Summary
Esta técnica descreve a gravação em tempo real do consumo de oxigênio e taxas de acidificação do extracelular nos tecidos da retina explantados rato, usando um analisador de fluxo extracelular.
Abstract
Visão de alta acuidade é um processo altamente consumidores de energia, e a retina desenvolveu várias adaptações exclusivas para atender precisamente tais demandas, mantendo a transparência do eixo visual. Perturbações para este delicado equilíbrio causam doenças cegantes, como retinopatia diabética. Portanto, a compreensão das mudanças do metabolismo de energia na retina durante a doença é fundamental para o desenvolvimento de terapias racionais para várias causas de perda de visão. O recente advento dos analisadores de fluxo extracelular comercialmente disponíveis tornou mais acessível o estudo do metabolismo energético da retina. Este protocolo descreve o uso de um analisador de medir as contribuições para o fornecimento de energia da retina através de seus braços dois princípio - fosforilação oxidativa e glicólise - através da quantificação de alterações em taxas de consumo de oxigênio (OCR) e extracelular taxas de acidificação (ECAR) como proxies para essas vias. Esta técnica é executada prontamente no tecido da retina explantado, facilitando a avaliação das respostas a vários agentes farmacológicos em uma única experiência. Assinaturas metabólicas em retinas de animais sem haste fotorreceptoras sinalização são comparadas aos controles do selvagem-tipo usando esse método. Uma limitação importante nesta técnica é a falta de capacidade de discernir entre a utilização de energia de luz-adaptado e vez, uma importante consideração fisiológica no tecido da retina.
Introduction
A retina é entre os tecidos mais exigentes de energia no sistema nervoso central1. Como a maioria dos tecidos, gera triphosphate de adenosina (ATP) via glicólise no citosol ou via fosforilação oxidativa em mitocôndrias. A vantagem energética da fosforilação oxidativa sobre glicólise para produzir ATP a partir de uma molécula de glicose é clara: 36 moléculas de ATP gerado a partir do antigo vs 2 moléculas de ATP gerado deste último. Por conseguinte, os neurônios da retina dependem principalmente de respiração mitocondrial para fornecimento de energia e isto é refletido por sua alta densidade de mitocôndrias2. Ainda, a retina também confia pesadamente na maquinaria glicolítico mesmo quando o oxigênio é abundante. Este processo de glicólise aeróbica foi originalmente descrito em células cancerosas por Otto Warburg3, que uma vez observou que a retina foi o tecido apenas pós mitótico capaz desta forma de metabolismo4. Desde essas observações iniciais, muitos tecidos pós mitóticos têm sido descritos para se envolver em vários graus de glicólise além de fosforilação oxidativa para atender suas demandas de ATP.
Fototransdução, pigmentos visuais, reciclagem, biossíntese de segmentos exteriores fotoreceptor e atividade sináptica são todos os processos exigentes de energia nos fotorreceptores, a subclasse neuronal predominante na retina. Mas a necessidade de transportar ativamente íons contra seus eléctricos e gradientes de concentração é de longe o processo que consumia muito mais energicamente em neurônios1. Fotorreceptores são neurônios peculiares no sentido de que eles são despolarizados na ausência de estimulação (ou seja, no escuro), Considerando que um estímulo de luz aciona o fechamento do canal e hiperpolarização subsequente. Portanto, no escuro, a retina consome grandes quantidades de ATP para manter sua despolarização ou "corrente escura", como é comumente chamado. Do ponto de vista adaptativa, um grande desafio no fornecimento destes grandes quantidades de ATP é a necessidade dos organismos manter a clareza visual através do eixo óptico. A arquitetura da retina invertida vista em modernas criaturas é a solução dominante, como mantém a densa rede capilar fornecendo fotorreceptores longe o caminho da luz. Mas esta maravilha de bioengenharia natural coloca a retina em um precipício em termos de reserva metabólica. Mesmo pequenos insultos à retina potencialmente podem perturbar o delicado equilíbrio da oferta e a procura de energia, e disfunção visual ou cegueira franca possam decorrer rapidamente.
