunkt (højre paneler) Vis sund status af celler. 40 µM Dynasore, kendt for at reducere LDL-kolesterol udbredelse, blev anvendt som positiv kontrol (C). Billeder blev taget på 10 X forstørrelse. Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Reducerede LDL tilstrømning i menneskelige renal tubulær (HK2) epitelceller af LDL optagelse-sænkende stoffer, Dynasore og rPCSK9. Repræsentative billeder i fase- og røde objektet for HK2 celler afbildet på 0,33 h (venstre paneler) og 4,33 h slutpunkt (højre paneler) Vis sund status af celler. 40 µM Dynasore (C), eller 10 µg/mL rPCSK9 (D), kendt for at reducere LDL kolesterol udbredelse, blev anvendt som positiv kontrol. Billeder er taget på 10 X forstørrelse. Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 . Reducerede LDL tilstrømning i menneskelige koronararterie endotelceller (HCAECs) af LDL optagelse-sænkende middel, Dynasore. Repræsentative billeder i fase- og røde objektet for HCAECs afbildet på 0,33 h (venstre paneler) og 4,33 h slutpunkt (højre paneler) Vis sund status af celler. 40 µM Dynasore, kendt for at reducere LDL-kolesterol udbredelse, blev anvendt som positiv kontrol (C). Billeder blev taget på 10 X forstørrelse. Skalalinjen = 100 µm. Data er mean±SEM. N = 6 wells/gruppe. Data er repræsentative for 2 eller 3 uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: forarbejdning Definition parametre. Disse parametre er specifikke for den analyse, der anvendes i denne protokol. Parametrene bør sættes op til at analysere røde område i den røde kanal og området i cellen i den fase kanal. Parameterindstillinger for HepG2, HK2, HCAE cellelinjer præsenteres.
Tabel 2: procentvis ændring i LDL tilstrømning HepG2, HK2 og HCAE behandlet med Dynasore, rPCSK9 eller Simvastatin på 4,3 h. (A) HepG2 celler, (B) HK2 celler, (C) HCAE celler og (D) HepG2 celler.
Discussion
I den nuværende protokol viser vi udnyttelsen af levende celle imaging som en ny og mere effektiv metode til at måle realtid LDL optagelse over et tidsforløb i forskellige menneskelige cellelinjer. Menneskelige hepatisk karcinom (HepG2) celler er almindeligt anvendt i undersøgelser screening for kolesterol-sænkende therapeutics21,22,23,24,25,26, 39,40. Derfor valgte vi denne celletype til at teste evnen til en levende celle billedbehandlingssystem for LDL tilstrømning undersøgelser. Vores resultater viser, at HepG2 celler er forenelige med denne nye teknik og resultat i en sigmoid-lignende kurve der angiver kontinuerlig LDL optagelse for varigheden af tilstrømning assay indtil 4,33 Hansen som den endelige slutpunkt (figur 2A og figur 3 ).
Kolesterol homøostase spiller en stor rolle i Patofysiologi af forskellige nephropathies. Kolesterol ophobning i nyre væv er en stor bidragyder til renal fibrose fører til kronisk nyresygdom og er en større patologi i forskellige nephropathies28,29,30,31. Derfor undersøgte vi vores metode i menneskelige renal (HK2) epitelceller som en populær og pålidelig cellelinie udnyttet inden for nefrologi. Vores data understøttes også muligheden for den levende celle imaging system til at måle LDL tilstrømning i HK2 celler. Som vist i figur 2B, tog HK2 celler LDL kolesterol lineært i hele varigheden af tilstrømning undersøgelse (4 timer).
På grund af betydningen af kolesterol metabolisme i udvikling og progression af aterosklerose32,33,41, den hyppigste årsag til hjerte-kar-sygdom, som igen er nummer et morderen på verdensplan 42, vi havde til formål at validere vores metode i en åreforkalkning-relevante celletype. Vi brugte humane koronar arteriel Endothelial celler (HCAECs), da disse er en af de første celletyper til at blive udsat for en fornærmelse af kolesterol i kranspulsåren lumen af en åreforkalkning patienten. Vores data, vist i figur 2C angiver, at denne LDL tilstrømning metode også fungerer effektivt med HCAECs. Den deraf følgende graf er en sigmoid-lignende kurve ligner HepG2 celler.
