Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

चूहों और चूहों में संरचनात्मक और कार्यात्मक दृश्य प्रणाली Readouts के रूप में ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी और Optokinetic प्रतिक्रिया का उपयोग

Published: January 10, 2019 doi: 10.3791/58571
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 2, 3, 1
1Department of Neurology, Heinrich-Heine-University Düsseldorf, 2Department of Cell Physiology, Faculty of Biology and Biotechnology, Ruhr-University Bochum, 3Division of Neuroinflammation and Glial Biology, Department of Neurology, University of California San Francisco

Summary

ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी और optokinetic प्रतिक्रिया द्वारा कुतर में संरचनात्मक और दृश्य readouts के आकलन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । परिणाम ophthalmologic के रूप में अच्छी तरह के रूप में neurologic अनुसंधान के लिए बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं ।

Abstract

ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (अक्टूबर) एक तेज, गैर इनवेसिव, interferometric उच्च संकल्प रेटिना इमेजिंग की अनुमति तकनीक है । यह अक्सर रेटिना परिवर्तन के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित के रूप में, neurodegeneration, neuroprotection और न्यूरो की मरंमत दृश्य प्रणाली को शामिल की प्रक्रियाओं की जांच के लिए एक आदर्श उपकरण है । एक कार्यात्मक readout के रूप में, नेत्रहीन क्षतिपूरक नेत्र पैदा की और सिर आंदोलनों सामांयतः प्रयोगात्मक दृश्य समारोह से जुड़े मॉडलों में इस्तेमाल किया जाता है । दोनों तकनीकों के संयोजन की संरचना और समारोह, जो रोग की स्थिति की जांच करने के लिए या उपंयास चिकित्सकीय क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की vivo जांच में एक मात्रात्मक की अनुमति देता है । प्रस्तुत तकनीक का एक बड़ा लाभ संभावना है अनुदैर्ध्य विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए गतिशील प्रक्रियाओं की जांच की अनुमति, परिवर्तनशीलता को कम करने और प्रयोगों के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या में कटौती । प्रोटोकॉल के अधिग्रहण के लिए एक मैनुअल प्रदान करने के लिए और चूहों और चूहों और एक कम लागत सांस लेने योग्य संज्ञाहरण देने के लिए एक विकल्प के साथ अनुकूलित धारक का उपयोग चूहे की रेटिना स्कैन के विश्लेषण के लिए वर्णित है । इसके अतिरिक्त, प्रस्तावित गाइड कुतर में optokinetic प्रतिक्रिया (ूकृ) विश्लेषण, जो उनकी विशिष्ट जरूरतों और हितों के लिए अनुकूलित किया जा सकता का उपयोग कर शोधकर्ताओं के लिए एक अनुदेशात्मक मैनुअल के रूप में करना है ।

Introduction

दृश्य मार्ग की परीक्षा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के एक भाग के रूप में, न केवल ophthalmologic1,2,3,4,5 को संबोधित करने में एक प्रभावी प्रारंभिक बिंदु साबित हो गया है , लेकिन यह भी neurologic6,7,8,9,10,11,12,13,14 ,१५,१६ प्रश्न आहेत. हाल के वर्षों में, अक्टूबर और ूकृ उपयोगी विश्लेषणात्मक के रूप में पहचान की गई है, गैर इनवेसिव उपकरण विभिन्न कुतर मॉडल में retinopathies और रेटिना अभिव्यक्तियों की एक बड़ी विविधता का मूल्यांकन करने के लिए17,18,19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. OCT ऊतकवैज्ञानिक वर्गों के साथ अच्छे अनुसार परिणामों के साथ चूहों और चूहों में, रेटिना आकृति विज्ञान और संरचना के vivo दृश्य में तेजी से और उच्च संकल्प के लिए अनुमति देता है26रेटिना । ूकृ एक तेज और मजबूत विधि का गठन करने के लिए मात्रात्मक दृश्य समारोह का आकलन ।

कई अक्टूबर उपकरणों की अनुमति देते हैं एक साथ फोकल स्कैनिंग लेजर ophthalmoscopy (cSLO) विभिन्न तरंग दैर्ध्य के साथ इमेजिंग, जो रेटिना विकृतियों के बारे में नैदानिक जानकारी प्रदान करता है, यानी, lipofuscin जमा या रेटिना के परिवर्तन के दृश्य वर्णक उपकला27. इसके अलावा, vivo में ट्रांसजेनिक जानवरों में प्रतिदीप्ति लेबल कोशिकाओं के इमेजिंग संभव है28,29,30,31,३२। हालांकि, मुख्य रूप से छोटी आंख के आकार की वजह से, कुतर मॉडलों में अक्टूबर प्रौद्योगिकी के आवेदन अभी भी चुनौतीपूर्ण है । कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों के रूपांतरों की आवश्यकता होती है और अक्सर धारक का एक अलग आकार विभिन्न प्रजातियों के जानवरों की छवि के लिए आवश्यक है । इसके अतिरिक्त, जानवरों माप के लिए संज्ञाहरण की आवश्यकता है ।

ूकृ उपकरणों को कुतर में विजुअल फंक्शन का आंकलन किया जा सकता है । जानवरों के एक वास्तविक या आभासी एक चलती है, जो जानवरों के साथ सजगता सिर और गर्दन आंदोलनों के साथ ट्रैक प्रदर्शित सिलेंडर के केंद्र में एक मंच पर रखा जाता है । इस optokinetic प्रतिक्रिया कम या दृश्य समारोह की कमी या हानि के मामले में समाप्त हो गया है ।

इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य के लिए रेटिना मोटाई की माप के लिए एक मैनुअल पेश करने के साथ एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अक्टूबर डिवाइस का उपयोग कर एक कस्टम के साथ श्वसन संज्ञाहरण प्रदान धारक है । प्रोटोकॉल दिखाता है कि निर्माता द्वारा प्रदान की गई सॉफ्टवेयर का उपयोग मात्रा स्कैन का विश्लेषण करने के लिए कैसे । दृश्य परीक्षण के लिए, उद्देश्य ूकृ का आकलन करने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणाली का उपयोग करने के लिए कैसे पर निर्देश प्रदान करना है.

