Summary
Denne teknikken beskriver sanntid opptak av oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring priser i explanted musen netthinnens vev bruker en ekstracellulære flux analyserer.
Abstract
Høy skarphet visjon er en tungt energikrevende prosess netthinnen har utviklet flere unike tilpasninger for å møte nettopp slike krav samtidig gjennomsiktighet på den visuelle aksen. Forstyrrelser til denne delikate balanse føre blendende sykdommer, som diabetisk retinopati. Forståelsen av energi metabolism endringer i netthinnen under sykdom er derfor viktig å utvikling av rasjonell terapi for ulike årsaker til Vision tap. Det nylige advent kommersielt tilgjengelig ekstracellulære flux analyserer har gjort studiet av netthinnen energi metabolism mer tilgjengelig. Denne protokollen beskriver bruken av slike en analyserer å måle bidrag til netthinnen energiforsyning gjennom sine to prinsippet armer - oxidative fosforylering og Glykolysen - ved å kvantifisere endringer i oksygen forbruk priser (OCR) og ekstracellulære forsuring priser (ECAR) som proxyer for disse veiene. Denne teknikken er lett utført i explanted netthinnen vev, tilrettelegge vurdering av Svar å flere farmakologisk agenter i ett enkelt eksperiment. Metabolsk signaturer i Netthinne fra dyr mangler rod photoreceptor signalering er sammenlignet med vill-type kontroller bruker denne metoden. En stor begrensning i denne teknikken er mangel på evne til å skille mellom lys-tilpasset og dark-adapted energi utnyttelse, en viktig fysiologiske faktor i netthinnen vev.
Introduction
Netthinnen er blant de mest energikrevende vev i sentralnervesystemet1. Som de fleste vev genererer den adenosin trifosfat (ATP) via Glykolysen i stoffer eller via oxidative fosforylering i mitokondrier. Energisk fordelen av oxidative fosforylering over Glykolysen å produsere ATP fra ett molekyl av glukose er klart: 36 molekyler av ATP generert fra den tidligere vs 2 molekyler av ATP generert fra sistnevnte. Følgelig retinal neurons avhengig primært av mitokondrie åndedrett for energiforsyning og dette gjenspeiles ved deres høy tetthet av mitokondrier2. Likevel, netthinnen også avhengig av tungt glycolytic maskiner selv når oksygen er rikelig. Denne prosessen med aerobic Glykolysen ble opprinnelig beskrevet i kreftceller av Otto Warburg3, som en gang bemerket at netthinnen var bare etter mitotisk vevet kan denne formen for metabolisme4. Siden de første observasjonene, er mange etter mitotisk vev beskrevet å engasjere seg i varierende grad av Glykolysen i tillegg oxidative fosforylering å møte sine ATP krav.
Phototransduction, visual pigment gjenvinning, biosyntesen photoreceptor ytre segmenter og synaptic aktivitet er alle energi krevende prosesser i fotoreseptorer, dominerende neuronal underklassen i netthinnen. Men behovet for å transportere aktivt ioner mot deres elektriske og konsentrasjon graderinger er desidert mest energisk tidkrevende prosessen i neurons1. Fotoreseptorer er særegne nerveceller i den forstand at de er depolarized i fravær av stimulering (dvs. i mørket), mens en lys stimulans utløser kanal nedleggelse og påfølgende hyperpolarization. Derfor, i mørket, netthinnen forbruker store mengder ATP å opprettholde sin depolarization eller "mørke gjeldende" som det kalles. Fra en adaptiv ståsted er en stor utfordring i å levere disse enorme mengder ATP behovet for organismer å opprettholde visuell klarhet gjennom den optiske aksen. Invertert retinal arkitektur i moderne skapninger er den dominerende løsningen, som den holder tett capillary nettverket leverer fotoreseptorer fra stien av lys. Men dette vidunder av naturlige bioteknologi steder netthinnen på et stup i metabolske reserve. Selv små fornærmelser netthinnen kan potensielt forstyrre den fine balansen i energiforsyning behov, og visuelle dysfunksjon eller frank blindhet kan følge raskt.