Dada a demanda energética única da retina neural, juntamente com sua restrição apertada de suprimento vascular, medição precisa do consumo de ATP, a retina e suas mudanças durante a doença pode ter profundas implicações na compreensão e tratamento cegando condições tais como a retinite pigmentosa e retinopatia diabética. Tradicionalmente, estas medidas exigem equipamentos caros, personalizados com a maioria dos estudos emergentes de um punhado de laboratórios inteiramente dedicado às medições da atividade metabólica2,5,6, 7,8. As técnicas incluem ensaios individuais para metabolitos específicos, estudos de rastreamento usando precursores rotulado de rádio, gravação usando eletrodos de Clark e metabolómica9de criação de perfil de consumo de oxigênio.
Com os avanços na tecnologia de alta produtividade e aumento da disponibilidade de dispositivos comerciais, técnicas de registro metabolismo da retina são cada vez mais acessível e disponível. O método descrito aqui mede ambos fosforilação oxidativa e glicólise na retina usando explantados tecido e um analisador do fluxo extracelular comercialmente disponíveis9,10,11,12. Este analisador separadamente registra taxa de consumo de oxigênio (OCR) e a taxa de acidificação do extracelular (ECAR), servindo como indicadores indirectos de fosforilação oxidativa e glicólise, respectivamente13. Essas medições são feitas por uma sonda submergida dentro de um microchamber criado sobre o tecido de interesse. Esta adaptação dos métodos publicados anteriormente usa uma placa de captura, projetada originalmente para pâncreas ilhotas de Langerhans para gravar a atividade metabólica em seções pequenas, circulares da retina do rato. Várias exposições farmacológicas podem ser entregues para o tecido no decurso de uma única gravação, porque o sistema contém 4 portas de injeção para cada amostra bem. Usando este sistema com protocolos separados, otimizados para gravações ECAR e OCR, respostas do selvagem-tipo retina podem ser comparadas com as retinas falta transducina (Gnat1- / -), uma causa de cegueira congênita de noite estacionária em os seres humanos14.
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Protocol
Protocolos seguiram a associação para pesquisa em visão e oftalmologia declaração sobre a utilização dos animais e foram aprovados pela Universidade de Washington.
1. preparação animal
- Manter animais em habitação padrão com um 12 horas escuro para ciclo de luz de 12 horas. Begin experimentos no padronizado para evitar efeitos circadianos, geralmente pela manhã, logo que as luzes estão ativadas.
2. preparação da solução
- Preparar a mídia base dissolvendo 8,4 mg de mídia em pó em bidestilada H2O (ddH2O) e ajustar o pH para 7,4 com HCl ou NaOH, até um volume final de 1 L. Filter esterilizar esta solução com um filtro de cultura de tecidos de 0,22 µm.
- Adicione 1 M glicose e piruvato de sódio de 100 mM para os meios de comunicação para atingir concentrações finais de glicose de 5 mM e 1 mM piruvato.
- Lugar uma alíquota de 50 mL da mídia base em banho maria a 37 ° C.
- Preparar a solução de Lise, para quantificação de tecido no final da análise de fluxo, adicionando a base tris 10 mM, polietileno glicol éter de tert-octilfenil a 0,2% (v/v) e EDTA 1 mm, todos em ddH2Mix O. até que todos os componentes completamente dissolvido e ajustar pH para 8,0.
- Para o protocolo de estresse mitocondrial, prepare um estoque de 11 µM de oligomicina, um inibidor da ATP sintase, dissolvido em mídia de base para atingir uma concentração final de 1 µM no poço. Preparar um estoque de 11 µM de cianeto de carbonila - 4-(trifluorometoxi) phenylhydrazone (FCCP), um agente de desacoplamento, dissolvido em mídia de base para atingir uma concentração final de 1 µM no poço. Preparar um coquetel de inibidores da cadeia de transporte de elétrons, rotenona e antimycin A (RAA), adicionando a rotenona a 11 µM e antimycin A para 22 µM, dissolvido em mídia de base para atingir uma concentração final de 1 µM rotenona e 2 µM antimycin A no bem.