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को क्षेत्रीय अधिकारियों द्वारा अनुमोदित प्रायोगिक दिशानिर्देशों के अनुपालन में किया गया था (प्रकृति, पर्यावरण और उपभोक्ता संरक्षण के लिए राज्य एजेंसी; संदर्भ संख्या 84-02.04.2014. A059) और के लिए एसोसिएशन के अनुरूप वैज्ञानिक प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जानवरों के संरक्षण पर दृष्टि और नेत्र विज्ञान (ARVO) नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में पशुओं के उपयोग के लिए बयान और यूरोपीय निर्देशक 2010/

1. फोकल स्कैनिंग लेजर Ophthalmoscopy-ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी

नोट: cSLO-OCT माप के लिए प्रोटोकॉल प्रयोगशाला चूहों और चूहों के सभी उपभेदों के लिए अनुकूल है ।

  1. सेट अप और पूर्व इमेजिंग तैयारी
    नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए OCT डिवाइस का सिस्टम कॉंफ़िगरेशन पहले ही31में वर्णित किया जा चुका है ।
  2. श्वसन संज्ञाहरण के लिए कुतर तैयारी
    1. एक प्रेरण कक्ष में मूषक प्लेस और 2 एल पर 2% की एक isoflurane एकाग्रता के लिए vaporizer सेट/
    2. जांचें कि यदि कुतर कर पूंछ चुटकी भर anesthetized है तो उसे चैम्बर से निकालकर उसे गर्म रखने के लिए कागजी तौलिया में लपेट लें ।
    3. कस्टम धारक३३ में कुतर प्लेस और मुंह टुकड़ा के एकीकृत काटने पट्टी पर दाढ़ की हड्डी कृन्तक हुक, vaporizer से जुड़े (२.५% isoflurane पर 2 L/मिनट ओ2) ।
    4. pupillary फैलाव के लिए प्रत्येक आंख पर 2.5%-Tropicamide ०.५% Phenylephrine की एक बूंद लागू करें ।
    5. 1 मिनट के बाद आंखों की बूंदों के किसी भी अतिरिक्त तरल बंद पोंछ और मिथाइल-फाइबर आधारित नेत्र जेल (जैसे, hypromellose ०.३% आई ड्रॉप्स) के साथ आंखों को चिकना बाहर सुखाने और कॉर्निया के turbidity से बचने के लिए ।
    6. कस्टम संपर्क लेंस प्लेस (+ 4 diopters) हाथ से माउस आंख पर या संदंश का उपयोग कर । एक विमान की सतह को आश्वस्त करने के लिए ऑप्टिकल संपत्तियों के बिना एक ग्लास प्लेट (जैसे, दौर 12 मिमी व्यास ग्लास coverslip) के साथ चूहे आंख को कवर ।
      नोट: संज्ञाहरण के दौरान श्वसन दर की निगरानी । वृद्धि या कमी Isoflurane एकाग्रता यदि आवश्यक हो ।
  3. माप और विश्लेषण
    नोट: करने के लिए प्रदर्शन और APOSTEL सिफारिशों३४ के साथ लाइन में OCT माप की रिपोर्ट और ऑस्कर-आईबी सहमति मानदंड३५के अनुसार गुणवत्ता नियंत्रण प्रदर्शन सुनिश्चित करें । के रूप में इन सिफारिशों मानव OCT छवियों के लिए विकसित किया गया है, कुछ मानदंडों या केवल आंशिक रूप से लागू नहीं कर रहे हैं ।
    1. बाईं आंख छवि के लिए, धारक के रूप में चित्र 1a में प्रस्तुत यह सुनिश्चित करें कि कुतर के बाईं आंख बल्ब कैमरे के चेहरे की स्थिति ।
    2. प्राप्ति मोड प्रारंभ करने के लिए नियंत्रण कक्ष प्रदर्शन के दाएँ कोने में प्रारंभ बटन दबाएँ.
    3. फिल्टर लीवर को R पर सेट करें और नियंत्रण कक्ष पर नीले रंग के चिंतनशील fundus इमेजिंग और B-स्कैन प्राप्ति हेतु BR + OCT चुनें ।
    4. लगभग ३८ diopters के लिए ध्यान घुंडी कैमरे के पीछे और रेटिना पर ज़ूम जब तक OCT स्कैन स्क्रीन पर दिखाई देता है का उपयोग करने के लिए फोकस दूरी निर्धारित करें ।
      नोट: पहली माप में, संदर्भ हाथ को कुतर माप के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । संयोजन दबाएँ ctrl + Alt + Shift + हे और स्क्रीन पर अक्टूबर-स्कैन प्रकट होता है जब तक कि खुली विंडो में संदर्भ बांह के मान को समायोजित करें ।