Gitt de unike energisk kravene av neural netthinnen, kombinert med sin stramme begrensning av vascular forsyning, kunne nøyaktig måling av ATP forbruk i netthinnen og dens endringer under sykdom ha dyptgripende implikasjoner i forståelse og behandling blendende retinitis pigmentosa og diabetisk retinopati. Tradisjonelt har krever disse målingene kostbar, spesialdesignet utstyr med de fleste studier fremvoksende fra en håndfull laboratorier helt dedikert til målinger metabolsk aktivitet2,5,6, 7,8. Teknikker inkluderer individuelle analyser for bestemte metabolitter, tracer studier med radio-merket forløpere, oksygenforbruk opptak med Clark elektroder og metabolomic profilering9.
Med fremskritt innen høy gjennomstrømming teknologi og økt tilgjengelighet av kommersielle enheter er teknikker for å registrere retinal metabolisme stadig mer tilgjengelig og rimelig. Metoden beskrevet her måler både oxidative fosforylering og Glykolysen netthinnen ved explanted vev og en kommersielt tilgjengelig ekstracellulære flux analyzer9,10,11,12. Denne analyzer registreres separat oksygen forbruksraten (OCR) og den ekstracellulære forsuring rate (ECAR), som indirekte indikatorer på oxidative fosforylering og Glykolysen, henholdsvis13. Disse målingene er gjort av en sonde senket i en microchamber opprettet over vevet rundt. Denne tilpasningen av tidligere publiserte metoder bruker en fange plate opprinnelig utviklet for bukspyttkjertelen holmer Langerhans registrere metabolsk aktivitet i liten, rundskriv deler av musen netthinnen. Flere farmakologisk eksponeringer kan leveres til vev i løpet av en enkelt opptak fordi systemet inneholder 4 injeksjon porter for hver prøve også. Bruke dette systemet med separat protokoller optimalisert for ECAR og OCR, svarene på vill-type Netthinne kan sammenlignes Netthinne mangler transducin (Gnat1- / -), en årsak til medfødt stasjonære nattblindhet i mennesker14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokoller fulgte foreningen for i visjon og Oftalmologi erklæringen for bruk av dyrene og ble godkjent av Washington University.
1. dyr forberedelse
- Holde dyr i standard bolig med en 12 timer mørke til 12 timer lys syklus. Start eksperimenter på standardisert å unngå circadian effekter, vanligvis om morgenen etter lysene er slått.
2. løsning forberedelse
- Klargjør base media ved oppløsning 8.4 mg pulverisert medier i dobbel-destillert H2O (ddH2O) og justere pH 7,4 HCl eller NaOH, til et siste volum 1 L. Filter sterilisere denne løsningen med filtere 0.22 µm vev kultur.
- Tilsett 1 M glukose og 100 mM natrium pyruvate til media for å oppnå siste konsentrasjoner av 5 mM glukose og 1 mM pyruvate.
- Plasser en 50 mL aliquot av base media i et 37 ° C vannbad.
- Forberede lysis løsning, vev kvantifisering på slutten av flux analysen, ved å legge til tris base 10 mM, polyetylenglykol tert-octylphenyl Eter 0,2% (v/v), og EDTA 1 mm, alle i ddH2O. bland til alle komponenter helt oppløst og justere pH til 8.0.
- For mitokondrie stress-protokollen, kan du forberede en 11 µM lager av oligomycin, en ATP syntase inhibitor, oppløst i base media å målrette en siste konsentrasjon på 1 µM i brønnen. Forberede en 11 µM lager av karbonyl cyanid - 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), en uncoupling agent, oppløst i base media å målrette en siste konsentrasjon på 1 µM i brønnen. Forberede en cocktail av elektronet transport kjeden hemmere, rotenon og antimycin A (RAA) ved å legge rotenon 11 µM og antimycin A til 22 µM, oppløst i base media å målrette en siste konsentrasjon av 1 µM rotenon og 2 µM antimycin A i den godt.
