Summary
ويصف هذا الأسلوب تسجيل الوقت الحقيقي لاستهلاك الأوكسجين ومعدلات تحمض خارج الخلية في أنسجة الشبكية الماوس اكسبلانتيد محلل تدفق خارج الخلية باستخدام.
Abstract
رؤية عالية الحدة عملية استهلاك الطاقة بشكل كبير، والشبكية وقد وضعت عدة تعديلات فريدة من نوعها لتلبية هذه الطلبات مع المحافظة على الشفافية للمحور البصري تحديداً. اضطرابات بهذا التوازن الدقيق يسبب الأمراض المسببة للعمى، مثل اعتلال الشبكية السكري. ولذلك لا بد من تطوير العلاج العقلاني للأسباب المختلفة لفقدان الرؤية فهم تغيرات استقلاب الطاقة في الشبكية أثناء المرض. ظهور المحلﻻت التمويه المتاحة تجارياً خارج الخلية الأخيرة جعلت دراسة الأيض الطاقة الشبكية أكثر يسرا. ويصف هذا البروتوكول استعمال هذه محلل قياس المساهمات لإمدادات الطاقة الشبكية من خلال أسلحتها مبدأ اثنين-الفسفرة وتحلل-بالتحديد الكمي للتغيرات في معدلات استهلاك الأوكسجين (OCR) وخارج الخلية معدلات التحمض (عكر) كوكلاء لهذه المسارات. يتم تنفيذ هذا الأسلوب سهولة في نسيج الشبكية اكسبلانتيد، تيسير تقييم الاستجابات لعدة عوامل دوائية في تجربة واحدة. تتم مقارنة التوقيعات الأيضي في شبكية العين من الحيوانات التي تفتقر إلى ورود إشارات مستقبله إلى البرية من نوع عناصر التحكم باستخدام هذا الأسلوب. قيداً رئيسيا في هذه التقنية هو عدم القدرة على التمييز بين استخدام الطاقة داركادابتيد وتتكيف مع الضوء، الاعتبارات الفسيولوجية هامة في نسيج الشبكية.
Introduction
شبكية العين بين أنسجة معظم الطاقة تطالب في الجهاز العصبي المركزي1. مثل معظم الأنسجة، فإنه ينشئ الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق تحلل في سيتوسول أو عن طريق الفسفرة في الميتوكوندريا. ميزة حيوية من الفسفرة على تحلل لإنتاج ATP من جزيء واحد من السكر واضح: 36 جزيئات ATP الناتجة السابق مقابل 2 جزيئات ATP التي تم إنشاؤها من هذا الأخير. وبناء على ذلك، الخلايا العصبية الشبكية تعتمد أساسا على التنفس المتقدرية للإمداد بالطاقة وهذا ينعكس على كثافة عالية من الميتوكوندريا2. حتى الآن، الشبكية أيضا تعتمد اعتماداً كبيرا على الآلات جليكوليتيك حتى في حالة وفرة الأوكسجين. ووصفت هذه العملية تحلل الهوائية أصلاً في الخلايا السرطانية "أوتو واربورغ"3، الذين مرة لاحظ أن الشبكية الأنسجة فقط بعد انتهاء الانقسامية قادرة على هذا الشكل من الأيض4. منذ تلك الملاحظات الأولية، وقد وصف العديد من الأنسجة الانقسامية بعد القيام بدرجات متفاوتة من تحلل بالإضافة إلى الفسفرة لتلبية مطالبهم ATP.
فوتوترانسدوكشن، والصباغ البصرية إعادة التدوير، والتركيب الحيوي من شرائح الخارجي مستقبله، ونشاط متشابك، جميع العمليات تطلبا الطاقة في فوتوريسيبتورس، فئة فرعية العصبية الغالبة في الشبكية. ولكن الحاجة إلى النقل بنشاط الأيونات ضد تلك الكهربائية والتدرجات وتركيز هو إلى حد بعيد عملية تستهلك أكثر قوة في الخلايا العصبية1. فوتوريسيبتورس هي غريبة من الخلايا العصبية في الإحساس بأنهم ديبولاريزيد في غياب التحفيز (أي في الظلام)، بينما حافزا خفيفة يؤدي إغلاق القناة وفرط الاستقطاب اللاحقة. ولذلك، يستهلك الشبكية في الظلام، وكميات كبيرة من ATP الحفاظ على ديبولاريزيشن أو "الحالي الظلام" كما يطلق عليه عادة. من وجهة نظر تكيفية، تحديا كبيرا في توفير هذه الكميات الضخمة من ATP هو الحاجة للكائنات الحية للحفاظ على الوضوح البصري عن طريق المحور البصري. البنية الشبكية المقلوبة ينظر في المخلوقات الحديثة هو الحل المهيمنة، كما أنها تحافظ على الشبكة الشعرية الكثيفة توفير photoreceptors بعيداً عن مسار الضوء. ولكن هذه معجزة الهندسة البيولوجية الطبيعية يضع الشبكية في هاوية من حيث الاحتياطي الأيضية. الشتائم حتى الصغيرة للشبكية يمكن أن تعطل يحتمل أن التوازن الدقيق لإمدادات الطاقة للطلب، والخلل البصري أو عمي الصريح قد تنشأ بسرعة.