    5. सभी विमानों में रेटिना के लिए एक ओर्थोगोनल कोण के साथ पुतली के बीच के माध्यम से एक बीम पथ सुनिश्चित करने के लिए, प्रबुद्ध क्षेत्र के बीच में ऑप्टिक डिस्क की स्थिति (BR) और क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर लाइन बी स्कैन घूर्णन द्वारा एक क्षैतिज स्तर पर समायोजित/ धारक (आंकड़ा 1b) या कैमरा चलती ।
    6. वॉल्यूम स्कैन मोड का चयन करें और इसे सेट करने के लिए 25 B-स्कैन पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन मोड में ५० स्वचालित रीयल-टाइम ट्रैकिंग (कला, rasterized से ५० औसत A-स्कैन) सॉफ्टवेयर स्क्रीन पर.
    7. ऑप्टिक डिस्क पर वॉल्यूम स्कैन ग्रिड के बीच केंद्र और काले संवेदनशीलता घुंडी दबाकर अधिग्रहण शुरू और फिर नियंत्रण कक्ष पर प्राप्त ।
    8. नियंत्रण कक्ष पर एक, चयन ब्लू ऑटो Florescence (बाफ) के लिए फिल्टर लीवर सेट और संवेदनशीलता घुंडी के साथ छवि चमक को समायोजित । संवेदनशीलता घुंडी दबाएँ और फिर छवि फ्लोरोसेंट कोशिकाओं (जैसे, EGFP) या ऑटो फ्लोरोसेंट जमा करने के लिए प्राप्त .
    9. निर्जलीकरण को रोकने के लिए कुतर की आंख पर नेत्र जेल लागू करें और एक गर्मी स्रोत के साथ एक अलग पिंजरे में जानवर डाल दिया ।
    10. कुतर की निगरानी जब तक यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद किया गया है, एक अलग पिंजरे में और व्यक्तिगत रूप से रखे । जब पशु एम्बूलेंस हो तो उसे घर के पिंजरे में वापस कर दें ।
    11. वॉल्यूम स्कैन के विश्लेषण के लिए, स्कैन पर राइट-क्लिक करके OCT डिवाइस के सॉफ़्टवेयर के स्वचालित विभाजन का उपयोग करें और फिर सभी परतोंका चयन करें । सुनिश्चित करें कि OCT छवियों की गुणवत्ता पर्याप्त है और प्रयोगों के प्रत्येक सेट के लिए गुणवत्ता कटऑफ को परिभाषित, जैसे, > 20 डेसीबल.
    12. वांछित स्कैन, चुनें मोटाई प्रोफ़ाइल पर डबल क्लिक करके परतों के मैनुअल सुधार करने और परत विभाजन संपादितकरें पर क्लिक करते हैं । एक लेयर चुनें, उदा., भीतरी सीमित झिल्लीके लिए ILM दबाएं, और यदि आवश्यक हो, तो लाल डॉट्स को ड्रैग करके और सही स्थिति में छोड़ कर हरी रेखा को सही करें ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि मैन्युअल सुधार करने वाले जांचकर्ता प्रयोगात्मक समूहों के लिए अंधा है ।
    13. टैब मोटाई मानचित्र का चयन करें और 1, 2, 3 मिमी मधुमेह रेटिनोपैथी अध्ययन (ETDRS) ग्रिड के प्रारंभिक उपचार का चयन. ऑप्टिक डिस्क पर इनर सर्कल केंद्र (चित्रा 2, बाएं) ।
    14. ब्याज की अलग रेटिना क्षेत्रों के लिए सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान की मोटाई मूल्यों से रेटिना परतों की मोटाई की गणना. मात्रा स्कैन से मतलब मोटाई मूल्यों की गणना करने के लिए, पूरे 1, 2, 3 मिमी ETDRS ग्रिड का उपयोग करें, जो लगभग 25 डिग्री का एक कोण को शामिल किया गया, भीतरी 1 मिमी चक्र को छोड़कर, जो ऑप्टिक डिस्क (चित्रा 2, दाएँ) शामिल हैं.
    15. सांख्यिकीय विश्लेषण पर्याप्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन । यदि एक जानवर की दोनों आंखें शामिल हैं, विषय अंतर के भीतर के लिए एक सांख्यिकीय मॉडल लेखांकन-आंख सहसंबंध पर विचार (जैसे, सामान्यीकृत समीकरण या मिश्रित रैखिक मॉडल का आकलन), एक विषय की आंखों के रूप में सांख्यिकीय निर्भर कर रहे है३६ .

२. Optokinetic प्रतिसाद

नोट: निंनलिखित में, चूहों और चूहों के ूकृ मापन के लिए एक विस्तृत नियमावली प्रदान की गई है, जो व्यक्तिगत विशिष्ट जरूरतों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