- For Glykolysen protokollen, forberede en 220 mM lager av glukose oppløst i base medier, målrette en siste konsentrasjon av 20 mM i brønnen. Også forberede en 1,1 lager av 2-deoxyglucose (2-DG), en konkurransedyktig hemmer glukose og glycolytic antagonist, smelte det i base media. Dette vil målrette en siste konsentrasjon av 100 mM 2-DG i brønnen.
3. instrument kalibrering
- For å kalibrere instrumentelle for ekstracellulære flux analysen, tilsett 1 mL av kalibrering løsning hver brønn av sensoren kassetten (24 brønner totalt) og Inkuber på 37 ° C i en CO2-gratis inkubator overnatting (eller minst 8 h).
- Legge tilsetningsstoffer for mitokondrie stress protokollen eller Glykolysen protokollen i hver injektor port, A til D, på sensoren kassett, justere volumet endringer i brønnen.
Merk: Som et eksempel omfatter en typisk analysen 45 µL av en additiv til første injektor porten, 49,5 µL i den andre, 54,5 µL i den tredje og 60 µL i sist, antar en første godt volum på 450 µL. - Under de første flere forsøkene, laste base media i port A å måle hvor mye vev bevegelse/gjenstanden oppstår etter en port injeksjon.
- Tillate lastet bildesensoren plate å ruge på 37 ° C i en ikke-CO2 inkubator for minst 60 min.
4. isolering av fersk musen netthinnen vev
Merk: Dette trinnet er tilpasset fra teknikken av Dr. Barry Winkler15.
- Etter administrasjon av dyp anestesi bruker euthanize en standard ketamin/xylazine cocktail mus av cervical forvridning.
- Bruk et par mellomstore buet tang til å forstå bakre kloden til den optiske nerven og forsiktig gjelder forover proptose øyet (figur 1A).
- Med en ren barberblad, opprette en limbus til limbus snitt over hornhinnen ved hjelp av en enkel, bevisst pass av bladet.
- Bruker fint, knip vinklet McPherson stil tang, bakre verden å uttrykke linsen og fremre hyaloid membraner av hornhinnen innsnitt. Kast disse vev.
- Gjenta knipe manøver med tang uttrykke neural netthinnen.
- Bruke pinsett som en skje til å løfte netthinnen, snarere enn å forstå vevet, overføre netthinnen fra hornhinnen innsnitt og plasser direkte i varm medier i en 3 cm rett eller en 6-og vev kultur klynge tallerken.
- Bruk to par fine, vinklet McPherson stil tang å forsiktig dissekere gjenværende linsen fra netthinnen. Dette er best gjort av gripe linsen i periferien av netthinnen cup og trekke mot midten, med en siste disinsertion av glasslegemet fra sentrum som helhet. Bruke pinsett, fjerne eventuelle gjenværende netthinnens pigment epitel fra photoreceptor overflaten av netthinnen.
- Skjær et P1000 Pipetter tips med et barberblad til å opprette en ~ 4 mm åpning for å hindre utilbørlig traumer til delikate netthinnen vev under overføring manøvrer.
- Overføre isolert netthinnen vev i frisk media bruker et kutt P1000 Pipetter tips.
- Klipp 1 mm punches netthinnen rundt synsnerven med en 1 mm biopsi punch utstyrt med en stempelholderen å dislodge vevet i tilfelle det blir lodged i bar (figur 1B). Angi retinal slag i ren media holdt på 37 ° C blokk eller oppvarming pad.
5. analysen protokollen
- Overføre personlige slag til en 24-vel Holme fange microplate bruker et kutt P1000 tips, aspirating 450 µL av medier med vevet.
- Bruk fint, rett tang for å manipulere forsiktig slag i midten av microplate. Holde slag orientert i samme retning (f.eks, ganglion celle side oppover).
- Hvile fange plate en varmeputen eller oppvarming blokk sett 37 ° c som denne fremgangsmåten gjentas for de resterende prøvene.
Merk: For hvert eksperiment, satt til side 3-4 tomme brønner med 450 µL base medier som negative kontroller. I de resterende teste 20-21 brønner, hver biologiske kopiere i tre eksemplarer. Derfor vil hver 24-vel plate tillate opptak fra 6-7 forskjellige dyr eller behandling forhold.