- Para o protocolo da glicólise, prepare um estoque de 220 mM de glicose dissolvido em base meios de comunicação, para atingir uma concentração final de 20 mM no poço. Também prepare um estoque de 1,1 M de 2-deoxyglucose (2-DG), um inibidor competitivo da glicose e antagonista glicolítico, dissolvendo-a em base meios de comunicação. Isso será alvo de uma concentração final de 100 mM 2-DG no poço.
3. calibragem
- Para calibrar a instrumentação para um ensaio de fluxo extracelular, adicionar 1 mL de solução de calibração para cada poço do refil do sensor (total de 24 poços) e incubar a 37 ° C em uma CO2-livre incubadora durante a noite (ou pelo menos 8 h).
- Carregar os aditivos para o protocolo de estresse mitocondrial ou o protocolo de glicólise em cada porta-injector, À D, no cartucho de sensor, ajuste para variações de volume no poço.
Nota: Por exemplo, um ensaio típico incluiria 45 µ l de aditivo para a primeira porta-injector, 49,5 µ l para o segundo, 54,5 µ l para o terceiro e 60 µ l para o último, assumindo um volume bem inicial de 450 µ l. - Durante as primeiras experiências diversas, carrega mídia base no Porto A medir quanto movimento/artefato de tecido ocorre depois de uma injecção.
- Deixe a placa de sensor carregado incubar a 37 ° C numa incubadora de CO não2 pelo menos 60 min.
4. isolamento do tecido Retinal Mouse fresco
Nota: Esta etapa é adaptada à técnica da Dr. Barry Winkler15.
- Após administrar anestesia profunda, usando um padrão cocktail de xilazina/cetamina, eutanásia em ratos por deslocamento cervical.
- Use um par de pinças curvas médias para agarrar o globo posterior no nervo óptico e aplicar suavemente a pressão para a frente de proptose do olho (figura 1A).
- Com uma lâmina de barbear limpa, crie uma incisão do limbo ao limbo entre a córnea usando um passe único, preciso da lâmina.
- Usando bem, fórceps de estilo McPherson angulado, beliscar o globo posterior para expressar a lente e membranas hialoide anteriores fora da incisão da córnea. Descarte desses tecidos.
- Repita a manobra beliscar com fórceps para expressar a retina neural.
- Para levantar a retina, ao invés de agarrar o tecido, usando a pinça como uma colher, transfira a retina longe da incisão da córnea e diretamente em uma mídia quente em um prato de 3cm ou uma placa de aglomerado de cultura de tecidos de 6-poços.
- Use dois pares de pinças de McPherson-estilo fina, angulares para dissecar cuidadosamente restante vítreo da retina. Este é o melhor feito segurando o vítreo na periferia da Copa da retina e puxando em direção ao centro, com um final desinserção do corpo vítreo do centro como um todo. Usando a pinça, remova qualquer residual epithelium retinal do pigment da superfície fotorreceptoras da retina.
- Corte a ponta da pipeta P1000 com uma lâmina de barbear para criar uma abertura de ~ 4 mm para evitar trauma indevida para o delicado tecido da retina durante manobras de transferência.
- Transferi o tecido da retina isolado em fresca mídia usando uma corte ponta da pipeta P1000.
- Corte socos de 1 mm da retina ao redor do nervo óptico com uma biópsia de 1mm soco equipado com um êmbolo para desalojar o tecido, no caso de ele fica alojado na perfuração (figura 1B). Defina os socos da retina lado na mídia limpa mantido em um bloco de 37 ° C ou almofada de aquecimento.
5. protocolo do ensaio
- Transferência individuais socos para microplacas de captura um ilhéu 24-bem usando uma corte ponta P1000, aspirando a 450 µ l de mídia juntamente com o tecido.
- Use bem, pinça reta para manipular suavemente socos no centro do microplate. Mantenha socos orientados na mesma direção (por exemplo, gânglio célula lado para cima).