نظراً لمتطلبات حيوية فريدة من نوعها الشبكية العصبية، مقرونا قيود مشددة إمدادات الأوعية الدموية، ويمكن أن يكون القياس الدقيق لاستهلاك ATP في الشبكية والتغييرات أثناء المرض آثار عميقة في فهم وعلاج الظروف المسببة للعمى مثل التهاب الشبكية الصباغي، واعتلال الشبكية السكري. عادة، تتطلب هذه القياسات معدات مكلفة، ومصممة خصيصا مع معظم الدراسات الناشئة من حفنة من مختبرات مكرسة تماما لقياس النشاط الأيضي2،،من56، 7،8. وتشمل تقنيات الاختبارات الفردية لنواتج الأيض محددة، دراسات التتبع باستخدام الراديو المسمى السلائف، استهلاك الأكسجين تسجيل باستخدام أقطاب كلارك والتنميط9metabolomic.
مع التقدم في تكنولوجيا عالية الإنتاجية، وزيادة توافر الأجهزة التجارية، تقنيات الأيض الشبكية سجل متزايدة وميسورة التكلفة. الأسلوب الموصوفة هنا يقيس كلا الفسفرة وتحلل في الشبكية باستخدام اكسبلانتيد الأنسجة والتمويه متاحة تجارياً خارج الخلية محلل9،10،،من1112. هذا المحلل بشكل منفصل يسجل معدل استهلاك الأوكسجين (OCR) ومعدل تحمض خارج الخلية (عكر)، بمثابة المؤشرات غير المباشرة من الفسفرة وتحلل، على التوالي13. وتتم هذه القياسات بتحقيق سوبميرسيد داخل ميكروتشامبير تم إنشاؤها عبر الأنسجة لمصلحة. يستخدم هذا التكيف من أساليب المنشورة سابقا لوحة التقاط مصممة أصلاً للبنكرياس جزر لانجرهانز لتسجيل النشاط الأيضي في مقاطع صغيرة، دائرية الشبكية الماوس. يمكن تسليم التعرض دوائية متعددة للأنسجة أثناء تسجيل واحد لأن النظام يحتوي على 4 منافذ حقن لكل عينة أيضا. باستخدام هذا النظام مع بروتوكولات منفصلة الأمثل لتسجيلات عكر والتعرف الضوئي على الحروف، يمكن مقارنة ردود البرية من نوع شبكية العين على شبكية العين التي تفتقر إلى ترانسدوسين (Gnat1--/--)، سببا من أسباب خلقية ثابتة من العمى الليلي في 14من البشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تابعت رابطة البحوث في الرؤية وبيان العيون "استخدام الحيوانات" البروتوكولات وأقرتها جامعة واشنطن.
1-إعداد الحيوان
- الحفاظ على الحيوانات في الإسكان القياسية مع 12 ساعة الظلام إلى دائرة الضوء 12 ساعة. بدء تجارب في توحيد مرات لتجنب التأثيرات الإيقاعية، عادة في الصباح بعد أن يتم تشغيل أضواء.
2. إعداد الحل
- إعداد قاعدة الوسائط بتذويب 8.4 ملغم من مسحوق وسائل الإعلام في المقطر مزدوجة ح2س (ddH2س) وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع HCl أو هيدروكسيد الصوديوم، إلى وحدة تخزين نهائي 1 تعقيم L. عامل التصفية هذا الحل مع عامل تصفية زراعة الأنسجة 0.22 ميكرومتر.
- إضافة الجلوكوز 1 م وبيروفات صوديوم 100 مم إلى وسائل الإعلام لبلوغ النهائي تركيزات الجلوكوز 5 مم وبيروفات 1 مم.
- مكان قاسمة 50 مل الإعلام قاعدة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- إعداد حل تحلل، للأنسجة كوانتيتيشن في نهاية التحليل، والتمويه بإضافة قاعدة تريس إلى 10 ملم، والبولي إيثيلين غليكول ثالثي-أوكتيلفينيل الاثير إلى 0.2% (v/v)، وادتا إلى 1 ملم، كل ما في ddH2ميكس O. حتى كافة المكونات تماما بحل وضبط درجة الحموضة إلى 8.0.