- Hvile fange plate en varmeputen eller oppvarming blokk sett 37 ° c som denne fremgangsmåten gjentas for de resterende prøvene.
- Unngå luftbobler, forsiktig posisjon Holmen fange mesh setter inn i hvert godt med tang og sikre skivene med en metall stempelet eller et kutt P1000 Pipetter tips (figur 1 C).
Merk: Unngå overdreven vev bevegelse under dette trinnet å opprettholde retinal plassering i midten av eksempel microchamber. Luftbobler forvrenge alvorlig OCR målinger. Tilstrekkelig dybde å imøtekomme vanlig mus netthinnen (figur 1 c) har microchamber kan noen ganger maskinering feil i mesh skivene forårsake vev å bli altfor komprimert under skjermen innsetting. Hvis dette skjer, bare noter knust vevet og utelate den prøven fra den endelige analysen. - Inkuber vev platen i en 37 ° C CO2-gratis inkubator for minst 60 min.
- Programmere den ekstracellulære flux analyzer bruker Mix, vent, mål, og gjenta kommandoer. Som et eksempel, en typisk eksperimentere med netthinnen vev kan omfatte følgende: Bland 2 minutter vente 2 minutter og måle 5 minutter. Gjenta eksperimentet med disse tre trinn mellom 5 - 8 ganger (sykluser) for et planlagt opptak, og etter injeksjon av hver sammensatte testet under kjøringen.
- Trykk START programknappen på den ekstracellulære flux analyzer og følg instruksjonene på skjermen for å sette inn kassetten sensor for kalibrering.
- På slutten av kalibreringen, følger du instruksjonene på skjermen for å erstatte calibrant plate med platen inneholder retinal prøvene.
- Tillate at programmet kjører, som programmert. Kjør er ferdig, følger du instruksjonene på skjermen for å løse ut platen vev. Vis resultatene av kjøringen, og lagre datafilen.
- Bøyd 20 gauge nål og tang, fjerne alle mesh innsatser fra brønnene, etterlot retinal slag.
- Nøye Sug opp media fra vevet og vask vevet to ganger med 0,5 mL kaldt fosfat-bufret saltoppløsning (PBS). Sug opp PBS etter vask.
- Legge 100 µL av lyseringsbuffer til hver brønn og Pipetter opp og ned til homogenize vev.
- Quantitate inn-nivå basert på total double-strandet DNA (dsDNA) eller totale proteininnhold.
Merk: Følgende er basert på en kommersielt tilgjengelig dsDNA analysen. - Fortynn lysed prøver 1:1 ved å legge til 100 µL Tris-EDTA (TE) bufferen og overføre 100 µL av utvannet utvalget til en 96 godt plate.
- Legge til 100 µL oppdagelsen bufferen i hver brønn. Etter miksing i 2-5 minutter, quantitate fluorescens etter eksitasjon på 480 nm og utslipp på 520 nm, sammenligne en standard kurve.
- Normalisere rå ekstracellulære flux sporing DNA innhold i brønnen.
Merk: I resultatene presenteres her er prøver normalisert til 50 ng dsDNA - et typisk beløp i en 1 mm retinal punch. Derfor kan absolutte verdier presenteres her sammenlignes studier presenterer data "per retinal punch". Normalisere tracings til en intern standard, som opprinnelige kjøre på en glukose konsentrasjon av 5 mM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruke beskrevet teknikkene (sammenfattet i figur 1), var netthinnen explants fra 8 uke gamle wild type (WT) mus forhold til alder og bakgrunn-matchet transducin null mus (Gnat1- / -). Fordi Gnat1- / - dyr mangler maskiner å lukke syklisk-nukleotid gated ionekanaler som svar på lys stimuli, deres rod fotoreseptorer forblir depolarized selv i lys14. Den påfølgende må opprettholde kalium middelklasseinnbyggere vil skape stor ATP etterspørsel, noe som resulterer i bioenergetisk belastning. For å fastslå Hvis slike endringer i energibehov vil øke oxidative fosforylering eller glycolytic flux, ble vev fra vill type mus og Gnat1- / - mus sammenlignet med den ekstracellulære flux analysatoren. Ved baseline, i nærvær av 5 mM glukose og 1 mM pyruvate, har netthinnen vev fra vill-type dyr lignende priser på syre middelklasseinnbyggere sammenlignet med Gnat1- / - mutanter. Lignende mønstre vises etter 20 mM glukose og glycolytic inhibitor 2-DG (figur 2A). Disse dataene kan også være matematisk forvandlet til representerer Brøkdelen endringer fra grunnlinjen (figur 2B), et format som kan tillate bedre sammenligning mellom ulike eksperimentelle intervensjoner.