- Descanse a placa de captura em uma almofada de aquecimento ou aquecimento bloco conjunto a 37 ° C, como essas etapas são repetidas para as restantes amostras.
Nota: Para cada experimento, Reserve 3-4 poços em branco com 450 µ l de mídia base para servir como controles negativos. Nos restantes 20-21 poços, teste cada biológico replicar em triplicado. Portanto, cada placa de 24 permitirá gravação de 6-7 diferentes animais ou condições de tratamento.
- Descanse a placa de captura em uma almofada de aquecimento ou aquecimento bloco conjunto a 37 ° C, como essas etapas são repetidas para as restantes amostras.
- Evitando as bolhas de ar, delicadamente posição o ilhéu capturar malha inserções em cada poço usando fórceps e fixe as inserções com uma haste de metal, ou com uma ponta da pipeta P1000 corte (Figura 1 C).
Nota: Evite o movimento excessivo tecido durante esta etapa para manter a posição da retina soco dentro do centro de microchamber a amostra. Bolhas de ar severamente distorcem leituras de OCR. Embora o microchamber tem profundidade suficiente para acomodar a retina típico do mouse (Figura 1), ocasionalmente, usinagem-defeitos nas inserções malha podem causar tecidos tornar-se excessivamente compactados durante a inserção de tela. Se isso acontecer, basta fazer uma nota do tecido esmagado e excluir essa amostra de análise final. - Incubar a placa de tecido em um de 37 ° C CO2-incubadora livre pelo menos 60 min.
- O analisador de fluxo extracelular usando Mix, espera, medida do programa e repita os comandos. Por exemplo, um experimento típico com tecido da retina pode incluir o seguinte: Misture 2 minutos, esperar 2 minutos e 5 minutos de medir. Repetir o experimento com estes três passos entre 5 - 8 vezes (ciclos) para uma gravação de base e após a injeção de cada composto sendo testado durante a execução.
- Pressione o botão de arranque do programa sobre o analisador de fluxo extracelular e siga as instruções na tela para inserir o cartucho de sensor para calibração.
- No final da calibração, siga as instruções na tela para substituir a placa de calibrant com a placa contendo as amostras da retina.
- Permitir que o programa seja executado, conforme programado. Após a conclusão da execução, siga as instruções na tela para ejetar a placa de tecido. Exibir os resultados da execução e armazenar o arquivo de dados.
- Com uma agulha de calibre 20 torta e fórceps, remova todas as inserções de malha dos poços, deixando o soco da retina.
- Cuidadosamente Aspire a mídia no tecido e lave o tecido duas vezes com 0,5 mL de frio fosfato salino (PBS). Aspire a PBS após a lavagem.
- Adicione 100 µ l de tampão de lise de cada poço e pipetar acima e para baixo para homogeneizar o tecido.
- Dose os níveis de entrada com base no total DNA de cadeia dupla (dsDNA) ou conteúdo de proteína total.
Nota: A seguir é baseada em um ensaio de dsDNA comercialmente disponível. - Diluir as amostras lisadas 1:1 adicionando-se 100 µ l de tampão Tris-EDTA (TE) e transferir 100 µ l da amostra diluída para um prato bem 96.
- Adicione 100 µ l de tampão de deteção para cada poço. Após a mistura para 2-5 minutos, dosar fluorescência após excitação a 480 nm e emissão em 520 nm, comparando com uma curva padrão.
- Normalize o rastreamento de fluxo extracelular cru para conteúdo de DNA dentro do poço.
Nota: Os resultados aqui apresentados, as amostras são normalizadas para 50 ng dsDNA - uma quantidade típica em um soco de 1 mm da retina. Portanto, valores absolutos apresentados aqui podem ser comparados aos estudos apresentando dados "por soco da retina". Normalize os traçados de um padrão interno, tais como a linha de base executar em uma concentração de glicose de 5 mM.
