Summary

Capture et Identification des protéines de liaison à l’ARN à l’aide de Click chimie assistée par ARN-interactome Capture stratégie (CARIC)

Published: October 19, 2018
doi:

Summary

Un protocole détaillé pour l’application de la clic chimie assistée par RNA-interactome capture (CARIC) stratégie pour identifier les protéines liant les deux codage et non codantes RNAs est présenté.

Abstract

Une identification complète des protéines de liaison à l’ARN (pratiques commerciales restrictives) est essentielle pour comprendre le réseau de régulation post-transcriptionnelle dans les cellules. Une stratégie largement utilisée pour la capture des RBP exploite la polyadénylation [poly (a)] de l’ARN cible, qui se produit principalement sur des ARNm eucaryotes matures, laissant la plupart des protéines liant de non-poly(A) ARN non identifiés. Nous décrivons ici les procédures détaillées d’une méthode récemment appelé clic chimie assistée par RNA-interactome capture (CARIC), qui permet la capture de transcriptome à l’échelle des pratiques commerciales restrictives des poly (a) et non-poly(A) en combinant le marquage métabolique de RNAs in vivo UV réticulation et marquage de bioorthogonal.

Introduction

Le génome humain est transcrite en différents types d’ARN codantes et non codantes (ncRNA), y compris les ARNm, rRNA, ARNt, petits ARN nucléaires (snRNA), petits ARN nucléolaires (ARNpno) et longtemps non-codage RNAs (lncRNAs)1. La plupart de ces ARN possède des vêtements des pratiques commerciales restrictives et fonction ribonucléoprotéique particules (RNP)2. Par conséquent, une identification complète des pratiques commerciales restrictives est une condition sine qua non pour comprendre le réseau de régulation entre les ARN et les pratiques commerciales restrictives, qui est impliqué dans diverses maladies humaines3,4,5.

Ces dernières années ont vu un grand élan de pratiques commerciales restrictives découvert dans divers systèmes eucaryotes2,6, y compris humaine7,8,9,10,11, souris12,13,14, levure9,15,16, zebrafish17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22et parasites de l’homme23,24,25 . Ces avances ont été facilitées par une stratégie de capture RBP développé par Castello et al. 7 et Baltz et al. 8 en 2012, qui combine en vivo UV réticulation des ARN et ses protéines qui interagissent, oligo (décollement) capture des poly RNAs et spectrométrie de masse (MS)-base de profilage protéomique. Toutefois, compte tenu du fait que poly (a) existe pour la plupart sur l’ARNm mature, qui représentent seulement environ 3 % – 5 % du transcriptome eucaryotes26, cette stratégie largement utilisée n’est pas capable de capturer des pratiques commerciales restrictives interagissant avec non-poly(A) ARN, dont la plupart ncRNA et pré-ARNm.

Nous rapportons ici les modalités d’une stratégie développée récemment pour la capture de l’échelle du transcriptome de pratiques commerciales restrictives à la poly (a) et non-poly(A)27. Appelé CARIC, cette stratégie combine en vivo UV réticulation et marquage métabolique d’ARN avec photoactivatable et « cliquables » analogues nucléosidiques (qui contiennent un groupe fonctionnel bioorthogonal pouvant participer à la réaction de clic), 4 – thiouridine (4SU) et 5-ethynyluridine (UE). Les étapes indispensables pour obtenir des résultats idéales avec la stratégie CARIC sont marquage métabolique efficace, réaction de réticulation et cliquez sur UV et le maintien de l’intégrité de la RNA. Cu (i) utilisé comme catalyseur dans la réaction de clic peut provoquer la fragmentation du RNAs, un ligand de Cu (i) qui peut de réduire la fragmentation de RNA est essentiel. Nous décrivons comment effectuer des réactions efficaces cliquez dans les lysats cellulaires sans causer de grave dégradation de l’ARN.

Bien que RBP capture et identification dans les cellules HeLa seulement est décrite dans le présent protocole, la CARIC stratégie peut être appliquée à différents types de cellules et éventuellement aux organismes vivants. En plus de la capture de la RBP, ce protocole prévoit également simplifiée des procédures pas à pas pour la préparation de l’échantillon MS et identification des protéines et la quantification, qui peut être utile pour ceux qui ne connaissent pas proteomic expériences.

Protocol

ATTENTION : Quand il y a lieu, les réactifs utilisés doivent être achetés sous forme de RNase-libre, ou dissous dans exempte de RNase, solvants (pour la plupart des cas, au diéthyl pyrocarbonate (DEPC)-eau traitée). Lors de la manipulation des échantillons d’ARN et de réactifs de RNase-libre, toujours porter des gants et des masques et changez-les fréquemment pour éviter toute contamination de la RNase. 1. préparation du lysat de métaboliquement marqués et UV cellules réticulée…

Representative Results

Les résultats représentatifs des étapes de contrôle qualité sont présentés. Les résultats incluent des chiffres de l’analyse par fluorescence en gel décrit à l’étape 2.3.2 (Figure 1), l’analyse par transfert western décrit à l’étape 4.1.3 (Figure 2 a) et l’analyse de coloration à l’argent décrite à l’étape 4.2.2 (Figure 2 b). Les mesures de contrôle de la qualité son…

Discussion

La préservation de l’intégrité de RNA juste est l’une des clés du succès CARIC expériences. Dégradation de l’ARN peut être significativement réduite avec les ligands appropriés de Cu (i) et opération minutieuse, bien qu’on observe une dégradation partielle. Les ratios de substitution d’UE et 4SU en échantillons expérimentaux sont 1,18 % et 0,46 %, respectivement (données non présentées). Pour ARN intact d’une longueur de 2 000 nt, environ 90 % des ARN contiennent au moins une UE et un 4SU. Po…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail est soutenu par la National Natural Science Foundation de Chine subventions 91753206, 21425204 et 21521003 et par le National clé de recherche et projet de développement 2016YFA0501500.

Materials

HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1

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Cite This Article
Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).

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