Absolutt OCR ved baseline tilsvarer mellom WT og mutant netthinnen vev (figur 3A). Tillegg av 20 mM glukose øker mitokondrie åndedrett, men ingen endringer er observert mellom grupper i absolutt kvantifisering eller i endring fra baseline (figur 3B). Tillegg av 1mM FCCP (en uncoupling agent) å demonstrere maksimal mitokondrie åndedretts priser øker ikke OCR betydelig over nivået sett med høy glukose WT eller Gnat1- / - vev. Imidlertid fall signaler fra begge musene drastisk etter tillegg av RAA cocktail.
Ideelt sett kjøre ekstracellulære flux eksperimenter i nærvær av ATP syntase hemmer oligomycin hjelp identifisere kildene til proton lekkasje, oppstår når bevegelse gjennom elektronet transportkjeden ikke er tilknyttet ATP produksjonen16. I netthinnen explants fra 8 uke-gamle C57BL/6J mus senker oligomycin behandling robust OCR som forventet (Figur 4). Men senere tillegg av FCCP, å finne maksimal OCR, øker bare nominelt OCR til ca 60% av planlagte, samsvarer med en tidligere studie11.
Den XF24 analyzer bruker nedsenkbare sonder som gjør en tett forsegling i vev brønnen, oppretter en midlertidig microenvironment for måling av oksygen og syre flux. Plasseringen av netthinnen vev i godt platen (i forhold til sensorer) kan potensielt påvirke OCR innspillinger, og føre til uønsket forstyrrende faktorer, og noen reserachers har forfektet å plassere netthinnen vev rett under oksygen sensor med den photoreceptor ytre segmenter orientert mot sensoren11. For å teste effekten av netthinnen vev posisjon på OCR målinger, vev fra unge C57BL/6J mus (8 uker gamle) ble analysert i to retninger: retinal ganglieceller vender ned til platen (dvs. fotoreseptorer plasseres oppreist nærmest til sensoren ) eller vendt opp mot sensoren. Ingen forskjeller i relativ OCR FCCP eller RAA ble observert, indikerer tilsvarende sensitivitet for maksimal og minimal mitokondrie åndedretts priser i enten orientering (figur 5A). I tillegg ble absolutt OCR målinger også tilsvarende mellom netthinnens vev i hver retning (figur 5B).
