Summary
Bu teknik oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları explanted fare Retina dokularında bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak gerçek zamanlı kayıt açıklar.
Abstract
Yüksek keskinliği vizyon ağır enerji tüketen bir süreç ve retinanın tam şeffaflık görsel eksen koruyarak böyle taleplerini karşılamak için birkaç benzersiz uyarlamaları geliştirmiştir. Bu hassas denge için tedirginlikler diabetik retinopati gibi kör edici hastalıklar neden. Bu nedenle, enerji metabolizması değişiklikleri retina anlayış hastalığı sırasında vison kaybı çeşitli nedenleri için rasyonel tedavilerin geliştirilmesi şarttır. Piyasada bulunan hücre dışı akı Analizörleri son gelişiyle Retina enerji metabolizması çalışmanın daha erişilebilir yaptı. Bu iletişim kuralı katkıları Retina enerji arzına - Oksidatif fosforilasyon ve glikoliz - iki prensip kolları aracılığıyla yapılan oksijen tüketimi (OCR) miktarının ölçmek için böyle bir çözümleyici kullanımını açıklar ve ekstrasellüler Bu yollar için proxy olarak asitleştirme oranları (D.H.T.). Bu tekniği tek denemede birden çok farmakolojik ajanlara yanıt değerlendirilmesi kolaylaştırılması explanted Retina dokusunda kolayca gerçekleştirilir. Retina çubuk photoreceptor sinyal eksik hayvanlardan metabolik imzalar bu yöntemi kullanarak vahşi-tür denetimlere karşılaştırılır. Bu teknikte önemli bir sınırlama ışık uyarlanmış ve dark-adapted enerji kullanımı, önemli bir fizyolojik göz retina doku arasında ayırımcılık için yetenek eksikliğidir.
Introduction
Retina Merkezi sinir sistemi1en enerji talep dokularda arasındadır. Çoğu dokular gibi bu mitokondri sitozol ya da yolu ile Oksidatif fosforilasyon adenozin trifosfat (ATP) üzerinden glikoliz oluşturur. Glikoliz glikoz bir molekül ATP üretmek için enerjik avantaj Oksidatif fosforilasyon açıktır: 36 molekül ATP üretilen eski vs 2 ikinci gelen üretilen ATP molekülleri. Buna göre Retina nöronlar mitokondrial solunum enerji arzı için öncelikle bağlıdır ve bu mitokondri2onların yüksek yoğunluklu tarafından yansıtılır. Oksijen bol olsa bile henüz, retina da ağır glycolytic makine üzerinde dayanır. Aerobik glikoliz bu sürecin aslında kim bir kez retina sadece sonrası mitotik doku metabolizması4bu tür yetenekli olduğunu kaydetti Otto Warburg3tarafından kanser hücrelerinin içinde tanımlanmıştır. Bu ilk gözlemler beri birçok sonrası mitotik doku glikoliz Oksidatif fosforilasyon ek olarak değişen derecelerde ATP taleplerini karşılamak için girişme tarif edilmistir.
Phototransduction, görsel pigment biyosentezi photoreceptor dış segmentleri ve sinirsel aktivite geri dönüşüm, tüm enerji photoreceptors, baskın nöronal alt sınıfta retina zorlu süreçlerde vardır. Ama karşı onların elektrik iyonları ve konsantrasyon degradeler aktif taşıma gerek en enerjik alıcı bir süreç nöronların1gereğidir. Photoreceptors Kanal kapatma ve sonraki hyperpolarization hafif bir uyarıcı tetikler Oysa onlar (Yani, karanlık), stimülasyon yokluğunda depolarized anlamda kendine özgü nöronlar vardır. Bu nedenle, karanlıkta, retina ATP olarak yaygın olarak adlandırılan depolarizasyon veya "karanlık akımı" korumak için büyük miktarlarda tüketmek. Adaptif değiştiremeyeceğinden, bu büyük miktarda ATP temin büyük bir meydan okuma optik eksen aracılığıyla görsel netlik sağlamak organizmalar için ihtiyaç vardır. Photoreceptors ışık yolunu uzak tedarik yoğun kılcal ağ tutar olarak modern yaratıkları görmüş ters Retina baskın çözüm mimarisidir. Ama bu hayret doğal Biyomühendislik retina metabolik rezerv açısından bir uçurumun yerleştirir. Hatta küçük hakaret retina için potansiyel enerji arz talep hassas dengesini bozabilir ve görsel fonksiyon bozukluğu veya frank körlüğü hızlı bir şekilde doğmak.