- بروتوكول المتقدرية الإجهاد، تعد أسهم ميكرومتر 11 من أوليجوميسين، مثبط ATP Synthase، حلت في وسائل الإعلام قاعدة لاستهداف تركيز نهائي من 1 ميكرومتر في البئر. إعداد أسهم 11 ميكرومتر الكربونيل السيانيد--4--(تريفلوروميثوكسي) فينيلهيدرازوني (فككب)، عامل يفصل، حلت في وسائل الإعلام قاعدة لاستهداف تركيز نهائي من 1 ميكرومتر في البئر. إعداد كوكتيل مثبطات سلسلة نقل الإلكترون، والروتينون، وأنتيميسين أ (RAA) عن طريق إضافة والروتينون 11 ميكرومتر وأنتيميسين أ إلى 22 ميكرومتر، حلت في وسائل الإعلام قاعدة لاستهداف تركيز نهائي والروتينون ميكرومتر 1 و 2 ميكرومتر أنتيميسين أ في جيدا.
- للبروتوكول، وتحلل إعداد مخزون 220 ملم من الجلوكوز المذاب في قاعدة وسائل الإعلام، وتستهدف تركيز نهائي من 20 مم في البئر. كما تعد مخزون 1.1 م 2-ديوكسيجلوكوسي (2-المديرية العامة)، ومثبط تنافسي للسكر وخصم glycolytic، قبل حلها في الوسائط الأساسية. وسيستهدف هذا تركيز نهائي من 100 مم 2-المديرية العامة في البئر.
3-أداة المعايرة
- لمعايرة الأجهزة مقايسة الجريان خارج الخلية، أضف 1 مل من محلول المعايرة لكل بئر من خرطوشة الاستشعار (مجموع الآبار 24) واحتضان في 37 درجة مئوية في CO2-الحرة حاضنة بين عشية وضحاها (أو على الأقل ح 8).
- تحميل إضافات للبروتوكول الإجهاد المتقدرية أو بروتوكول تحلل في كل منفذ حاقن، أ إلى د، على استشعار خرطوشة، التكيف للتغيرات في الحجم في البئر.
ملاحظة: على سبيل مثال، تشمل مقايسة نموذجية ميليلتر 45 من مادة مضافة إلى أول ميناء حاقن، ميليلتر 49.5 في الثانية، ميليلتر 54.5 في ميليلتر الثالثة، و 60 إلى آخر، على افتراض وحدة تخزين جيدا أولية من 450 ميليلتر. - أثناء تجارب عدة الأول، تحميل الوسائط قاعدة منفذ A لقياس مقدار حركة الأنسجة/الحرفية يحدث بعد حقنه منفذ.
- تسمح لوحة الاستشعار محملة احتضانها في 37 درجة مئوية في حاضنة غير CO2 لمدة 60 دقيقة على الأقل.
4-عزل نسيج الشبكية الماوس جديدة
ملاحظة: هذه الخطوة مقتبسة من أسلوب الدكتور باري وينكلر15.
- بعد إدارة التخدير العميق استخدام كوكتيل الكيتامين/xylazine قياسية، euthanize الفئران بخلع عنق الرحم.
- استخدام زوج من الملقط منحنى المتوسطة على فهم العالم الخلفي في العصب البصري وتطبيق الضغط إلى الأمام بلطف إلى برتوس العين (الشكل 1A).
- مع شفرة حلاقة نظيفة، إنشاء شق ليمبوس إلى ليمبوس عبر القرنية باستخدام ممر واحد ومتعمدة من الشفرة.
- استخدام غرامة، قرصه الزاوية طراز ماكفرسون الملقط، العالم الخلفي للتعبير عن العدسة والأغشية الوثيرة الأمامي من شق القرنية. تجاهل هذه الأنسجة.
- كرر المناورة معسر مع الملقط للتعبير عن الشبكية العصبية.
- استخدام الملقط مثل ملعقة رفع شبكية العين، بدلاً من أن يمسك الأنسجة، نقل الشبكية بعيداً عن شق القرنية ومكان مباشرة إلى وسائل الإعلام الحار في طبق 3 سم أو صفيحة كتلة زراعة الأنسجة 6-جيدا.
- استخدام اثنين من أزواج من الملقط ماكفرسون على غرار غرامة، والزاوية بلطف تشريح زجاجي المتبقية من الشبكية. وهذا هو الأفضل القيام باستيعاب زجاجي على هامش كأس الشبكية وسحب نحو المركز، مع ديسينسيرشن نهائي للجسم الزجاجي من المركز ككل. استخدام الملقط، إزالة أي ظهارة صباغ الشبكية المتبقية من سطح الشبكية مستقبله.