Figur 1 : Isolering av netthinnen explant og oppsett til den ekstracellulære flux analyzer. A. isolering av neural netthinnen i situ ved bruk propulsive kraft på kloden med tang, incising hornhinnen og fjerne netthinnen etter forkaster linsen og fremre hyaloid membraner. B. utarbeidelse av vev for flux med retinal punch skapelse, plassering av personlige slag i Holme fange microplate og bruk av en maske sette å minimere vev bevegelse med microchambers (skala barer = 1 mm). C. en skjematisk, avledet fra levert av produsenten data, viser fremgangsmåten disposisjonen og demonstrere at høyden på microchamber er tilstrekkelig å imøtekomme murine netthinnen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Mitokondrie stress analyse med explanted netthinnen fra 8 uke gamle dyr. A. gjennomsnitt tracings med standard feil av måling (SEM), normalisert DNA innhold i vevet, fra et eksperiment optimalisert for oksygen forbruk innspillinger, sammenligne transducin knockout dyr (Gnat1- / -) kontrollerer Wild. B. samme eksperiment med data transformert slik at du har registrert grunnverdiene angis som referanse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Analyse av glycolytic hastighet med explanted netthinnen fra 8 - uke gamle dyr. A. Averaged, DNA innhold-normalisert, tracings fra et eksperiment optimalisert for acid middelklasseinnbyggere opptak sammenligne transducin knockout dyr (Gnat1- / -) wild kontrollerer. B. Data fra samme eksperimenter normalisert til planlagte innspillinger. Spor viser gjennomsnittlig ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Irreversibel effekter av oligomycin på netthinnen åndedretts priser. I akutt forberedt retinal explants fra 8 uke-gamle C57BL/6J mus reduserer oligomycin behandling det maksimale OCR indusert av påfølgende tillegg av FCCP. Spor viser gjennomsnittlig ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Effekter av vev posisjonering på OCR measurement. Netthinnen vev fra 8 uke-gamle C57BL/6J mus ble plassert i brønner med ganglieceller vender mot sensoren (Ganglion celler opp) eller fra sensoren (Ganglion celler ned). Mellom grupper, lignende ekstracellulære flux innspillinger er observert i (A) åndedretts kapasitet i forhold til opprinnelige eller (B) når det gjelder absolutt kvantifisering. Spor viser gjennomsnittlig ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OCR og ECAR måles lett i explanted netthinnen vev ved hjelp av en bioanalyzer ved hjelp av beskrevet teknikker. Denne metoden avviker fra de andre grupper i flere viktige trinn. Netthinnen vev er isolert gjennom en stor hornhinnen snitt uten enucleating i verden, som opprinnelig ble beskrevet av Winkler15. Denne metoden retinal isolasjon gjør en rask overføring fra levende øyet inn i vev fange plate (ofte innen 5 minutter). Vev holdes på 37 ° C hele prosessen, som bevarer cellular respirasjon bedre enn når de plasseres på isen. Medier med minimal tilsetningsstoffer brukes for første målinger, utelater alle bufring agenter som HEPES eller natriumbikarbonat, serum eller overflødig makronæringsstoffer, da dette gir mer pålitelig måling av basale energi metabolisme og hemmer ikke vurdering av ECAR. Netthinnen slag registreres best i et 24-vel format, ikke i 96-brønner, minimere traumer til vev. Netthinnen vev er plassert i midten av brønnen i vev-microchamber og sikret med en mesh inn. Gjør så gir nøyaktig opptak av ECAR og OCR, mens forebygge overdreven vev bevegelse under kjøringen, og eliminerer behovet for andre reagenser som vev lim. En kjøretøy injeksjon under kjøre anbefales spesielt når sette opp innspillingen eksperimenter for første gang, som dette vil gi en følelse av hvor godt vevet er sikret i fangst platen. OCR innspillinger ved hjelp av denne teknikken er uavhengig av netthinnen orientering i brønnen, men retningen må holdes konsekvent blant prøver i eksperimenter. Alle mål tas bare etter retinal metabolisme har nådd steady state etter injeksjon av testen forbindelser.
Denne protokollen beskriver normalisering av data til DNA innholdet, som en proxy for celle nummer. Slike en teknikk er en fordel fordi det utgjør endringer i celle nummer drevet av variasjon i netthinnen tykkelse, punch størrelse eller forskjeller i cellularity mellom genetisk ulike eksempler. Totalt protein-basert normalisering er også en pålitelig metode, og har fordelen av å minimere forskjeller i total mitokondrie masse mellom retinal prøvene. Imidlertid kan normalisering basert på protein i hele vev bli forvirret av endringer i ekstracellulær matrix mellom eksempler. Normalisering av flux opptak grunnlinjen, er som vist i representant resultatene en fordel fordi det reduserer variasjon i netthinnen punch størrelse mellom gjentak og lett lar tolkning av endringer på grunn av farmakologisk intervensjon. Rapportering av rå verdier, kan imidlertid for bedre sammenligning mellom forskjellige eksperimenter og eksperimenter utført ved hjelp av ulike flux opptak metoder.