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Representative Results
Usando as técnicas descritas (resumidas na Figura 1), retinais explantes de 8 semanas de idade selvagem tipo (WT) de ratos foram comparados a idade - e fundo-combinada transducina nula ratos (Gnat1- / -). Porque Gnat1- / - animais não possuem a maquinaria para fechar nucleotídeo cíclico condomínio fechado de canais iônicos em resposta a estímulos de luz, os fotorreceptores haste permanecem despolarizadas mesmo na luz14. A subsequente precisa manter o efluxo de potássio criaria uma grande demanda de ATP, resultando em tensão bioenergético. Para determinar se essas mudanças nas demandas de energia iria aumentar a fosforilação oxidativa ou fluxo glicolítico, os tecidos de ratos tipo selvagem e Gnat1- / - ratos foram comparados usando o analisador de fluxo extracelular. Na linha de base, na presença de glicose de 5 mM e 1 mM piruvato, os tecidos da retina de animais selvagem-tipo têm taxas semelhantes de ácido efluxo em relação ao Gnat1- / - mutantes. Padrões similares são vistos após a adição de glicose de 20 mM e o inibidor glicolítico 2-DG (Figura 2A). Estes dados também podem ser matematicamente transformados para representar alterações fracionárias da linha de base (Figura 2B), um formato que permite melhor comparação entre diferentes intervenções experimentais.
OCR absoluto na linha de base é equivalente entre WT e tecido retinal mutante (Figura 3A). A adição de glicose de 20 mM aumenta a respiração mitocondrial, mas nenhuma mudança é observada entre os grupos em termos de quantificação absoluta ou, em termos de mudança da linha de base (Figura 3B). A adição de 1mM FCCP (um agente desacoplamento) para demonstrar a máximas taxas respiratórias mitocondriais não aumenta significativamente OCR acima do nível do visto com a glicose alta no WT ou Gnat1- / - tecidos. No entanto, os sinais de ambos os ratos cair drasticamente após a adição do RAA cocktail.
Idealmente, as experiências de fluxo extracelular executado na presença da ajuda de oligomicina ATP sintase inibidor na identificação de fontes de vazamento do próton, ocorrendo quando o movimento através da cadeia de transporte de elétrons não está associado com a produção de ATP16. Em explantes da retina de ratos de C57BL/6J 8 semanas de idade, oligomicina tratamento reduz robustamente OCR, como esperado (Figura 4). Mas subsequente adição de FCCP, para encontrar a máxima OCR, só nominalmente aumenta o OCR para cerca de 60% da linha de base, consistente com um estudo prévio de11.
O analisador de XF24 usa submersíveis sondas que fazem um selo apertado dentro do poço do tecido, criando um microambiente transitória para medição de oxigênio e o fluxo ácido. Posicionamento do tecido retinal no prato bem (em relação os sensores) poderia potencialmente influenciar gravações de OCR e levar a confundidores indesejados, e alguns pesquisadores têm defendido a colocação de tecido retinal diretamente debaixo do sensor de oxigênio com a segmentos de exterior fotorreceptoras orientados para o sensor de11. Para testar os efeitos da posição do tecido da retina em medições de OCR, os tecidos de jovens camundongos C57BL/6J (8 semanas de idade) foram analisados em duas orientações: células ganglionares da retina virado para baixo sobre o prato (ou seja, fotorreceptores colocados em pé mais próximo ao sensor ) ou virada para cima na direção do sensor. Não em OCR relativo em resposta a Compararia ou RAA foram observadas diferenças, indicando sensibilidade equivalente para máximas e mínimas taxas respiratórias mitocondriais em qualquer orientação (Figura 5A). Além disso, medições absolutas de OCR também foram equivalentes entre os tecidos da retina em qualquer orientação (Figura 5B).