For at teste gyldigheden og følsomhed på denne forbedrede LDL tilstrømning assay for screening forbindelser påvirker LDL-kolesterol optagelse, brugte vi tre kontrolelementer, LDL optagelse-sænkende stoffer Dynasore og rPCSK9 og LDL tilstrømning aktivator Simvastatin. Her, vi behandlede den ovenfor nævnte cellelinjer (HepG2, HK2 og HCAECs) med optimeret koncentrationer af Dynasore eller rPCSK9 før tilstrømning assay. Vores resultater viste, at alle tre testede cellelinjer reageret på behandlingerne med betydelige reduktioner i LDL tilstrømning over en 4-timers kursus (figur 2). Eksempelvis på 4,33 Hansen som den endelige tidspunkt, behandling med Dynasore på 40 µM betydeligt reduceret LDL tilstrømning i HepG2 celler, HK2 celler og HCAECs 53%, 68% og 54%, henholdsvis (p < 0,0001; Figur 2 A-C og Tabel 2A-C). Derudover rPCSK9 på 10 µg/mL forårsaget en markant 55% reduktion i LDL tilstrømning i HK2 celler (p < 0,0001; Figur 2 B og tabel 2B). Vores resultater viste desuden, at behandle HepG2 celler med Simvastatin resulteret i en markant stigning i LDL optagelse (figur 3), støtte følsomheden af denne metode til at påvise betydelige ændringer i LDL tilstrømning. Undersøgelser af behandling med rPCSK9 i HepG2 og HCAEC celler er ikke inkluderet i denne protokol, som rPCSK9 er brugt som en ekstra kontrol behandling med veldokumenterede resultater, men er dyrt at købe i små mængder. RPCSK9 var derfor kun bruges til at validere denne protokol i HK2 celler.
Live celle imaging analyse, sammen med de funktionelle og rettidig måling af LDL tilstrømning, mulighed for løbende overvågning af sundhed og morfologi af celler. Denne fordel kan effektivt opdage potentielle cytotoksicitet af de anvendte stoffer, gør denne metode en ideel teknik til samtidig overvågning af farmakologiske aktivitet og cytotoksicitet. Tallene 5-7 illustrere repræsentative billeder af de tre testede cellelinjer på den endelige slutpunkt (4,33 h) som en visuel reference for effekten af behandlinger på netto LDL tilstrømning og viser også de sunde morfologi af celler efter den testede behandlinger. Vi anbefaler visuel inspektion af alle billederne fra hver brønd til at forsikre heathy morfologi af cellerne for varigheden af undersøgelsen. For eksempel i data, der ikke vises, da billeder af HepG2 celler behandlet med 80 μM Dynasore blev inspiceret, vi observeret tegn på celle udstationering som kanterne af cellerne syntes at være løfte fra pladen, tyder på celle detachement ved højere koncentrationer af Dynasore. Derudover induceret høje koncentrationer af simvastatin (3-10 μM) også ført til ændrede morfologi angiver apoptose som rapporteret for høje doser af statiner45. Denne protokol blev brugt til at udføre en titrering af Dynasore behandling på 20-80 μM og Simvastatin på 0,5-10 μM koncentration, hvorefter celle billeder blev brugt til at analysere sundheden for cellerne og bestemme potentielle ctotoxicity af behandlinger på forskellige koncentrationer. Resultater foreslog at benytte 40 μm for Dyansore og 1 μM for simvastatin som optimal koncentrationer.
Endelig foreslår vi, at udføre en celle tæthed titrering undersøgelse, hvis en anden cellelinje er at blive testet med denne metode for at identificere de optimale celle nummer pr. brønd for at få ensartede resultater. Vores celle tæthed optimering undersøgelse viste, at 10.000 celler/brønd i en 24-godt plade føre til konsekvent LDL tilstrømning udfald for HK2 og HCAE celler. Det er vigtigt at bemærke, for denne LDL tilstrømning analyse ved hjælp af levende celle imaging system, en éncellelag af ikke-sammenflydende celler fordelt jævnt på brøndene er ønskeligt, som klumper af celler kan give anledning til fejl i de endelige normaliserede LDL tilstrømning værdier. Grunden til dette er, at for en normalisering af tilstrømning data, fase objekt området bruges som en målestok for celle tæthed og denne parameter kan påvirkes negativt, når celle klumper er dannet. Vi observerede, at HepG2 celler har en tendens til form klumper når seedede ved tætheder højere end 5.000 celler/brønd forårsager inkonsekvent tilstrømning resultater; Derfor, vi brugte 5.000 celler pr. brønd i en 24-godt plade som optimal tæthed for HepG2 celler.