- قص تلميح بيبيت P1000 بشفرة حلاقة لإنشاء افتتاح ~ 4 ملم لمنع الصدمات لا مبرر له لنسيج الشبكية الحساسة أثناء نقل هذه المناورات.
- نقل نسيج الشبكية معزولة في وسائط جديدة باستخدام تلميح بيبيت P1000 قص.
- قطع اللكمات 1 مم من الشبكية حول العصب البصري مع خزعة 1 مم لكمه مزودة بالمكبس لإزاحة الأنسجة في حالة يصبح قدمت إلى تتحمل (الشكل 1B). تعيين اللكمات الشبكية جانبا في وسائل الإعلام نظيفة أبقى على كتلة 37 درجة مئوية أو تدفئة وسادة.
5-فحص بروتوكول
- نقل اللكمات الفردية إلى ميكروسكوبية التقاط جزيرة 24-جيدا استخدام تلميح P1000 قص، يسفط ميليلتر 450 من وسائل الإعلام جنبا إلى جنب مع الأنسجة.
- استخدام غرامة، الملقط مستقيم للتلاعب بلطف اللكمات داخل المركز من الميكروسكوبية. الاحتفاظ باللكمات الموجه في نفس اتجاه (مثلاً، العقدة خلية الجانب صعودا).
- ضع لوحة الاستيلاء على وسادة تدفئة أو التسخين مجموعة كتلة إلى 37 درجة مئوية، يتم تكرار هذه الخطوات للعينات المتبقية.
ملاحظة: لكل تجربة، جانبا 3-4 آبار فارغة مع 450 ميليلتر من قاعدة وسائل الإعلام لتكون بمثابة عناصر سلبية. في 20-21 الآبار المتبقية، اختبار كل تكرار بيولوجي في ثلاث نسخ. ولهذا سيسمح لتسجيل كل لوحة 24-جيدا من الحيوانات المختلفة أو ظروف العلاج من 6-7.
- ضع لوحة الاستيلاء على وسادة تدفئة أو التسخين مجموعة كتلة إلى 37 درجة مئوية، يتم تكرار هذه الخطوات للعينات المتبقية.
- تجنب فقاعات الهواء، الموقف بلطف الجزيرة التقاط إدراجات مش في كل منها أيضا استخدام الملقط وتأمين تدرج مع المكبس معدني أو بتلميح بيبيت P1000 قطع (الشكل 1 ج).
ملاحظة: تجنب حركة الأنسجة المفرط أثناء هذه الخطوة الحفاظ على موقف لكمه الشبكية داخل المركز ميكروتشامبير عينة. فقاعات الهواء شدة تشويه قراءات التعرف الضوئي على الحروف. على الرغم من أن ميكروتشامبير عمق كاف لاستيعاب الماوس المعتاد الشبكية (الشكل 1)، أحياناً قد يتسبب في عيوب القطع في يدخل مش الأنسجة تصبح ضغط مفرط أثناء الإدراج الشاشة. إذا حدث هذا، ببساطة تقديم مذكرة من الأنسجة سحقت واستبعاد تلك العينة من التحليل النهائي. - احتضان لوحة الأنسجة في 37 درجة مئوية CO2-حاضنة مجاناً لمدة 60 دقيقة على الأقل.
- برنامج محلل الجريان خارج الخلية باستخدام مزيج، والانتظار، والتدبير، وتكرار الأوامر. على سبيل مثال، قد تتضمن تجربة نموذجية مع نسيج الشبكية التالية: مزيج 2 دقيقة وانتظر دقيقتين وقياس مدة 5 دقائق. تكرار التجربة مع هؤلاء الثلاثة خطوات بين 5-8 مرات (دورات) لتسجيل خط أساس، وبعد حقن لكل مجمع يجري اختبارها أثناء التشغيل.
- اضغط على زر بدء البرنامج على محلل التدفق خارج الخلية، واتبع الإرشادات على الشاشة لإدراج خرطوشة استشعار للمعايرة.
- في نهاية المعايرة، اتبع الإرشادات على الشاشة لتحل محل لوحة كاليبرانت مع اللوحة التي تحتوي على عينات الشبكية.
- السماح للبرنامج بتشغيل، حسب ما هو مبرمج. عند انتهاء التشغيل، اتبع الإرشادات على الشاشة لإخراج لوحة الأنسجة. قم بعرض نتائج التشغيل وتخزين ملف البيانات.
- مع بنت قياس 20 إبرة والملقط، إزالة جميع مش إدراجات من الآبار، تاركين لكمه الشبكية.