Figura 1 : Isolamento de explante da retina e configuração para o analisador de fluxo extracelular. R. isolamento da retina neural em situ aplicando força propulsiva na globo com fórceps, incisão da córnea, e remoção de retina após descartar a lente e membranas hialoide anteriores. B. preparação do tecido para o fluxo de gravação com a criação da retina soco, colocação de individuais socos em microplacas de captura do Ilhéu e utilização de uma inserção de malha para minimizar o movimento do tecido com microchambers (barras de escala = 1 mm). C. um diagrama esquemático, derivado de dados fornecidos pelo fabricante, mostrando o contorno do procedimento e demonstrando que a altura do microchamber é adequada para acomodar a retina murino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Análise de stress mitocondrial usando explantado retina de 8 semanas de animais. R. em média traçados com erro padrão de medida (SEM), normalizados para o conteúdo de DNA do tecido, de uma experiência otimizada para gravações de consumo de oxigênio, comparando animais nocaute transducina (Gnat1- / -) para controles do tipo selvagem. B. mesmo experimento com dados transformados tais que as gravações de base são definidas como referência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Análise do uso de taxa glicolítico explantados retina de animais de 8 - semanas de idade. R. média, DNA conteúdo normalizado, traçados de um experimento otimizado para gravações de efluxo ácido comparando transducina nocaute animais (Gnat1- / -) aos controles do tipo selvagem. B. dados da mesma experimentam normalizado para as gravações de base. Vestígios mostram média ± SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Efeitos irreversíveis de oligomicina na retina taxas respiratórias. Em agudamente preparados explantes da retina de ratos de C57BL/6J 8 semanas de idade, oligomicina tratamento reduz o OCR máximo induzido pela adição subsequente de FCCP. Vestígios mostram média ± SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Efeitos de tecido posicionamento na medição OCR. Os tecidos da retina de ratos de C57BL/6J 8 semanas de idade foram colocados em poços com células ganglionares enfrentando o sensor (células ganglionares Up) ou para longe do sensor (células ganglionares abaixo). Entre grupos, semelhante fluxo extracelular gravações são observadas em termos de (A) capacidade respiratória em relação à linha de base ou (B) em termos de quantificação absoluta. Vestígios mostram média ± SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
OCR e ECAR prontamente são medidos em explantados tecido retinal usando um bioanalyzer usando as técnicas descritas. Este método parte das de outros grupos em várias etapas críticas. Tecidos da retina são isolados por meio de uma grande incisão da córnea sem enucleating do globo, como foi originalmente descrito por Winkler15. Este método de isolamento da retina permite uma rápida transferência do olho vivo para a placa de captura de tecido (muitas vezes dentro de 5 minutos). Os tecidos são mantidos a 37 ° C durante todo o processo, que conserva a respiração celular melhor do que quando eles são colocados em gelo. Mídia com mínimos aditivos é utilizadas para medições iniciais, omitindo quaisquer agentes tamponadores como HEPES ou bicarbonato de sódio, soro ou macronutrientes em excesso, pois isso permite medições mais confiáveis do metabolismo basal de energia e não inibe a avaliação de ECAR. Socos na retina melhor são gravados em um formato 24-bem, em vez de 96 poços, para minimizar o trauma no tecido. Tecido da retina é colocado no centro do poço, dentro do tecido microchamber e garantiu com uma inserção de malha. Fazendo assim permite gravação exata de ECAR e OCR, evitando movimento excessivo tecido durante a execução e elimina a necessidade de outros reagentes tais como adesivos de tecido. Uma injeção de veículo durante a corrida é recomendada, especialmente quando a criação de experiências de gravação pela primeira vez, como isso irá fornecer um sentido do bem como o tecido é fixado dentro da placa de captura. Gravações de OCR usando esta técnica são independentes da orientação da retina dentro do poço, mas a orientação deve ser mantida consistente entre amostras dentro de experiências. Todas as medições são tomadas somente após metabolismo da retina tiver atingido o estado estacionário após injeção de compostos de teste.
Este protocolo descreve a normalização de dados ao conteúdo total de DNA, como um proxy para o número do celular. Tal técnica é vantajosa porque que serão responsáveis por mudanças de número de celular, impulsionado pela variação na espessura da retina, tamanho de perfurador ou diferenças na celularidade entre amostras geneticamente dissimilares. Normalização total à base de proteínas também é um método confiável e tem a vantagem de minimizar as diferenças na massa mitocondrial total entre amostras da retina. No entanto, normalização com base no teor de proteína no tecido inteiro pode ser confundida por alterações na matriz extracelular entre amostras. Normalização de gravações de fluxo da linha de base, conforme os resultados representativos, é vantajosa porque minimiza a variabilidade no tamanho da retina soco entre repetições e facilmente permite a interpretação de mudanças devido a intervenções farmacológicas. No entanto, relatórios de valores brutos permite para uma melhor comparação entre diferentes experiências e para experimentos realizados usando fluxo de diferentes métodos de gravação.