  1. सेट अप और पूर्व माप की तैयारी
    1. कंप्यूटर को चालू करें । के बाद प्रणाली को हटा दिया गया है, परीक्षण कक्ष के स्क्रीन पर बारी के रूप में अधिक विस्तार में वर्णित३७कहीं ।
    2. चूहों या चूहों की माप के लिए एक उपयुक्त मंच का चयन करें ।
      नोट: प्लेटफॉर्म आकार को कुतर के शरीर के आकार के आधार पर चुना गया है । पशु को आसपास चलने की क्षमता के बिना प्लेटफार्म पर ठीक से बैठ कर रहना चाहिए ।
    3. सॉफ़्टवेयर पर डबल-क्लिक करके पूर्व-सेटिंग्स विंडो खोलें, नया समूह चुनें और समूह नाम, विषयों की संख्या, प्रजातियों और उपभेदों का चयन करें. एक चर उत्तेजना का चयन करें: स्थानिक/लौकिक आवृत्ति, कंट्रास्ट संवेदनशीलता, गति या ओरिएंटेशन ड्रॉप-डाउन मेनू में, फिर नया समूह बनाएंदबाएं ।
    4. कक्ष के शीर्ष पर कैमरे के फोकस अंगूठी जोड़ तोड़ और संरेखित (खींचें और ड्रॉप) मंच पर काले घेरे के चारों ओर लाल वृत्त द्वारा प्रणाली जांचना द्वारा मंच पर ध्यान केंद्रित ।
  2. माप और विश्लेषण
    1. मंच पर पशु प्लेस, यह ~ 5 मिनट के लिए पर्यावरण के लिए अनुकूल है, तो यह (चित्रा 3ए) बूंदें मंच पर पशु वापस उठा ।
    2. सॉफ्टवेयर स्क्रीन (चित्र बी) के शीर्ष दाएं कोने पर विषय संख्या और शर्त का चयन करें । एक उत्तेजना चर रहा है, अंय उत्तेजनाओं लगातार रखा जाता है । यह खुला ताला या बंद ताला उत्तेजना के बगल में प्रतीक द्वारा की पुष्टि की है ।
    3. हां के लिए ◄ का चयन करके माप शुरू या नहीं, के लिए ■ अगर पशु पटरियों या ट्रैक, क्रमशः नहीं है ।
      नोट: दक्षिणावर्त ट्रैकिंग बाईं और दाईं आंख की सुइयों पर नज़र रखने के लिए संगत है । सॉफ्टवेयर बेतरतीब ढंग से चलती ग्रिड की दिशा बदल जाता है ।
    4. मैंयुअल रूप से ऊपर और नीचे चर उत्तेजना के बगल में तीर पर क्लिक करके उत्तेजना के चरण आकार का चयन करें या इसे अपने आप को सॉफ्टवेयर द्वारा अनुकूलित अगर उत्तेजना दहलीज एकाग्र ।
    5. इष्टतम परिणामों के लिए, पशु चेतन, उदाहरण के लिए, उच्च सीटी लगता है और रिक्त द्वारा, सॉफ्टवेयर स्क्रीन पर काले या सफेद बॉक्स प्रतीक पर क्लिक करके । लंबे समय तक माप के मामले में इन कार्यों को बार-बार करें ।
    6. डेटा विश्लेषण के लिए, सारांश टैब का चयन करें और फ़ाइल पर क्लिक करें । निर्यात तालिका/ग्राफ वांछित डेटा सेट निर्यात करने के लिए ।
    7. सांख्यिकीय वांछित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण प्रदर्शन (यह भी कदम 1.3.15 देखें) ।

Representative Results

3rd जनरेशन OCT इमेजिंग में myelin oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (मोग) पेप्टाइड प्रेरित प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित encephalomyelitis (EAE) माउस मॉडल का उपयोग करना, माउस रेटिना के उच्च-रिज़ॉल्यूशन रूपात्मक अनुभाग प्राप्त किए गए । इस तकनीक का प्रयोग करते हुए विभिन्न पदार्थों की सुरक्षात्मक क्षमताओं को17प्रदर्शन किया गया । भीतरी रेटिना परतों की मोटाई मूल्यों (IRL) प्राप्त रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं (RGC) रेटिना wholemounts की ऊतकवैज्ञानिक धुंधला द्वारा प्राप्त की संख्या के साथ अच्छे अनुसार में हैं (चित्रा 4).

ूकृ मॉनिटरिंग अक्टूबर तक देखा neurodegeneration का एक कार्यात्मक readout प्रदान करता है । इन प्रयोगों में, दृश्य समारोह ूकृ द्वारा स्थानिक आवृत्ति के रूप में मूल्यांकन किया है, और neuroaxonal नुकसान OCT द्वारा thinning IRL के रूप में मूल्यांकन, निकट सहसंबंध17में थे । विभिंन प्रोटोकॉल के लिए स्थानिक या लौकिक आवृत्ति, इसके विपरीत संवेदनशीलता, अभिविंयास या चलती ग्रिड की गति बदलकर दृश्य तीक्ष्णता की जांच करने के लिए नियोजित किया जा सकता है । EAE मॉडल में, ०.०५ चक्रों की एक बेहतर स्थानिक आवृत्ति/(सी/डी) 1 पदार्थ के साथ इलाज जानवरों के अनुपचारित मोग-EAE चूहों (चित्रा 5) की तुलना में पता चला था ।