Sinirsel retinanın vasküler kaynağı, onun sıkı kısıtlama ile birleştiğinde, benzersiz enerjik talepleri göz önüne alındığında hastalığı sırasında ATP tüketimi retina ve değişiklikleri doğru ölçüm anlamakta ve tedavi derin etkileri olabilir retinitis pigmentosa ve diyabetik retinopati gibi koşulları kör. Geleneksel olarak, bu ölçümler laboratuar tamamen metabolik aktivite2,5,6ölçümleri için adanmış bir avuç çıkan en çalışmaları ile pahalı, özel tasarlanmış ekipman gerektiren, 7,8. Teknikleri belirli metabolitleri, radyo etiketli öncüleri, oksijen tüketimi kayıt Clark elektrotlar ve9profil oluşturma metabolomic kullanarak kullanarak izleme çalışmaları için bireysel testleri içerir.
Gelişmeler ile yüksek-den geçerek teknoloji ve ticari cihazlar, kullanılabilirliğinin artması, giderek erişilebilir ve uygun teknikleri kayıt Retina metabolizma. Burada açıklanan yöntemi hem Oksidatif fosforilasyon ölçer ve glikoliz retina kullanarak doku ve piyasada bulunan hücre dışı akı analyzer9,10,11,12explanted. Bu Çözümleyicisi ayrı olarak oksijen tüketim oranını (OCR) ve Oksidatif fosforilasyon ve glikoliz, sırasıyla13dolaylı göstergeleri olarak hizmet veren hücre dışı asitleştirme oranı (D.H.T.), kaydeder. Bu ölçümler faiz doku üzerinde oluşturulan bir microchamber içinde örtülü bir sonda tarafından yapılır. Daha önce yayımlanmış yöntemleri bu uyum pankreas adacıkları of Langerhans için tasarlanan bir yakalama plaka fare retina küçük, dairesel bölümlerde metabolik etkinliklerini kaydetmek için kullanır. Birden fazla farmakolojik poz doku için sistem 4 enjeksiyon portu her örnek için de içerdiği için bir tek kayıt ders sırasında teslim edilebilir. D.H.T. ve OCR kayıtları için en iyi duruma getirilmiş ayrı protokol ile bu sistemi kullanarak, vahşi tipi Retina yanıt (Gnat1- / -), transducin eksik Retina karşılaştırılabilir bir nedeni konjenital sabit gece körlüğü insanlar14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İletişim kuralları vizyon Araştırmaları Derneği ve Oftalmoloji deyim için hayvan kullanımı izlemek ve Washington Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. hayvan hazırlık
- Hayvanlar 12 saat ile standart konut içinde 12 saat ışık-siklet için karanlık tutun. Begin deneyler standart kez sirkadiyen etkileri, genellikle sabah ışıkları yanar kısa bir süre sonra önlemek için.
2. çözüm hazırlık
- 8.4 mg (GKD2O) çift distile H2O toz medya çözülerek temel ortam hazırlamak ve pH HCl ve NaOH 7.4 için ayarlamak, 1 final bir birime L. filtre sterilize bu çözüm 0,22 µm doku kültürü filtre ile.
- 1 M glikoz ve 100 mM sodyum pyruvate son 5 mM şekeri konsantrasyonları elde etmek için medya ve 1 mM pyruvate ekleyin.
- 37 ° C su banyosu temel medya 50 mL aliquot bir yer.
- Tris temel ekleyerek 10 mM, Polietilen glikol tert-octylphenyl Eter %0,2 (v/v) ve tüm GKD2O. tüm bileşenlerini tamamen çözülmüş ve ayarlamak kadar Mix 1 mm EDTA lizis çözüm, doku Nefelometri akı analizi, sonunda hazırlamak 8,0 pH.
- Mitokondrial stres iletişim kuralı için iyi 1 µM son bir konsantrasyon hedeflemek için temel ortamda çözünmüş oligomycin, bir ATP sentaz inhibitörü 11 µM stokunun hazırlayın. Hazırlamak bir 11 µM stok karbonil siyanür - 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), uncoupling ajanı, çözünmüş iyi 1 µM son bir konsantrasyon hedeflemek için temel medya. Elektron taşıma zinciri inhibitörleri, Rotenon ve antimycin A (RAA Rotenon 11 µM ve antimycin A 22 µM için için ekleyerek) bir kokteyl hazırlamak 1 µM Rotenon ve 2 µM antimycin A içinde son bir konsantrasyon hedeflemek için temel ortamda çözünmüş de.
- Glikoliz iletişim kuralı için bir 220 mM hisse senedi iyi 20 mM son bir konsantrasyon hedeflemek için temel ortamda çözünmüş glikoz hazırlayın. Ayrıca 2-deoxyglucose (2-DG) 1,1 M stokunun, glikoz ve glycolytic antagonisti, rekabetçi bir önleyici temel medyada çözülerek hazırlayın. Bu 100 mM 2-DG iyi son bir konsantrasyon hedefleyecektir.
3. aleti kalibrasyon
- Araçları bir hücre dışı akı tahlil için ayarlamak için sensör kartuş (24 kuyu toplam) her şey için kalibrasyon çözüm 1 mL ekleyin ve CO237 ° C'de kuluçkaya-özgür kuluçka geceleme (ya da en az 8 saat).
- Katkı maddeleri, mitokondrial Stres Protokolü veya glikoliz protokolü için her enjektör bağlantı noktası, A ile D, iyi cilt değişiklikleri için ayarlama sensör kartuþundaki yüklemek.
Not: Örneğin, tipik bir tahlil bir katkı ilk enjektör bağlantı noktasına 45 µL, ikinci, üçüncü ve 60 µL son, içine içine 54,5 µL 450 µL bir ilk iyi hacmi varsayarak içine 49,5 µL içerir. - İlk birkaç deneyler sırasında temel medya bağlantı bir bağlantı noktası enjeksiyon sonra ne kadar doku hareketi/yapay doku oluşur ölçmek için noktası A içine yükleyin.
- Bir sigara-CO2 kuluçka için en az 60 dk. 37 ° C'de kuluçkaya için yüklü sensörü plaka izin.
4. yalıtım taze fare Retina dokusunun
Not: Bu adım Dr Barry Winkler15tekniği adapte olduğunu.
- Derin anestezi'ni kullanarak yönetme sonra bir standart ketamin/xylazine kokteyl, servikal çıkığı tarafından fareler ötenazi.
- Kıvrımlı pensler orta ölçekli bir çift optik sinir, posterior dünya kavramak ve yavaşça proptose göz (Şekil 1A) ileri baskı uygulamak için kullanın.
- Temiz bir tıraş bıçağı ile bir limbus limbus kesi kornea arasında bir tek, kasıtlı geçmek-in bıçak kullanarak oluşturun.
- İyi kullanarak, açılı McPherson tarzı forseps, posterior dünyanın objektif ve korneal kesi dışında anterior hyaloid membran ifade etmek için çimdik. Bu doku atmak.
- Kıstırma manevra forseps ile sinirsel retina ifade etmek için yineleyin.
- Bir kaşık gibi forseps retina kaldırmak için yerine doku kavramak için kullanarak, korneal kesi uzak retina aktarmak ve 3 cm çanak veya 6-iyi doku kültürü küme plaka sıcak ortamda doğrudan yerleştirin.
- İyi, açılı McPherson tarzı forseps iki çift yavaşça retina üzerinden kalan vitre incelemek için kullanın. Bu en iyi Retina Kupası çevre vitre açgözlü ve bir bütün olarak Merkezi'nden vitreus vücudun son bir disinsertion ile merkezine doğru çekerek yapılır. Forseps kullanarak, herhangi bir kalıntı retina pigment epiteli retina photoreceptor yüzeyinden kaldırın.
- P1000 damlalıklı bahşiş aşırı travma için hassas Retina doku transferi manevralar sırasında önlemek için ~ 4 mm açılış oluşturmak için bir tıraş bıçağı ile kesti.
- İzole Retina doku kesme P1000 damlalıklı bahşiş kullanarak yeni medya aktarın.
- Retina çevresinde optik sinir 1 mm biyopsi ile 1 mm yumruklardan punch delik (Şekil 1B) saplanmış olur diye doku çıkarmak için bir dalgıç ile donatılmış kesim. Retina yumruklar bir kenara temiz medya 37 ° C blokta tutulabilir ya da yastık Isıtma ayarlayın.
5. tahlil Protokolü
- Tek tek yumruk 450 µL medya ile birlikte doku alıyorum bir kesim P1000 ucu, kullanarak bir 24-şey adacık yakalama Mikroplaka aktarın.
- Tamam, yavaşça yumruk Mikroplaka ortasına içine işlemek için düz forseps kullanın. Aynı yönde (Örneğin, ganglion hücre tarafı yukarı doğru) yönelik yumruk tutun.
- Yakalama plaka bir ısıtma yastığı veya adımları kalan örnekleri için yinelenir gibi 37 ° C blok kümesine Isıtma üzerinde bekletin.
Not: Her deneme için 3-4 boş wells 450 µL negatif denetimler olarak hizmet etmek temel medya ile bir kenara koyun. 20-21 wells kalan her biyolojik REPLICATE nüsha olarak sınayın. Bu nedenle, her 24-şey plaka kaydı için 6-7 farklı hayvan veya tedavi koşulları sağlayacaktır.
- Yakalama plaka bir ısıtma yastığı veya adımları kalan örnekleri için yinelenir gibi 37 ° C blok kümesine Isıtma üzerinde bekletin.
- Hava kabarcıkları, yavaşça pozisyon kaçınarak adacık kafes ekler her şey forseps kullanarak yakalamak ve ekler bir metal dalgıç veya bir kesim P1000 damlalıklı ucu (Şekil 1 C) ile güvenli.
Not: Aşırı doku hareket Merkezi bünyesinde Retina yumruk konumunu örnek microchamber korumak için bu adımı sırasında kaçının. Hava kabarcıkları ciddi OCR okuma deforme. Microchamber tipik fare retina (Şekil 1 c) karşılamak için yeterli derinlik olmasına rağmen zaman zaman kafes ekler işleme hatalarını dokularda aşırı ekran ekleme sırasında sıkıştırılmış haline neden olabilir. Bu durumda, sadece ezilmiş doku not alın ve bu örnek son çözümleme dışı bırakmak. - Kuluçkaya doku plaka 37 ° C CO2-en az 60 dakika için özgür kuluçka makinesi.
- Kullanarak Mix, bekle, ölçü birimi hücre dışı akı analyzer programı ve komutları yineleyin. Örnek olarak, Retina doku ile tipik bir deneme aşağıdakiler dahil: 2 dakika karıştırın, 2 dakika bekleyin ve 5 dakika ölçmek. Bu üç ile deneme adımlar arasında tekrar 5 - 8 kat (devir) bir temel kayıt için ve sonra çalışma sırasında test edilen her bileşik enjeksiyon.
- Hücre dışı akı analyzer programı Başlat düğmesine basın ve sensör kartuş kalibrasyon için eklemek için ekrandaki yönergeleri izleyin.
- Kalibrasyon sonunda calibrant plaka Retina örnekleri içeren plaka ile değiştirmek için ekrandaki yönergeleri izleyin.
- Çalıştırmak, program programlı olarak izin. Çalışma bitiminde, doku plaka çıkarmak için ekrandaki yönergeleri izleyin. Çalışma sonuçlarını görüntülemek ve veri dosyası depolamak.
- Bir bükülmüş 20 gauge iğne ve forseps ile retina yumruk geride bırakarak kuyulardan tüm kafes ekler kaldırın.
- Dikkatle doku medyadan Aspire edin ve doku 0.5 mL soğuk fosfat tamponlu tuz (PBS) ile iki kez yıkayın. PBS yıkandıktan sonra Aspire edin.
- 100 µL lizis arabelleği her şey ve damlalıklı yukarı ve aşağı doku homojenize ekleyin.
- Toplam çift iplikçikli DNA (dsDNA) veya toplam protein içeriği temel giriş düzeylerini quantitate.
Not: Aşağıda bir piyasada bulunan dsDNA tahlil dayanmaktadır. - 100 µL Tris-EDTA (TE) arabelleği ekleyerek lysed örnekleri 1:1 oranında seyreltin ve seyreltilmiş örnek 100 µL 96 iyi bir tabağa aktarın.
- 100 µL algılama arabelleği her kuyunun içine ekleyin. 2-5 dakika karıştırdıktan sonra floresan sonra 480 nm, uyarma ve emisyon 520, quantitate nm, standart bir eğri karşılaştırma.
- DNA içeriği kuyu içinde ham hücre dışı akı izlemeyi normalleştirmek.
Not: Burada sunulan sonuçlarında örnekleri 50 ng dsDNA - 1 mm Retina yumruk tipik bir miktar için normalleştirilmiş. Bu nedenle, mutlak değerler burada sunulan "başına Retina yumruk" veri sunma çalışmaları karşılaştırıldığında. Temel koşmak bir glikoz konsantrasyonu 5 mm gibi tracings bir iç standart normalleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
( Şekil 1' de özetlenen) açıklanan teknikleri kullanarak, 8 haftalık vahşi türü (WT) fareler gelen Retina explants yaş ve arka plan eşleşen transducin null fareler için (Gnat1- / -) karşılaştırıldı. Gnat1- / - hayvan kapatmak için makine eksikliği nedeniyle nükleotit döngüsel ışık bizi canlı tutan iyon kanalları geçişli, onların çubuk photoreceptors bile ışık14' te depolarized kalır. Sonraki potasyum sızma Biyo-enerjetik zorlanma kaynaklanan büyük bir ATP talep yaratacak korumak gerekir. Enerji talepleri böyle nöbetleşe Oksidatif fosforilasyon veya glycolytic akı artış olacaktır Eğer belirlemek için vahşi türü fareler ve Gnat1- / - fareler dokulardan ekstraselüler akı Çözümleyicisi'ni kullanarak karşılaştırıldı. Taban çizgisi, 5 mM glikoz ve 1 mM pyruvate, huzurunda yaban tipi hayvanlardan Retina dokularının asit sızma Gnat1- / - mutantlar için karşılaştırıldığında benzer oranları var. Benzer modeller 20 mM glikoz ve glycolytic inhibitörü 2-DG (Şekil 2A) eklenmesinden sonra görülür. Bu veriler de matematiksel olarak kısmi değişiklikler temel (Şekil 2B), farklı deneysel müdahaleler arasında daha iyi karşılaştırma için izin verebilir bir biçimde temsil için dönüştürülmesi.
Satır taban çizgisi, mutlak OCR WT ve mutant Retina doku (Şekil 3A) arasında eşdeğerdir. 20 mM glikoz ilavesi mitokondrial solunum artırır, ancak herhangi bir değişiklik mutlak miktar açısından veya temel (3B rakam) değişim açısından gruplar arasında görülmektedir. 1mM FCCP (uncoupling bir ajan maksimal mitokondrial solunum oranları göstermek için) yanı sıra önemli ölçüde OCR WT veya Gnat1- / - dokularda yüksek glikoz ile görüldü seviyesinden artırmaz. Ancak, her iki fare gelen sinyalleri büyük ölçüde RAA kokteyl eklenmesinden sonra bırakın.
İdeal olarak, hücre dışı akı deneyler proton sızıntı, elektron taşıma zinciri hareketi ATP üretimi16ile ilişkili olmadığı zaman meydana gelen kaynaklarının belirlenmesinde ATP sentaz inhibitörü oligomycin yardım huzurunda çalıştırın. 8 haftalık C57BL/6J fareler gelen Retina explants içinde oligomycin tedavi OCR, sağlam beklenen (Şekil 4) düşürür. Ancak sonraki ek FCCP maksimal OCR, bulmak için sadece sözde taban çizgisi, bir önceki çalışmada11ile tutarlı yaklaşık % 60 için OCR artırır.
XF24 analyzer ölçüm oksijen ve asit akı için geçici bir microenvironment oluşturma doku kuyu içinde sıkı bir mühür olun dalgıç probları kullanır. İyi plaka (ile ilgili olarak sensörler) Retina dokusunun konumlandırma potansiyel OCR kayıtları etkisi ve yol için istenmeyen kaynaklanan ve bazı reserachers Retina doku oksijen sensörü ile doğrudan altına yerleştirerek savunduk photoreceptor dış kesimi doğru sensör11odaklı. Retina doku pozisyon OCR ölçümlere etkilerini sınamak için genç C57BL/6J fareler (8 haftalık) dokulardan iki yönelimleri analiz edildi: Retina ganglion hücrelerinin aşağı bakacak şekilde plaka (en yakın sensör için dik yerleştirilmişYani, photoreceptors üzerine ) veya yukarı dönük olacak şekilde doğru sensörü. Maksimum ve minimum mitokondrial solunum oranları her iki yönde (Şekil 5A) için eşdeğer hassasiyet gösteren FCCP veya RAA karşılık olarak göreli OCR hiçbir farklılıklar gözlenmiştir. Buna ek olarak, mutlak OCR ölçümleri de her iki yönde (Şekil 5B) Retina dokularının arasında eşdeğer.
Resim 1 : Retina explant ve Kur hücreye ekstraselüler akı analyzer. İtici güç forseps ile küre üzerinde vurması, kornea incising ve retina objektif ve ön hyaloid membranlar discarding sonra silmesi tarafından sinirsel retina in situ A. yalıtım. B. microchambers ile doku hareketi en aza indirmek için doku için hazırlık ile retina yumruk oluşturma, bireysel yumruklar adacık yakalama Mikroplaka içine yerleştirme ve bir kafes eklemek kullanımı kayıt akı (ölçek çubukları = 1 mm). C. bir şematik gösterilen yordam anahat ve microchamber yüksekliğini fare retina karşılamak yeterli olduğunu gösteren üretici tarafından sağlanan veri, türetilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : 8 haftalık hayvanlardan explanted retina kullanarak mitokondrial gerilme analizi. A. transducin nakavt hayvanlar (Gnat1- / -) karşılaştırarak oksijen tüketimi kayıtları için en iyi duruma getirilmiş bir deneme dokunun, DNA içeriği için normalleştirilmiş tracings ölçüm (SEM), standart hata ile ortalama vahşi türü denetimleri. B. temel kayıtları başvuru olarak ayarlanmış şekilde dönüştürülmüş veri ile aynı deneyi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Glycolytic kuru kullanılarak analiz retina 8 - hafta eski hayvanlardan explanted. A. Dant, DNA içeriği normalleştirilmiş, tracings asit sızma kayıtları transducin nakavt hayvanlar (Gnat1- / -) vahşi türü denetimlere karşılaştırma için en iyi duruma getirilmiş bir deneme. B. aynı verileri temel kayıtları için normalleştirilmiş denemeler yapın. Ortalama ± SEM göstermektedir Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Oligomycin geri dönüşü olmayan etkileri Retina solunum oranları. 8 haftalık C57BL/6J fareler gelen akut hazırlanan Retina explants içinde oligomycin tedavi FCCP sonraki eklenmesi tarafından indüklenen maksimal OCR azaltır. Ortalama ± SEM göstermektedir Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Doku OCR ölçüm üzerinde konumlandırma etkileri. 8 haftalık C57BL/6J fareler Retina dokulardan wells ganglion hücrelerinin sensör (Ganglion hücreleri yukarı) doğru veya sensör (Ganglion hücreleri aşağı) uzak bakan ile yerleştirildi. Gruplar arasında benzer hücre dışı akı kayıtları açısından mutlak miktar temel veya (B) göre(a)solunum kapasitesi açısından gözlenir. Ortalama ± SEM göstermektedir Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OCR ve D.H.T. kolayca açıklanan teknikleri kullanarak bir bioanalyzer kullanarak explanted Retina dokularında ölçülür. Bu, diğer grupların birkaç kritik adımda bu yöntem başlamaktadır. Retina dokularının orijinali Winkler15tarafından açıklanan dünya, enucleating olmadan büyük bir korneal kesi izole edilmiştir. Bu yöntemi Retina tecrit (genellikle 5 dakika içinde) doku yakalama plaka içine hızlı bir transfer yaşam göz olanak sağlar. Doku hücresel solunum ne zaman buz üzerinde yerleştirilir daha iyi korur sürecinde 37 ° C'de tutulur. Medya en az katkı maddeleri ile bu bazal enerji metabolizmasının daha güvenilir ölçümler sağlar ve değil inhibe etmez gibi herhangi bir arabelleğe alma aracıları HEPES veya sodyum bikarbonat, serum veya aşırı macronutrients gibi atlama ilk ölçümleri için kullanılır D.H.T. değerlendirilmesi. Retina yumruklar en iyi bir 24-iyi biçimde yerine 96-Wells, travma doku için en aza indirmek için kaydedilir. Retina doku doku microchamber içinde iyi ortasına yerleştirilir ve bir kafes eklemek ile güvenli. İşin çok doğru kayıt D.H.T. ve OCR, çalışma sırasında aşırı doku hareketi engelleyen süre için izin verir ve doku yapıştırıcı gibi diğer reaktifler gereksinimini ortadan kaldırır. Özellikle bu ne kadar iyi doku yakalama plaka içinde güvenli bir anlamda sağlayacaktır olarak kayıt deneyler kadar ilk kez ayarlarken bir araç enjeksiyon'ın çalışma sırasında önerilir. Bu tekniği kullanarak OCR kayıtları kuyu içinde Retina yönünün bağımsızdır ama yönlendirmesini deneyleri içinde örnekleri arasında tutarlı tutulmalıdır. Retina metabolizma takip enjeksiyon testi bileşiklerin kararlı duruma ulaştığında tüm ölçümler alınır.
Bu iletişim kuralı için toplam DNA içeriği, veri normalleştirme cep numarası için bir proxy olarak açıklar. Böyle bir tekniği avantajlı çünkü değişiklikler Retina kalınlığı, yumruk boyutu veya cellularity farklılıkları genetik olarak farklı örnekleri arasında varyasyon tarafından tahrik cep numarası için hesap olacaktır. Toplam protein bazlı normalleştirme da güvenilir bir yöntem ve toplam mitokondrial kitle Retina örnekler arasındaki farklılıkları en aza indirme avantajı vardır. Ancak, protein içeriği tüm doku göre normalleştirme değişiklikleri örnekleri arasında hücre dışı matriks şaşırmış. Çünkü bu değişkenliği çoğaltır arasında retina yumruk boyutunda en aza indirir ve kolayca değişiklikler nedeniyle farmakolojik müdahaleler yorumu sağlar temsilcisi sonuçlarında gösterildiği gibi satır taban çizgisi, akı kayıtları normalleştirme daha avantajlıdır. Ancak, ham değerlerini raporlama için farklı deneyler arasında daha iyi karşılaştırma ve farklı akı kayıt yöntemleri kullanılarak gerçekleştirilen deneyler için sağlar.
Bu teknikleri kullanarak sonuçları başka bir yerde bildirilen kişilere karşılaştırılabilir. Oligomycin - bir ATP sentaz inhibitörü - genellikle proton sızıntı dokular veya hücreleri ilgi içinde ölçmek için kullanılsa da, bu bileşik Retina metabolizma üzerinde olumsuz etkileri vardır. Rapor burada deneylerinde maksimal Retina FCCP tarafından elde edildi OCR oligomycin (Şekil 4), hemen hemen aynı bir önceki çalışmada11' e maruz kaldıktan sonra gözlenen % 60 azalma. Bu bulgu için potansiyel bir açıklaması geri dönüşümsüz hasara veya Retina mitokondri ATP sentaz inhibisyon tarafından değişiklik var. Ayrıca, Kooragayala ve arkadaşları ilk11, mitokondri bazal koşullar maksimal fiyatlarına yakın bir elektron taşıma zinciri uncoupling Ajan beri işletim muhtemeldir Retina rapor olarak FCCP, yalnızca artar OCR yaklaşık 15 oranında (Şekil 3 , Şekil 5).
20 mM glikoz ilavesi D.H.T. (Şekil 2) bir iki kat artış ortaya çıkarır bu yana ekstraselüler akı kayıtları explanted Retina dokularında büyük rezerv glycolytic kapasitesi göstermektedir. Oligomycin, genellikle maksimal glycolytic kapasitesi, ölçmek için kullanılan bir retina dokularında (Şekil 4) zararlı etkileri olduğundan, yüksek glikoz ek kayıt kullanımı retina glycolytic yedekte ölçmek için daha iyi vekil olarak hizmet verebilir. Glycolytic oranı saf bir proxy olarak D.H.T. kullanımı engelleyen önemli bir uyarı sitrik asit döngüsü tarafından kurtarılmış o CO2 asit kültürlü dokusu17önemli bir kaynak olabilir olduğunu. Aşırı pyruvate D.H.T. tarafından yüksek glikoz elicited seviyelerinin üzerinde artmaz ve glycolytic akı Retina explants 2-DG (Şekil 2) aşırı molar oranları kullanarak neredeyse ortadan kalkar. ATP membran dark-adapted retina depolarizasyon olaylardan oluşan potansiyel yeniden oluşturmak için kullanılan bu yana, transducin eksik hayvanlar WT göre daha fazla enerji harcamak için bekleniyor. Ancak, explants, Gnat1- / - ve denetimleri arasında retina enerji metabolizması farklılıklar burada açıklanan deneylerde (Şekil 2 ve 3) görüldü değil. Bu sonuçlar OCR Gnat1- / - hayvanlar18' ölçmek için bir özel perfüzyon aparatı kullanılarak elde tutarlı. Özellikle, Özel aparat Du tarafından kullanılan ve meslektaşları OCR ölçme ışık uyarlanmış ve karanlık adapte koşullar altında izin verdi. Böylece, OCR bir küçük ama önemli bir düşüş hafif maruz kaldıktan sonra vahşi tipi Retina ama Gnat1- / - Retina18algılandı. Bu önemli bir sınırlama D.H.T. ve explanted Retina OCR ölçüm geçerli teknik göstermektedir - burada kullanılan hücre dışı akı analyzer, oksijen ve pH sensörler ortadan kaldırarak, gömülü fluorophores görünür ışık uyarma kullanır ölçümleri dark-adapted dokularda gerçekleştirme imkanı. Bu ölçümler görsel fizyolojisine son derece alakalı ve hala eski teknikleri sadece Retina metabolizma çalışma için tasarlanmış kullanımı gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Dr Alexander Kolesnikov ve Dr Vladimir Kefalov Gnat1- / -verdiğiniz için teşekkür ederizfareler, yararlı geribildirim ve öneriler için ve makale okumak için.
Bu eser tarafından NIH EY025269 (RR), diyabet araştırma merkezi Washington Üniversitesi - NIH DK020579 desteklenmiştir (JRM ve RR), araştırma önlemek körlüğü (RR), Horncrest Vakfı (RR), JDRF () bir kariyer geliştirme Ödülü için bir kariyer geliştirme Ödülü JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) ve DK114233 (JRM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps - Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals |
References
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
- Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Wubben, T. J., et al. Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration. Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).
- Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers. Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).
- Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging. Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).
- Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
- Winkler, B. S. Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function. The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).
- Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Pearsall, E. A., et al. PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival. BMC biology. 15 (1), 113 (2017).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of visualized experiments. (46), (2010).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Winkler, B. S. The electroretinogram of the isolated rat retina. Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).
- Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Du, J., et al. Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina. The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).