Resultados usando estas técnicas são comparáveis aos relatados em outros lugares. Apesar de oligomicina - um inibidor da ATP sintase - normalmente é usada para medir a fuga de prótons dentro de tecidos ou células de interesse, este composto tem efeitos desfavoráveis sobre o metabolismo da retina. Nos experimentos aqui relatados, um 60% diminuição máxima da retina OCR eliciada Compararia é observada após exposição a oligomicina (Figura 4), quase idêntica a um anterior de estudo11. Uma potencial explicação para este achado é danos irreversíveis ou alteração da retina mitocôndrias pela inibição de ATP sintase. Além disso, como Kooragayala e colegas primeiro relataram11, retinal mitocôndrias são prováveis operando em perto de taxas máximas em condições basais, desde um agente desacoplamento de cadeia de transporte de elétrons, FCCP, apenas aumenta o OCR por cerca de 15% (Figura 3 , Figura 5).
Gravações de fluxo extracelular nos tecidos da retina explantados demonstram uma grande reserva capacidade glicolítico, desde a adição de glicose de 20 mM provoca um aumento de duas vezes em ECAR (Figura 2). Porque oligomicina, normalmente usada para medir a capacidade máxima de glicolítico, tem efeitos deletérios no tecido da retina (Figura 4), o uso da adição de glicose elevada para a gravação pode servir como melhor proxy para medir glicolítico reserva na retina. Uma ressalva importante evitar o uso do ECAR como um proxy puro para taxa glicolítico é esse CO2 liberado pelo ciclo do ácido cítrico pode ser uma fonte significativa de ácido em tecido culta17. Piruvato em excesso não aumenta ECAR acima dos níveis provocados pela alta glicose e fluxo glicolítico é quase eliminado em explantes da retina usando excesso molares rácios de 2-DG (Figura 2). Desde que o ATP é usado para regenerar a membrana potencial de ocorrência de eventos de despolarização na retina vez, animais faltando transducina deverão gastar mais energia do que contrapartes WT. No entanto, em explantes, diferenças no metabolismo energético da retina Gnat1- / - e controles não foram observadas nos experimentos descritos aqui (Figura 2 e 3). Estes resultados são consistentes com os obtidos usando um aparelho de perfusão personalizado para medir OCR em Gnat1- / - animais18. Notavelmente, o aparelho personalizado usado por Du e colegas permitido para medição de OCR em condições adaptadas adaptado de luz e escuras. Ao fazer isso, uma pequena, mas significativa diminuição OCR após exposição à luz é detectada em retinas de tipo selvagem, mas não em Gnat1- / - retina18. Isso ilustra uma grande limitação da técnica atual na medição ECAR e OCR em retinas explantadas - o analisador de fluxo extracelular usado aqui baseia-se na excitação de luz visível de fluorophores incorporado em seus sensores de oxigênio e pH, eliminando a possibilidade de efectuar medições em tecidos de vez. Tais medidas são altamente relevantes para a fisiologia visual e ainda exigirá o uso de técnicas mais antigas projetado exclusivamente para o estudo do metabolismo da retina.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos o Dr. Alexander Kolesnikov e Dr. Vladimir Kefalov para fornecer Gnat1- / -ratos, para comentários úteis e conselhos e para ler o manuscrito.
Este trabalho foi financiado pelo NIH EY025269 (RR), o Diabetes Research Center na Universidade de Washington - NIH DK020579 (JRM e RR), um prêmio de desenvolvimento de carreira de investigação para evitar cegueira (RR), a Fundação Horncrest (RR), um prêmio de desenvolvimento de carreira de (JDRF JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) e DK114233 (JRM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps - Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals |
References
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