- عناية نضح وسائل الإعلام من الأنسجة وغسل الأنسجة مرتين مع 0.5 مل من المحلول الملحي الباردة مخزنة الفوسفات (PBS). نضح برنامج تلفزيوني بعد الغسيل.
- إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل لكل بئر وبيبيت صعودا وهبوطاً لمجانسة الأنسجة.
- كوانتيتاتي مستويات المدخلات على أساس مجموع مزدوج تقطعت الحمض النووي (dsDNA) أو محتوى البروتين الكلي.
ملاحظة: التالي يستند إلى مقايسة دسدنا متاحة تجارياً. - تمييع تفكيك عينات 1:1 بإضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت تريس يدتا (TE) ونقل 100 ميليلتر من العينة المخففة للوحة جيدا 96.
- إضافة 100 ميليلتر من الكشف عن المخزن المؤقت في كل بئر. وبعد الخلط لمدة 2-5 دقائق، كوانتيتاتي fluorescence بعد الإثارة في 480 نانومتر والانبعاثات في 520 نانومتر، مقارنة لمنحنى قياسي.
- تطبيع تعقب التدفق خارج الخلية الخام إلى محتوى الحمض النووي داخل البئر.
ملاحظة: في النتائج المعروضة هنا، يتم تطبيع عينات إلى 50 نانوغرام دسدنا-كمية نموذجية لكمه شبكية 1 مم. ولذلك، يمكن مقارنة القيم المطلقة المقدمة هنا إلى دراسات عرض البيانات "لكل لكمه الشبكية". تطبيع وسم بمعيار داخلية، مثل تشغيل خط الأساس بتركيز جلوكوز 5 ملم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام تقنيات وصف (الملخصة في الشكل 1)، explants الشبكية من 8 أسبوع البرية نوع (WT) الفئران كانت مقارنة بالعمر والخلفية مطابقة ترانسدوسين فارغة الفئران (Gnat1--/--). للحيوانات-/- Gnat1تفتقر إلى إليه لإغلاق دوري النوكليوتيدات بوابات قنوات أيونات في الاستجابة للمحفزات الخفيفة، ويبقى على فوتوريسيبتورس رود ديبولاريزيد حتى في ضوء14. اللاحقة بحاجة إلى الحفاظ على افلوكس البوتاسيوم من شأنه أن يخلق طلب ATP كبير، أدى إلى إجهاد الطاقة البيولوجية. لتحديد إذا كانت هذه التحولات في الطلب على الطاقة سيزيد الفسفرة أو التمويه glycolytic، قورنت الأنسجة من النوع المتوحش الفئران والفئران-/- Gnat1استخدام محلل الجريان خارج الخلية. في الأساس، وحضور الجلوكوز 5 مم و 1 مم بيروفات، أنسجة الشبكية من الحيوانات البرية من نوع معدلات مماثلة من حمض افلوكس مقارنة بطفرات-/- Gnat1. وينظر إلى أنماط مماثلة بعد إضافة الجلوكوز 20 مم ومثبط جليكوليتيك 2-المدير العام (الشكل 2A). قد أيضا تحويل هذه البيانات إلى تمثل تغييرات جزئية من خط الأساس (الشكل 2)، شكل الذي قد يسمح لتحسين المقارنة بين مختلف التدخلات التجريبية رياضيا.
مطلق التعرف الضوئي على الحروف في خط ما يعادل بين وزن ونسيج الشبكية المسخ (الشكل 3A). إضافة 20 مم الجلوكوز يزيد التنفس المتقدرية، لكن لوحظ أي تغيير بين المجموعات من حيث القياس الكمي المطلقة أو من حيث تغير من خط الأساس (الشكل 3B). إضافة 1 مم فككب (عامل يفصل) لإظهار معدلات التنفس المتقدرية القصوى لا يزيد إلى حد كبير التعرف الضوئي على الحروف فوق مستوى النظر مع ارتفاع الجلوكوز في الأنسجة-/- WT أو Gnat1. ومع ذلك، إسقاط إشارات من كل الفئران جذريا بعد إضافة RAA كوكتيل.
ومن الناحية المثالية، تشغيل التجارب الجريان خارج الخلية حضور ATP synthase مثبط أوليجوميسين المساعدة في تحديد مصادر تسرب بروتون، التي تحدث عند الحركة من خلال سلسلة نقل الإلكترون لا يرتبط ب إنتاج ATP16. في explants الشبكية من الفئران C57BL/6J عمره الأسبوع 8، يخفض العلاج أوليجوميسين قوة التعرف الضوئي على الحروف، كالمتوقع (الشكل 4). ولكن إضافة اللاحقة من فككب، تجد القصوى التعرف الضوئي على الحروف، يزيد إلا اسمياً التعرف الضوئي على الحروف لحوالي 60 في المائة من خط الأساس، تمشيا مع دراسة سابقة11.