Kollektivt, giver vores metode en medium til høj overførselshastighed platform for screening farmakologiske aktivitet og cytotoksicitet af forbindelser regulering LDL tilstrømning samtidigt. Denne metode kan tilpasses let til brug med andre fluorescently mærket ligander, som angiver den lysosomale rum for at evaluere ligand optagelse i realtid. Mens denne protokol tilbyder specifikationer for InCucyte live billedbehandling og analysesystem, protokollen kan tilpasses for alternative Billeddannende systemer som Cellomics.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af de følgende tilskud til LAS: National Institute of Health (R56HL132209 og 1R01HL140468) og Miami hjerte Research Institute. KY er modtager af American Heart Association Predoctoral Fellowship (18PRE33960070). HepG2 celler blev venligst leveret af Dr. Emmanuel Thomas, universitetet i Miami Miller School Medicine46,47,48.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pHrodo Red-LDL | ThermoFisher Scientific | L34356 | |
| HepG2 cells | E. Thomas Lab, U. Miami | HB-8065 | |
| MEM | Sigma | M0325 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Sigma | G7513 | |
| FBS | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| HK2 cells | ATCC | CRL-2190 | |
| Keratinocyte SFM media kit | Gibco | 17005-042 | |
| Primary Coronary Artery Endothelial Cells | ATCC | PCS-100-020 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-VEGF | ATCC | PCS-100-041 | |
| Human Lipoprotein Deficient Serum | Millipore | LP4 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gemini Bio-Products | 400-150 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | ATCC | PCS-999-004 | |
| 24 well plate | Falcon | 353226 | |
| 40 μM mesh cell strainer | VWR | 10199-654 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
| Trypan Blue Staining (0.4%) | Life Technologies | T10282 | |
| Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | Zoom | Imaging and analysis platform |
| Dynasore Hydrate | Sigma | D7693 | |
| PCSK9 Recombinant Protein | Cayman Chemicals | 20631 |
References
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
- Trevisan, R., Dodesini, A. R., Lepore, G. Lipids and renal disease. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (4), Suppl 2 145-147 (2006).
- Tall, A. R., Yvan-Charvet, L. Cholesterol, inflammation and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 15 (2), 104 (2015).
- Dedoussis, G. V., Schmidt, H., Genschel, J. LDL-receptor mutations in Europe. Human Mutation. 24 (6), 443-459 (2004).
- Sasaki, K., et al. ATP-binding cassette transporter A subfamily 8 is a sinusoidal efflux transporter for cholesterol and taurocholate in mouse and human liver. Molecular Pharmaceutics. , (2018).
- Storch, J., Xu, Z. Niemann-Pick C2 (NPC2) and intracellular cholesterol trafficking. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (7), 671-678 (2009).
- Jansen, P. J., et al. Absence of ApoE upregulates murine brain ApoD and ABCA1 levels, but does not affect brain sterol levels, while human ApoE3 and human ApoE4 upregulate brain cholesterol precursor levels. Journal of Alzheimer's Disease. 18 (2), 319-329 (2009).
- Girard, E., et al. The dynamin chemical inhibitor dynasore impairs cholesterol trafficking and sterol-sensitive genes transcription in human HeLa cells and macrophages. PLoS One. 6 (12), 29042 (2011).
- Robinet, P., et al. Dynamin is involved in endolysosomal cholesterol delivery to the endoplasmic reticulum: role in cholesterol homeostasis. Traffic. 7 (7), 811-823 (2006).
- Macia, E., et al. Dynasore, a cell-permeable inhibitor of dynamin. Developmental Cell. 10 (6), 839-850 (2006).
- Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the LDLR and LDL-cholesterol. Journal of Biological Chemistry. , (2004).
- Qian, Y. -W., et al. Secreted PCSK9 downregulates low density lipoprotein receptor through receptor-mediated endocytosis. Journal of Lipid Research. 48 (7), 1488-1498 (2007).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. History of discovery: the LDL receptor. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (4), 431 (2009).
- Stephan, Z. F., Yurachek, E. C. Rapid fluorometric assay of LDL receptor activity by DiI-labeled LDL. Journal of Lipid Research. 34 (2), 325-330 (1993).
- Fisher, T. S., et al. Effects of pH and low density lipoprotein (LDL) on PCSK9-dependent LDL receptor regulation. Journal of Biological Chemistry. 282 (28), 20502-20512 (2007).
- Atrahimovich, D., Khatib, S., Sela, S., Vaya, J., Samson, A. O. Punicalagin induces serum low-density lipoprotein influx to macrophages. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, (2016).
- Xu, M., et al. δ-Tocopherol reduces lipid accumulation in Niemann-Pick type C1 and Wolman cholesterol storage disorders. Journal of Biological Chemistry. 112, (2012).
- Bonilla, D. L., et al. Autophagy regulates phagocytosis by modulating the expression of scavenger receptors. Immunity. 39 (3), 537-547 (2013).
- Guo, M., et al. Apelin-13 Decreases Lipid Storage in Hypertrophic Adipocytes In vitro Through the Upregulation of AQP7 Expression by the PI3K Signaling Pathway. Medical Science Monitor : International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 20, 1345-1352 (2014).
- Guillemot, J., Asselin, M. C., Susan-Resiga, D., Essalmani, R., Seidah, N. G. Deferoxamine stimulates LDLR expression and LDL uptake in HepG2 cells. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (3), 600-608 (2016).