Figure 1
चित्रा 1: अक्टूबर माप के लिए कस्टम धारक । (क) एक C57BL/6J माउस के अक्टूबर इमेजिंग कस्टम धारक३३ और (ख) कुतर आंख के आसपास रोटेशन धुरी का उपयोग कर । अनुप्रस्थ विमान में रोटेशन (बाएं) और अक्षीय विमान में (सही) का प्रदर्शन किया है । यह आंकड़ा Dietrich, एम. एट अल.३३से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: अक्टूबर पोस्ट अधिग्रहण विश्लेषण । "1, 2, 3 मिमी" ETDRS ग्रिड पर 25 B-स्कैन वॉल्यूम प्रोटोकॉल (बाएँ). रेटिना परतों की मोटाई सॉफ्टवेयर (दाएँ) द्वारा अलग रेटिना क्षेत्रों के लिए प्रदान की जाती है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: चूहों और उत्तेजना सेटिंग्स के ूकृ माप. (एक) कक्ष में मंच पर एक C57BL/6J माउस का विश्लेषण कैमरे के माध्यम से शीर्ष देखें । (ख) उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस और ूकृ सॉफ्टवेयर की सेटिंग्स । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: C57BL/6J चूहों मोग EAE के साथ एक तनु रोग पाठ्यक्रम दिखा जब इलाज नियंत्रण की तुलना में 1 पदार्थ के साथ इलाज किया । (क) भीतरी रेटिना परतों के अध... कम है (ख) और नैदानिक EAE स्कोर EAE पाठ्यक्रम के दौरान तनु है जब पदार्थ 1 प्रशासित किया गया था । चूहों दैनिक बनाए गए थे, और अक्टूबर माप १२० दिनों की अवधि में मासिक प्रदर्शन किया गया । रेखांकन मतलब है और समूह के प्रति कम से कम दस पशुओं के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । (*पी < ०.०५, * * *पी < ०.००१, वक्र के तहत क्षेत्र Dunnett की पोस्ट हॉक टेस्ट के साथ ANOVA की तुलना में) । (ग) IRL मोटाई परिवर्तन RGC हानि के साथ अच्छे अनुसार है (* * *पी < ०.००१, Dunnett के बाद मोग अनुपचारित चूहों की तुलना में परीक्षण के साथ ANOVA द्वारा) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: मोग-EAE के साथ C57BL/6J चूहों का ूकृ माप. (क) ूकृ से पता चलता है एक बेहतर दृश्य तीक्ष्णता के साथ इलाज किया जानवर 1 इलाज मोग EAE चूहों की तुलना में स्थानिक आवृत्ति दहलीज परीक्षण द्वारा मापा १२० दिनों की अवधि. रेखांकन का अर्थ है और मानक त्रुटि समूह प्रति (* *p < ०.०१, * * *p < ०.००१, वक्र के तहत क्षेत्र है Dunnett पोस्ट हॉक टेस्ट के साथ ANOVA की तुलना में) के अनुसार का प्रतिनिधित्व करते हैं । (ख) परीक्षण कक्ष में C57BL/6J माउस की छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल मोटाई माप और कुतर में दृश्य समारोह की परीक्षा के लिए एक अनुदेश प्रदान करता है । दृश्य readouts तेजी से अनुवाद अनुसंधान18,26,३८,३९,४० में उपयोग किया जाता है और आसानी से नैदानिक परीक्षणों के लिए हस्तांतरणीय हैं । पशु प्रयोगों में ऊतकवैज्ञानिक जांच की तुलना में अक्टूबर के महत्वपूर्ण लाभ यह है कि अनुदैर्ध्य विश्लेषण संभव गतिशील रोग प्रक्रियाओं की जांच की अनुमति है, काफी हद तक परिवर्तनशीलता और की संख्या को कम करने अध्ययन के प्रति जानवरों की जरूरत है । इसके अलावा, अक्टूबर के साथ vivo इमेजिंग में निर्धारण, काटने या दाग कलाकृतियों, जो ऊतकवैज्ञानिक जांच में परत मोटाई को प्रभावित कर सकता है के अधीन नहीं है ।

हालांकि, रेटिना के संबंध में सभी विमानों में लेजर बीम का ओर्थोगोनल ओरिएंटेशन, मोटाई मूल्यों की गुणवत्ता और reproducibility सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । यह अंवेषक के कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता है और OCT स्कैन के अधिग्रहण से पहले अनिवार्य है । इसके अतिरिक्त, के रूप में वाणिज्यिक उपकरणों मानव अनुप्रयोगों के लिए निर्मित कर रहे हैं, कुतर अक्टूबर छवियों की गुणवत्ता अभी भी मानव रोगियों के बी स्कैन की तुलना में हीन है । लेखकों के अनुभव में, यह मैनुअल सुधार के दौरान अलग भीतरी रेटिना परतों (रेटिना तंत्रिका फाइबर परत, नाड़ीग्रंथि सेल परत और भीतरी plexiform परत) भेद करने के लिए मुश्किल हो सकता है. इसलिए हम अनुशंसा करते है एक यौगिक readout (IRL) के रूप में इन परतों का विश्लेषण ।

प्रयोगात्मक सेटअप अस्थिर संज्ञाहरण के लिए एक विकल्प प्रदान करता है, जैसे, श्वसन isoflurane, जो हमारे अनुभव में है, सुरक्षित और आसान इंजेक्शन संज्ञाहरण से नियंत्रित करने के लिए, जैसे, ketamine-xylazine४१,४२ और जोखिम कम कर देता है अब अधिग्रहण समय के मामले में कुतर के समय से पहले जागृति (जैसे, फ्लोरोसेंट बला कोशिकाओं की इमेजिंग प्रदर्शन करते समय) । एक प्रारंभिक अध्ययन में, वॉल्यूम स्कैन उच्चतम वैधता और विश्वसनीयता के साथ प्रोटोकॉल के रूप में पहचाने गए । अंतर-ॅातृ और परीक्षण पुनर्परीक्षण विश्वसनीयता उत्कृष्ट था जब वॉल्यूम स्कैन ऑप्टिक डिस्क युक्त केंद्रीय भाग को छोड़कर आईसीसी के साथ मूल्यांकन किया गया (अंतर-वर्ग सहसंबंध गुणांक) सभी मूल्यांकन के लिए ०.८५ से ऊपर मान ।

optokinetic प्रतिक्रिया की माप अनैच्छिक optokinetic पलटा, जो एक लगातार चलती क्षेत्र के जवाब में होता है पर आधारित है । कुतर में, अन्य प्रजातियों के विपरीत, आंदोलन में न केवल आंखें शामिल हैं, लेकिन पूरे सिर, जो आसानी से कैमरे का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है ।