يستخدم محلل XF24 غاطسة المسابير التي تجعل ختم ضيق داخل البئر الأنسجة وخلق المكروية عابر لقياس الأوكسجين وحامض التمويه. المواقع الشبكية من النسيج في لوحة جيدا (بالنسبة لأجهزة الاستشعار) يمكن أن يحتمل أن تؤثر على تسجيلات التعرف الضوئي على الحروف، ويؤدي إلى الإرباك غير المرغوب فيها، ونادت بعض ريسيراتشيرس وضع نسيج الشبكية مباشرة أسفل مع استشعار الأوكسجين مستقبله الأجزاء الخارجية الموجهة نحو استشعار11. لاختبار آثار موقف نسيج الشبكية في القياسات التعرف الضوئي على الحروف، تم تحليل الأنسجة من الشباب C57BL/6J الفئران (8 أسابيع) في التوجهات هما: خلايا الشبكية العقدة أسفل على اللوحة (أي، فوتوريسيبتورس وضع تستقيم الأقرب إلى أجهزة الاستشعار ) أو مواجهة نحو أجهزة الاستشعار. ولوحظت أية اختلافات في النسبية التعرف الضوئي على الحروف في الرد على فككب أو RAA، مشيراً إلى حساسية مماثلة لمعدلات التنفس المتقدرية القصوى والدنيا في أي اتجاه (الشكل 5A). وباﻹضافة إلى ذلك، كانت أيضا المطلقة التعرف الضوئي على الحروف القياسات يعادل بين أنسجة الشبكية في أي اتجاه (الشكل 5B).
الشكل 1 : عزل explant الشبكية والإعداد إلى محلل الجريان خارج الخلية. أ العزلة للشبكية العصبية في الموقع بتطبيق قوة دفعي في أنحاء العالم مع الملقط وإينسيسينج القرنية وإزالة الشبكية بعد التخلص من العدسة والأغشية الوثيرة الأمامي. ب- إعداد الأنسجة للتمويه تسجيل مع إنشاء لكمه الشبكية، والتنسيب للكمات الفردية إلى جزيرة ليلى التقاط الميكروسكوبية، واستخدام لإدراج مش لتقليل حركة الأنسجة مع ميكروتشامبيرس (مقياس أشرطة = 1 مم). جيم تخطيطي، المستمدة من البيانات المتوفرة من قبل الشركة المصنعة، وعرض المخطط التفصيلي الإجراء ويدل على أن الارتفاع ميكروتشامبير كافية لاستيعاب الشبكية مورين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تحليل الإجهاد mitochondrial استخدام شبكية العين اكسبلانتيد من 8 أسبوع الحيوانات. ألف بلغ وسم مع الخطأ المعياري للقياس (SEM)، طبعت على محتوى الحمض النووي من الأنسجة، من تجربة محسنة لتسجيلات استهلاك الأكسجين، مقارنة بالضربة القاضية ترانسدوسين الحيوانات (Gnat1-/-) يتحكم نوع البرية. ب نفس التجربة مع البيانات التي حولت أن يتم تعيين تسجيلات الأساس كالمرجع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تحليل لاستخدام معدل جليكوليتيك اكسبلانتيد الشبكية من الحيوانات 8-الأسبوع القديمة. ألف أفيراجيد، الحمض النووي المحتوى-تطبيع، وسم من تجربة محسنة لتسجيلات efflux حمض مقارنة ترانسدوسين خروج المغلوب (Gnat1--/--) للحيوانات البرية نوع عناصر التحكم. ب البيانات من نفس التجربة تم تسويتها لتسجيلات خط الأساس. وتظهر آثار يعني ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : لا رجعة فيها آثار أوليجوميسين على معدلات التنفس الشبكية. في شدة استعداد explants الشبكية من الفئران C57BL/6J عمره الأسبوع 8، يقلل العلاج أوليجوميسين OCR القصوى الناجمة عن إضافة اللاحقة من فككب. وتظهر آثار يعني ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : آثار الأنسجة لتحديد المواقع في قياس OCR. ووضعت أنسجة الشبكية من الفئران C57BL/6J الأسبوع عمره 8 في الآبار مع خلايا العقدة التي تواجه نحو أجهزة الاستشعار (العقدة خلايا التسجيل) أو بعيداً عن أجهزة الاستشعار (العقدة الخلايا لأسفل). بين الجماعات، والجريان خارج الخلية مشابهة لوحظت التسجيلات من حيث قدرة الجهاز التنفسي (أ) بالنسبة لخط الأساس أو (ب) من حيث القياس الكمي المطلق. وتظهر آثار يعني ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التعرف