- Javitt, N. B. Hep G2 cells as a resource for metabolic studies: lipoprotein, cholesterol, and bile acids. The FASEB Journal. 4 (2), 161-168 (1990).
- Mullen, P. J., Lüscher, B., Scharnagl, H., Krähenbühl, S., Brecht, K. Effect of simvastatin on cholesterol metabolism in C2C12 myotubes and HepG2 cells, and consequences for statin-induced myopathy. Biochemical Pharmacology. 79 (8), 1200-1209 (2010).
- McNutt, M. C., et al. Antagonism of secreted PCSK9 increases low density lipoprotein receptor expression in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (16), 10561-10570 (2009).
- Scharnagl, H., et al. Effect of atorvastatin, simvastatin, and lovastatin on the metabolism of cholesterol and triacylglycerides in HepG2 cells. Biochemical Pharmacology. 62 (11), 1545-1555 (2001).
- Scharnagl, H., et al. The effects of lifibrol (K12. 148) on the cholesterol metabolism of cultured cells: evidence for sterol independent stimulation of the LDL receptor pathway. Atherosclerosis. 153 (1), 69-80 (2000).
- Chan, J. C., et al. A proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 neutralizing antibody reduces serum cholesterol in mice and nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (24), 9820-9825 (2009).
- Ding, W., et al. Osteopontin deficiency ameliorates Alport pathology by preventing tubular metabolic deficits. JCI Insight. 3 (6), (2018).
- Herman-Edelstein, M., Scherzer, P., Tobar, A., Levi, M., Gafter, U. Altered renal lipid metabolism and renal lipid accumulation in human diabetic nephropathy. Journal of Lipid Research. 55 (3), 561-572 (2014).
- Su, H., et al. Lipid Deposition in Kidney Diseases: Interplay Among Redox, Lipid Mediators, and Renal Impairment. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (10), 1027-1043 (2018).
- Agrawal, S., Zaritsky, J. J., Fornoni, A., Smoyer, W. E. Dyslipidaemia in nephrotic syndrome: mechanisms and treatment. Nature Reviews Nephrology. 14 (1), 57 (2018).
- Babiak, J., Rudel, L. L. Lipoproteins and atherosclerosis. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 1 (3), 515-550 (1987).
- Wang, H. H., Garruti, G., Liu, M., Portincasa, P., Wang, D. Cholesterol and Lipoprotein Metabolism and Atherosclerosis: Recent Advances in Reverse Cholesterol Transport. Annals of Hepatology. 16 (1), 28-42 (2018).
- Preta, G., Cronin, J. G., Sheldon, I. M. Dynasore-not just a dynamin inhibitor. Cell Communication and Signaling. 13 (1), 24 (2015).
- Horton, J. D., Cohen, J. C., Hobbs, H. H. Molecular biology of PCSK9: its role in LDL metabolism. Trends in Biochemical Sciences. 32 (2), 71-77 (2007).
- Abifadel, M., et al. Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia. Nature Genetics. 34 (2), 154 (2003).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. Regulation of the mevalonate pathway. Nature. 343 (6257), 425 (1990).
- Dong, B., Wu, M., Cao, A., Li, H., Liu, J. Suppression of Idol expression is an additional mechanism underlying statin-induced up-regulation of hepatic LDL receptor expression. International Journal of Molecular Medicine. 27 (1), 103-110 (2011).
- Song, K. H., Kim, Y. H., Im, A. -R., Kim, Y. H. Black Raspberry Extract Enhances LDL Uptake in HepG2 Cells by Suppressing PCSK9 Expression to Upregulate LDLR Expression. Journal of Medicinal Food. , (2018).
- Chan, J. C., et al. A proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 neutralizing antibody reduces serum cholesterol in mice and nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9820-9825 (2009).
- Tabas, I., Williams, K. J., Borén, J. Subendothelial lipoprotein retention as the initiating process in atherosclerosis: update and therapeutic implications. Circulation. 116 (16), 1832-1844 (2007).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell. 89 (3), 331-340 (1997).
- Horton, J. D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver. The Journal of Clinical Investigation. 109 (9), 1125-1131 (2002).
- Tavintharan, S., et al. Reduced mitochondrial coenzyme Q10 levels in HepG2 cells treated with high-dose simvastatin: A possible role in statin-induced hepatotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. 223 (2), 173-179 (2007).
- Thomas, E., et al. HCV infection induces a unique hepatic innate immune response associated with robust production of type III interferons. Gastroenterology. 142 (4), 978-988 (2012).
- Thomas, E., Liang, T. J. Experimental models of hepatitis B and C-new insights and progress. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (6), 362 (2016).
- Yoneda, M., et al. Hepatitis B Virus and DNA Stimulation Trigger a Rapid Innate Immune Response through NF-κB. The Journal of Immunology. , 1502677 (2016).