Resultatene ved hjelp av disse teknikkene er sammenlignbare rapportert andre steder. Selv om oligomycin - en ATP syntase inhibitor - brukes vanligvis til å måle proton lekkasje i vev eller celler av interesse, har denne forbindelsen uheldige effekter på netthinnen metabolismen. I eksperimentene rapporterte her, en 60% reduksjon i maksimal retinal OCR brakt frem av FCCP er observert etter eksponering for oligomycin (Figur 4), nesten identisk med en tidligere studie11. En mulig forklaring på dette funnet er irreversibel skade eller endring retinal mitokondrier ved ATP syntase hemming. Videre, som Kooragayala og kolleger først rapportert11, retinal mitokondrier er sannsynlig opererer på nær maksimal priser i basale forhold siden en elektronet transport kjeden uncoupling agent, FCCP, bare øker OCR av 15% (Figur 3 , Figur 5).
Ekstracellulære flux opptak i explanted netthinnens vev demonstrere en stor reserve glycolytic kapasitet, siden tillegg av 20 mM glukose utløser en to-fold økning i ECAR (figur 2). Fordi oligomycin, vanligvis brukes til å måle maksimal glycolytic kapasitet, har skadelige effekter på netthinnen vev (Figur 4), kan bruk av høy glukose tillegg til opptak tjene som bedre proxy å måle glycolytic reserve i netthinnen. En viktig påminnelse hindrer bruk av ECAR som ren proxy for glycolytic rate er at CO2 frigjort av citric acid syklusen kan være en betydelig kilde til syre i kulturperler vev17. Overflødig pyruvate øker ikke ECAR over nivåene brakt frem av høy glukose og glycolytic fluks er nesten eliminert i netthinnen explants med overflødig molar prosenter av 2-DG (figur 2). ATP brukes til å generere membran potensial fra depolarization hendelser i dark-adapted netthinnen, skal dyr mangler transducin bruke mer energi enn WT kolleger. Men i explants, ble forskjeller i netthinnen energi metabolism mellom Gnat1- /- og kontrollene ikke sett på eksperimenter beskrevet her (figur 2 og 3). Disse resultatene er konsistente med regnskapsprinsippene Hentet ved hjelp av en egendefinert perfusjon apparater for å måle OCR i Gnat1- / - dyr18. Spesielt tilpasset apparatet brukes av Du og kolleger tillatt for måling av OCR under lys-tilpasset og mørke tilpasset forhold. Dermed er en liten, men signifikant nedgang i OCR etter lyseksponering oppdaget i vill-type netthinne, men ikke i Gnat1- / - Netthinne18. Dette illustrerer en stor begrensning av gjeldende teknikken måle ECAR og OCR i explanted Netthinne - det ekstracellulære flux analyserer her er avhengig av synlig lys magnetisering av fluorophores innebygd i sin oksygen og pH sensorer, eliminere den muligheten til å utføre målinger i dark-adapted vev. Slike målinger er svært relevante for visuell fysiologi og vil fortsatt kreve bruk av eldre teknikker designet eksklusivt for studiet av netthinnen metabolisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Alexander Kolesnikov og Dr. Vladimir Kefalov for å gi Gnat1- / -mus, for nyttig tilbakemelding og råd og lese manuskriptet.
Dette arbeidet ble støttet av NIH EY025269 (RR), Diabetes Research Center ved Washington University - ya DK020579 (JRM og RR), en karriere Development Award fra forskning hindre blinde (RR), Horncrest Foundation (RR), en karriere Development Award fra JDRF ( JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) og DK114233 (JRM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps - Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals |
References
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
- Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Wubben, T. J., et al. Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration. Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).
- Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers. Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).
- Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging. Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).
- Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
- Winkler, B. S. Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function. The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).
- Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Pearsall, E. A., et al. PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival. BMC biology. 15 (1), 113 (2017).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of visualized experiments. (46), (2010).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Winkler, B. S. The electroretinogram of the isolated rat retina. Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).
- Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Du, J., et al. Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina. The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).