الضوئي على الحروف وعكر تقاس بسهولة في نسيج الشبكية اكسبلانتيد باستخدام بيواناليزير استخدام الأساليب الموصوفة. ينطلق هذا الأسلوب من الفئات الأخرى في العديد من الخطوات الحاسمة. الأنسجة الشبكية المعزولة من خلال شق القرنية كبير دون انوكليتينج الكرة الأرضية، وصف أصلاً وينكلر15. يسمح هذا الأسلوب لعزل الشبكية للانتقال سريع من العين الحية في لوحة التقاط الأنسجة (عادة في غضون 5 دقائق). وتحفظ الأنسجة في 37 درجة مئوية طوال هذه العملية، التي تحافظ على التنفس الخلوي أفضل من عندما يتم وضعها على الثلج. تستخدم وسائل الإعلام مع المواد المضافة إلى الحد الأدنى للقياسات الأولية، إهمال أي وكلاء التخزين المؤقت مثل حبيس أو بيكربونات الصوديوم أو المصل أو المغذيات الكبيرة الزائدة، كهذا يسمح لقياسات أكثر موثوقية الطاقة القاعدية الأيض ولا يعوق تقييم عكر. وتسجل أفضل اللكمات الشبكية في شكل 24-جيدا بدلاً من 96-الآبار، إلى أدنى حد من الصدمة للأنسجة. توضع في وسط البئر، داخل ميكروتشامبير النسيج، نسيج الشبكية والمضمون مع إدراج شبكة. ذلك يسمح بتسجيل دقيق عكر والتعرف الضوئي على الحروف، بينما منع الحركة المفرطة الأنسجة أثناء التشغيل، ويلغي الحاجة إلى الكواشف الأخرى مثل المواد اللاصقة الأنسجة. ينصح حقن مركبات أثناء التشغيل، خاصة عند إعداد تسجيل التجارب للمرة الأولى، كما سيوفر ذلك شعور جيدا كيف يتم تأمين الأنسجة داخل لوحة التقاط. تسجيلات التعرف الضوئي على الحروف باستخدام هذه التقنية مستقلة عن اتجاه الشبكية داخل البئر، ولكن الاتجاه يجب أن تظل متسقة بين العينات داخل التجارب. يتم اتخاذ كافة القياسات إلا بعد الأيض الشبكية وصلت إلى حالة مستقرة عقب حقن المركبات الاختبار.
ويصف هذا البروتوكول تطبيع البيانات إلى إجمالي محتوى الحمض النووي، كوكيل لعدد الخلايا. مثل هذا أسلوب مفيد نظراً لأنه سيتم حساب التغييرات إلى عدد الخلايا مدفوعا بالاختلاف في سمك الشبكية، وحجم لكمه، أو الاختلافات في سيلولاريتي بين عينات متباينة وراثيا. مجموع التطبيع القائم على البروتين هو أيضا طريقة موثوق بها، وفي الاستفادة من تقليل الاختلافات في مجموع كتلة المتقدرية بين العينات الشبكية. ومع ذلك، قد مرتبك تطبيع استناداً إلى محتوى البروتين في الأنسجة كاملة بالتغييرات في المصفوفة خارج الخلية بين العينات. تطبيع تسجيلات التمويه لخط الأساس، كما هو مبين في النتائج الممثل، ومفيد لأنه يقلل من التفاوت في حجم لكمه الشبكية بين replicates ويسمح بسهولة تفسير التغييرات بسبب تدخلات دوائية. ومع ذلك، الإبلاغ عن قيم الخام يسمح لتحسين المقارنة بين مختلف التجارب والتجارب التي يؤديها باستخدام أساليب تسجيل تدفق مختلفة.
نتائج استخدام هذه التقنيات مماثلة لتلك التي أبلغ عنها في أماكن أخرى. على الرغم من أوليجوميسين-ATP synthase المانع-يستخدم عادة لقياس تسرب بروتون داخل أنسجة أو خلايا من الفائدة، هذا المركب آثار غير مرغوب فيه على الأيض الشبكية. في التجارب التي ذكرت هنا، انخفاض نسبة 60% في الشبكية القصوى هو لاحظ التعرف الضوئي على الحروف التي فككب تلقاها بعد التعرض إلى أوليجوميسين (الشكل 4)، متطابقة تقريبا دراسة سابقة11. على تفسير محتمل لهذا الاستنتاج هو ضرر لا يمكن إصلاحه أو التعديل إلى الميتوكوندريا الشبكية بتثبيط ATP synthase. وعلاوة على ذلك، كما ذكرت كوراجايالا والزملاء أولاً11، الشبكية الميتوكوندريا من المرجح تعمل بالقرب من المعدلات القصوى في ظروف القاعدية منذ عامل يفصل سلسلة نقل الإلكترون، فككب، يؤدي فقط إلى زيادة التعرف الضوئي على الحروف قبل حوالي 15% (رقم 3 ، الرقم 5).