"ट्रैकिंग" या जानवरों के सामान्य व्यवहार आंदोलनों के बीच भेद अन्वेषक के कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता है और यह प्रयोगात्मक समूह के लिए अंधा हो करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, जानवरों के लिए प्रयोगात्मक सेटिंग के लिए और लंबे समय मापन प्रोटोकॉल के दौरान समायोजित करने के लिए एक अनुकूली चरण की जरूरत है, जानवरों को ूकृ दहलीज तक पहुँचने के लिए और कम करने के लिए नहीं है कि "कोई ट्रैकिंग" के कारण है आश्वासन देने के लिए बार-बार एनिमेटेड होना चाहिए ध्यान. वहां भी एक महत्वपूर्ण तनाव परिवर्तनशीलता प्रयोगशाला चूहों और चूहों४३,४४के दृश्य समारोह के बारे में है । इस प्रकार के दृश्य तीक्ष्णता का परीक्षण करने से पहले उनका मूल्यांकन किया जाना चाहिए और कुछ उपभेदों, जैसे SJL चूहों, भी ूकृ माप के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है, क्योंकि वे एलील Pde6brd1 (रेटिना अध: पतन 1) के लिए homozygous हैं.

संक्षेप में, पशु मॉडलों में रेटिना आकृति विज्ञान और दृश्य समारोह की परीक्षा EAE के संदर्भ में होने वाली संरचनात्मक और कार्यात्मक क्षति की गैर इनवेसिव, अनुदैर्ध्य जांच के लिए अनुमति देता है और दृश्य शामिल अन्य मॉडलों में सहायक हो सकता है प्रणाली सहित, लेकिन retinopathies या ऑप्टिक तंत्रिका चोट के मॉडलों तक ही सीमित नहीं है ।

Disclosures

प्रस्तुत काम करने के लिए असंबंधित लेखक निंनलिखित वित्तीय प्रकटीकरण की घोषणा:

माइकल Dietrich को नोवार्टिस से वक्ता मानदेय प्राप्त हुआ. एंड्रेस Cruz-Herranz राष्ट्रीय बहुल स्केलेरोसिस समाज का एक postdoctoral बंदे है । कृषि जे ग्रीन MedImmune, नोवार्टिस, OCTIMS, स्थापना 5 विज्ञान, और Bionure के वैज्ञानिक सलाहकार बोर्ड पर कार्य किया; जामा न्यूरोलॉजी के एक एसोसिएट संपादक है; न्यूरोलॉजी के एक संपादकीय बोर्ड के सदस्य थे; remyelination अणुओं और रास्ते के लिए एक पेटेंट रखती है; स्थापना 5 विज्ञान के लिए परामर्श; नोवार्टिस फार्मा OCTIMs, स्थापना विज्ञान SRA, NINDS, NIA, नेशनल एमएस सोसायटी, Sherak फाउंडेशन, और हिल्टन फाउंडेशन से अनुसंधान सहायता प्राप्त की; स्थापना 5 में स्टॉक या स्टॉक विकल्प रखती है; और माइलैन v टेवा फार्मा में एक विशेषज्ञ गवाह के रूप में कार्य किया । हंस-पीटर Hartung ने Biogen Idec, GeNeuro, सनोफी Genzyme, मर्क, नोवार्टिस फार्मास्यूटिकल्स, Octapharma, Opexa चिकित्सकीय, टेवा फार्मास्यूटिकल्स, MedImmune, बायर हेल्थकेयर, फॉरवर्ड फार्मा, से स्टीयरिंग समितियों पर सेवारत के लिए फीस प्राप्त की है और Roche, Biogen Idec, सनोफी Genzyme, मर्क, नोवार्टिस फार्मास्यूटिकल्स, Octapharma, Opexa चिकित्सकीय, टेवा फार्मास्यूटिकल्स, और Roche, और Biogen Idec, सनोफी Genzyme, मर्क, नोवार्टिस फार्मास्यूटिकल्स से व्याख्यान फीस से सलाहकार बोर्डों पर सेवारत के लिए शुल्क , Octapharma, Opexa चिकित्सीय, टेवा फार्मास्यूटिकल्स, MedImmune, और Roche । Philipp अल्ब्रेक्ट Ipsen, नोवार्टिस, Biogen के लिए वैज्ञानिक सलाहकार बोर्डों पर सेवारत के लिए मुआवजा प्राप्त; उन्होंने नोवार्टिस, टेवा, Biogen, Merz फार्मास्यूटिकल्स, Ipsen, Allergan, बायर हेल्थकेयर, Esai, यूसीबी और ग्लैक्सो स्मिथ Kline से स्पीकर मानदेय और ट्रैवल सपोर्ट प्राप्त किया; उन्होंने नोवार्टिस, Biogen, टेवा, Merz फार्मास्यूटिकल्स, Ipsen, और Roche से रिसर्च सपोर्ट प्राप्त किया । अंय लेखकों की रिपोर्ट कोई प्रकटीकरण नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के लिए डॉ रॉबर्ट Pfleger-फाउंडेशन और Ilselore Luckow-फाउंडेशन, साथ ही Biogen और फिलीस्तीनी अथॉरिटी को नोवार्टिस के अनुदान का समर्थन किया गया था । चित्र 1b से reproduced था "पूरे शरीर anaesthetized चूहों और चूहों की आंख इमेजिंग के लिए स्थिति जोड़तोड़: एक मत करो, यह अपने आप को गाइड । Dietrich, एम., क्रूज़-Herranz, ए., यिऊ, एच., Aktas, ओ., Brandt, ए. यू., Hartung, एचपी., ग्रीन, ए., अल्ब्रेक्ट, पी. बीएमजे ओपन नेत्र विज्ञान. 1 (1), e000008, २०१७ "बीएमजे प्रकाशन समूह लिमिटेड से अनुमति के साथ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heidelberg Spectralis HRA+OCT system  Heidelberg Engineering, Germany N/A ophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye Explorer Heidelberg Engineering, Germany N/A Version 1.9.10.0
blue 25D non-contact  lens Heidelberg Engineering, Germany N/A lens for rodent mesurement
OptoMotry CerebralMechanics Inc., Canada N/A system for visual function analysis
OptoMorty HD software CerebralMechanics Inc., Canada N/A Version 2.1.0
Inhalation Anesthetic Isoflurane Piramal Critical Care, Bethlehem, PA, USA  803250 inhalation anesthetic
Phenylephrin 2.5%-Tropicamide 0.5%  University Hospital Düsseldorf, Germany N/A pupillary dilation 
Visc-Ophtal Dr. Robert Winzer Pharma GmbH, Berlin, Germany 58407 ophthalmologic eye gel
GraphPad Prism GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA N/A statistical analysis software, Version 5.00
IBM SPSS Statistics IBM Corporation, Armonk, New York, USA N/A statistical analysis software, Version 20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Folgar, F. A., Jaffe, G. J., Ying, G. -S., Maguire, M. G., Toth, C. A. Comparison of optical coherence tomography assessments in the comparison of age-related macular degeneration treatments trials. Ophthalmology. 121 (10), 1956-1965 (2014).
  2. Mowatt, G., et al. Optical coherence tomography for the diagnosis, monitoring and guiding of treatment for neovascular age-related macular degeneration: a systematic review and economic evaluation. Health Technology Assessment. 18 (69), 1-254 (2014).
  3. Schlanitz, F. G., et al. Identification of Drusen Characteristics in Age-Related Macular Degeneration by Polarization-Sensitive Optical Coherence Tomography. American Journal of Ophthalmology. 160 (2), 335-344 (2015).
  4. Makiyama, Y., et al. Prevalence and spatial distribution of cystoid spaces in retinitis pigmentosa: investigation with spectral domain optical coherence tomography. Retina. 34 (5), 981-988 (2014).
  5. Al Rashaed, S., Khan, A. O., Nowilaty, S. R., Edward, D. P., Kozak, I. Spectral-domain optical coherence tomography reveals prelaminar membranes in optic nerve head pallor in eyes with retinitis pigmentosa. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 22, (2015).
  6. Albrecht, P., et al. Retinal pathology in idiopathic moyamoya angiopathy detected by optical coherence tomography. Neurology. 85 (6), 521-527 (2015).
  7. Albrecht, P., Fröhlich, R., Hartung, H. -P., Kieseier, B. C., Methner, A. Optical coherence tomography measures axonal loss in multiple sclerosis independently of optic neuritis. Journal of Neurology. 254 (11), 1595-1596 (2007).
  8. Albrecht, P., et al. Retinal neurodegeneration in Wilson's disease revealed by spectral domain optical coherence tomography. PLoS One. 7 (11), e49825 (2012).
  9. Albrecht, P., et al. Optical coherence tomography in parkinsonian syndromes. PLoS One. 7 (4), e34891 (2012).
  10. Albrecht, P., et al. Degeneration of retinal layers in multiple sclerosis subtypes quantified by optical coherence tomography. Multiple Sclerosis Journal. 18 (10), 1422-1429 (2012).
  11. Bhaduri, B., et al. Detection of retinal blood vessel changes in multiple sclerosis with optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 7 (6), 2321-2330 (2016).
  12. Knier, B., et al. Optical coherence tomography indicates disease activity prior to clinical onset of central nervous system demyelination. Multiple Sclerosis Journal. 22 (7), 893-900 (2016).
  13. Ringelstein, M., et al. Subtle retinal pathology in amyotrophic lateral sclerosis. Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (4), 290-297 (2014).
  14. Ringelstein, M., et al. Retinal pathology in Susac syndrome detected by spectral-domain optical coherence tomography. Neurology. 85 (7), 610-618 (2015).