تسجيلات الجريان خارج الخلية في أنسجة الشبكية اكسبلانتيد تثبت قدرة glycolytic احتياطي كبير، نظراً لإضافة الجلوكوز 20 مم يتسبب بزيادة شقين في عكر (الشكل 2). بسبب أوليجوميسين، عادة ما تستخدم لقياس قدرة glycolytic القصوى، من آثار ضارة في نسيج الشبكية (الشكل 4)، تصلح استخدام الجلوكوز عالية بالإضافة إلى التسجيل الوكيل أفضل لقياس جليكوليتيك الاحتياطي في الشبكية. تحذير هام منع استخدام عكر كوكيل نقية لمعدل جليكوليتيك أن أول أكسيد الكربون2 المحررة بدوره حمض الستريك يمكن أن يكون مصدرا هاما للحمض في الأنسجة المستزرعة17. بيروفات الزائدة لا يزيد عكر فوق المستويات التي أثارت بارتفاع الجلوكوز، وهو تقريبا القضاء التمويه glycolytic في explants الشبكية باستخدام نسب المولى الزائدة 2-المديرية العامة (الشكل 2). حيث يتم استخدام ATP لتجديد غشاء المحتملة التي تحدث من الأحداث ديبولاريزيشن في شبكية العين داركادابتيد، من الحيوانات التي تفتقر إلى ترانسدوسين المتوقع أن تنفق من الطاقة أكثر من نظرائهم WT. ومع ذلك، explants، الاختلافات بين Gnat1-/- ويتحكم في استقلاب الطاقة الشبكية لا شوهدت في التجارب الموضحة هنا (الشكل 2 و 3). هذه النتائج تتوافق مع تلك التي تم الحصول عليها باستخدام جهاز التروية مخصص لقياس التعرف الضوئي على الحروف في Gnat1-/- الحيوانات18. جدير بالذكر أن جهاز مخصص يستخدم دو والزملاء المسموح بها لقياس للتعرف الضوئي على الحروف ظروف تكييف تتكيف مع الضوء والظلام. بالقيام بذلك، يتم الكشف عن انخفاض صغيرة ولكنها مهمة في التعرف الضوئي على الحروف بعد التعرض للضوء في شبكية العين البرية من نوع، ولكن ليس في Gnat1-/- شبكية العين18. ويوضح هذا قيداً رئيسيا من الأسلوب الحالي في قياس عكر والتعرف الضوئي على الحروف في شبكية العين اكسبلانتيد--محلل الجريان خارج الخلية المستخدمة هنا يعتمد على الإثارة الضوء المرئي من فلوروفوريس جزءا لا يتجزأ من أن أجهزة الاستشعار الأوكسجين ودرجة الحموضة، القضاء على إمكانية إجراء قياسات في الأنسجة داركادابتيد. هذه القياسات هامة للغاية لفسيولوجيا البصرية، ويزال يتطلب استخدام تقنيات قديمة مصممة خصيصا لدراسة الأيض الشبكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر الدكتور ألكسندر كولسنيكوف والدكتور فلاديمير كيفالوف لتقديم Gnat1-/-الفئران، لتغذية مرتدة مفيدة، والمشورة، وقراءة المخطوطة.
وأيد هذا العمل قبل EY025269 المعاهد الوطنية للصحة (RR)، مركز أبحاث السكري في جامعة واشنطن-DK020579 المعاهد الوطنية للصحة (جرم و RR)، "جائزة تطوير المهنة" من البحوث لمنع العمى (RR)، ومؤسسة هورنكريست (RR)، و "جائزة تطوير المهنة" من JDRF ( جرم)، المعاهد الوطنية للصحة DK101392 (لجنة الأمن الغذائي العالمي)، DK020579 (لجنة الأمن الغذائي العالمي)، DK056341 (لجنة الأمن الغذائي العالمي) و DK114233 (جرم).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps - Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals |
References
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
- Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Wubben, T. J., et al. Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration. Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).
- Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers. Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).
- Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging. Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).
- Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
- Winkler, B. S. Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function. The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).
- Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Pearsall, E. A., et al. PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival. BMC biology. 15 (1), 113 (2017).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of visualized experiments. (46), (2010).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Winkler, B. S. The electroretinogram of the isolated rat retina. Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).
- Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Du, J., et al. Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina. The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).