  15. Satue, M., et al. Relationship between Visual Dysfunction and Retinal Changes in Patients with Multiple Sclerosis. PLoS One. 11 (6), e0157293 (2016).
  16. Thomson, K. L., Yeo, J. M., Waddell, B., Cameron, J. R., Pal, S. A systematic review and meta-analysis of retinal nerve fiber layer change in dementia, using optical coherence tomography. Alzheimer's & Dementia. 1 (2), 136-143 (2015).
  17. Dietrich, M., et al. Early alpha-lipoic acid therapy protects from degeneration of the inner retinal layers and vision loss in an experimental autoimmune encephalomyelitis-optic neuritis model. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 71 (2018).
  18. Knier, B., et al. Neutralizing IL-17 protects the optic nerve from autoimmune pathology and prevents retinal nerve fiber layer atrophy during experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Autoimmunity. 56, 34-44 (2014).
  19. Augustin, M., et al. In Vivo Characterization of Spontaneous Retinal Neovascularization in the Mouse Eye by Multifunctional Optical Coherence Tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (5), 2054-2068 (2018).
  20. Tode, J., et al. Thermal Stimulation of the Retina Reduces Bruch's Membrane Thickness in Age Related Macular Degeneration Mouse Models. Translational Vision Science & Technology. 7 (3), 2 (2018).
  21. Gabriele, M. L., et al. Optic nerve crush mice followed longitudinally with spectral domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2250-2254 (2011).
  22. Carpenter, C. L., Kim, A. Y., Kashani, A. H. Normative Retinal Thicknesses in Common Animal Models of Eye Disease Using Spectral Domain Optical Coherence Tomography. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 157-166 (2018).
  23. Alam, N. M., et al. A mitochondrial therapeutic reverses visual decline in mouse models of diabetes. Disease Models & Mechanisms. 8 (7), 701-710 (2015).
  24. Bricker-Anthony, C., Rex, T. S. Neurodegeneration and Vision Loss after Mild Blunt Trauma in the C57Bl/6 and DBA/2J Mouse. PLoS One. 10 (7), e0131921 (2015).
  25. Segura, F., et al. Assessment of Visual and Chromatic Functions in a Rodent Model of Retinal Degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6275-6283 (2015).
  26. Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
  27. Ward, M. E., et al. Individuals with progranulin haploinsufficiency exhibit features of neuronal ceroid lipofuscinosis. Science Translational Medicine. 9 (385), (2017).
  28. Chauhan, B. C., et al. Longitudinal in vivo imaging of retinal ganglion cells and retinal thickness changes following optic nerve injury in mice. PLoS One. 7 (6), e40352 (2012).
  29. Lidster, K., et al. Neuroprotection in a novel mouse model of multiple sclerosis. PLoS One. 8 (11), e79188 (2013).
  30. Munguba, G. C., et al. Nerve fiber layer thinning lags retinal ganglion cell density following crush axonopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (10), 6505-6513 (2014).
  31. Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy. Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
  32. Leung, C. K. S., et al. In vivo imaging of murine retinal ganglion cells. Journal of Neuroscience Methods. 168 (2), 475-478 (2008).
  33. Dietrich, M., et al. Whole-body positional manipulators for ocular imaging of anaesthetised mice and rats: A do-it-yourself guide. BMJ Open Ophthalmology. 1 (1), e000008 (2017).
  34. Cruz-Herranz, A., et al. The APOSTEL recommendations for reporting quantitative optical coherence tomography studies. Neurology. 86 (24), 2303-2309 (2016).
  35. Tewarie, P., et al. The OSCAR-IB consensus criteria for retinal OCT quality assessment. PLoS One. 7 (4), e34823 (2012).
  36. Fan, Q., Teo, Y. -Y., Saw, S. -M. Application of advanced statistics in ophthalmology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (9), 6059-6065 (2011).
  37. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  38. Groh, J., Stadler, D., Buttmann, M., Martini, R. Non-invasive assessment of retinal alterations in mouse models of infantile and juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis by spectral domain optical coherence tomography. Acta Neuropathologica Communications. 2, 54 (2014).
  39. Seeliger, M. W., et al. In vivo confocal imaging of the retina in animal models using scanning laser ophthalmoscopy. Vision Research. 45 (28), 3512-3519 (2005).
  40. Shindler, K. S., Guan, Y., Ventura, E., Bennett, J., Rostami, A. Retinal ganglion cell loss induced by acute optic neuritis in a relapsing model of multiple sclerosis. Multiple Sclerosis Journal. 12 (5), 526-532 (2006).
  41. Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice. Experimental Eye Research. 42 (4), 331-337 (1986).
  42. Szczesny, G., Veihelmann, A., Massberg, S., Nolte, D., Messmer, K. Long-term anaesthesia using inhalatory isoflurane in different strains of mice-the haemodynamic effects. Zeitschrift für mikroskopisch-anatomische Forschung. 38 (1), 64-69 (2004).
  43. Prusky, G. T., Harker, K., Douglas, R. M., Whishaw, I. Q. Variation in visual acuity within pigmented, and between pigmented and albino rat strains. Behavioural Brain Research. 136 (2), 339-348 (2002).
  44. Wong, A. A., Brown, R. E. Visual detection, pattern discrimination and visual acuity in 14 strains of mice. Genes, Brain, and Behavior. 5 (5), 389-403 (2006).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक १४३ ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी optokinetic प्रतिक्रिया नेत्र इमेजिंग दृश्य मार्ग धारक कुतर मॉडल
चूहों और चूहों में संरचनात्मक और कार्यात्मक दृश्य प्रणाली Readouts के रूप में ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी और Optokinetic प्रतिक्रिया का उपयोग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dietrich, M., Hecker, C., Hilla, A., … More

Dietrich, M., Hecker, C., Hilla, A., Cruz-Herranz, A., Hartung, H. P., Fischer, D., Green, A., Albrecht, P. Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (143), e58571, doi:10.3791/58571 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter