Summary
Denna teknik beskriver realtid inspelning av syreförbrukning och extracellulära försurning priser i explanterad mus näthinnans vävnader med hjälp av en extracellulär flux analysator.
Abstract
Hög skärpa vision är en mycket energikrävande process och näthinnan har utvecklat flera unika anpassningar för att exakt uppfylla sådana krav bibehållen insyn i den visuella axeln. Störningar till denna ömtåliga jämvikt orsaka förblindande sjukdomar, såsom diabetesretinopati. Förståelsen av energi metabolism förändringar i näthinnan under sjukdom är därför absolut nödvändigt att utvecklingen av rationella terapier för olika skadeorsaker vison. Senaste tillkomsten av kommersiellt tillgängliga extracellulära flux analysatorer har gjort studien av retinal energiomsättningen mer tillgänglig. Det här protokollet beskriver användningen av sådan en analysator att mäta bidrag till retinal energiförsörjning genom sina två princip vapen - oxidativ fosforylering och glykolys - genom att kvantifiera förändringar i syre förbrukning (OCR) och extracellulära försurning priser (ECAR) som proxyservrar för dessa vägar. Denna teknik utförs lätt i explanterad retinala vävnaden, underlättar bedömning av Svaren till flera farmakologiska agenter i en enstaka experiment. Metaboliska signaturer i näthinnor från djur saknar rod ljusmätare signalering jämförs vildtyps-kontroller med denna metod. En stor begränsning i denna teknik är bristen på förmåga att diskriminera mellan ljus-anpassat och stjärnkartsschema energiutnyttjande, en viktig fysiologisk faktor i retinala vävnaden.
Introduction
Näthinnan är bland de mest energi-krävande vävnaderna i centrala nervsystemet1. Som de flesta vävnader genererar det adenosintrifosfat (ATP) via glykolys i den cytosol eller via oxidativ fosforyleringen i mitokondrier. Energisk fördelen av oxidativ fosforylering över glykolys att producera ATP från en molekyl av glukos är tydlig: 36 molekyler ATP genereras från den tidigare vs. 2 molekyler av ATP som genereras från den senare. Följaktligen, retinala nervceller är främst beroende av mitokondriell respiration för energiförsörjning och detta avspeglas i deras hög täthet av mitokondrier2. Ännu, näthinnan också starkt beroende glycolytic maskiner även när syre är riklig. Denna process av aerob glykolys ursprungligen beskrevs i cancerceller av Otto Warburg3, som en gång konstaterade att näthinnan var endast efter mitotiska vävnaden kan denna form av metabolism4. Sedan de inledande observationerna, har många efter mitotiska vävnader beskrivits för att engagera sig i varierande grad av glykolys förutom oxidativ fosforylering sin ATP-krav.
Phototransduction, visual pigment återvinning, biosyntesen av ljusmätare yttre segment och synaptisk aktivitet är alla energi krävande processer i fotoreceptorer, dominerande neuronala underklassen i näthinnan. Men behovet av att aktivt transportera joner mot deras elektriska och koncentration lutningar är överlägset mest energiskt tidskrävande processen i nervceller1. Fotoreceptorer är säregna nervceller i den meningen att de är Aricebo i avsaknad av stimulans (dvs. i mörkret), medan en ljus stimulans utlöser kanal stängning och efterföljande hyperpolarisering. Därför, i mörkret, näthinnan förbrukar stora mängder ATP att bibehålla dess depolarisation eller ”mörk ström” som det vanligen kallas. Från en adaptiv synvinkel är en stor utmaning i att leverera dessa enorma mängder ATP behovet av organismer att upprätthålla visuell tydlighet genom den optiska axeln. Inverterad retinal arkitekturen sett i moderna varelser är den dominerande lösningen, eftersom det håller tät välutbyggt nät levererar fotoreceptorer från vägen av ljus. Men detta underverk av naturliga bioengineering platser näthinnan vid en avgrund i form av metabolisk reserv. Även små förolämpningar mot näthinnan kan potentiellt störa den känsliga balansen i energiförsörjningen till efterfrågan och visuell dysfunktion eller frank blindhet kan uppstå snabbt.
Ges unika energisk krav av neurala näthinnan, tillsammans med dess snäva begränsningen av kärlen, kan exakt mätning av ATP förbrukningen i näthinnan och dess förändringar under sjukdomen få djupgående konsekvenser i förståelse och behandling av bländande villkor såsom retinitis pigmentosa och diabetesretinopati. Traditionellt har kräver dessa mätningar kostsamma, anpassade utformade utrustning med de flesta studier framväxande från en handfull laboratorier helt tillägnad mätningar av metabolisk aktivitet2,5,6, 7,8. Tekniker inkluderar enskilda analyser för specifika metaboliter, tracer studier med radioaktivt märkt prekursorer, syreförbrukning inspelning med Clark elektroder och metabolomiska profilering9.
Framstegen inom hög genomströmning teknik och ökad tillgänglighet till kommersiella enheter är tekniker till rekord retinal metabolism allt mer tillgängliga och ekonomiskt överkomliga. Den metod som beskrivs här mäter både oxidativ fosforylering och glykolys i näthinnan med explanterad vävnad och ett kommersiellt tillgängliga extracellulära flux analyzer9,10,11,12. Denna analysator registreras separat syre förbrukning (OCR) och den extracellulära försurning skattesats (ECAR), som serverar som indirekta indikatorer på oxidativ fosforylering och glykolys, respektive13. Dessa mätningar görs av en sond dränka inom en microchamber som skapade över vävnaden av intresse. Denna anpassning av tidigare publicerade metoder använder en capture tallrik ursprungligen för bukspottkörtelns Langerhanska öar för att registrera metabolisk aktivitet i små, cirkulära sektioner av mus näthinnan. Flera farmakologiska exponeringar kan levereras till vävnaden under loppet av en enda inspelning eftersom systemet innehåller 4 injektion portar för varje prov väl. Med detta system med separata protokoll optimerad för ECAR och OCR-inspelningar, svaren från vildtyp näthinnor kan jämföras näthinnor saknar transducin (Gnat1- / -), en orsak till medfödd stationära nattblindhet i människor14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokoll följt förbundet för forskning i Vision och oftalmologi uttalande om användning av djur och godkändes av Washington University.
1. animaliskt förberedelse
- Hålla djur boendestandard med en 12 timmar mörkt till 12 timmar ljus cykel. BEGIN experiment på standardiserade tiden för att undvika dygnsrytm effekter, vanligtvis på morgonen strax efter tänds.
2. lösning förberedelse
- Förbered bas genom upplösning 8,4 mg pulveriserad media i dubbeldestillerat H2O (ddH2O) och justera pH till 7,4 med HCl eller NaOH, till en slutlig volym av 1 L. Filter sterilisera denna lösning med ett filter med 0,22 µm i vävnadskultur.
- Tillsätt 1 M glukos och 100 mM natrium pyruvat till media att uppnå slutliga koncentrationer av 5 mM glukos och 1 mM pyruvat.
- Plats en 50 mL alikvot av base media i 37 ° C vattenbad.
- Förbereda lysis lösning, för vävnad kvantitering slutet av flux analys, genom att lägga till tris base till 10 mM, polyetylenglykol tert-octylphenyl eter att 0,2% (v/v) och EDTA till 1 mM, allt i ddH2O. blanda tills alla komponenter helt upplöst och justera pH till 8.0.
- För protokollet mitokondriell stress, förbereda ett 11 µM lager av oligomycin, ATP-syntas hämmare, upplöst i base media att rikta en slutlig koncentration på 1 µM i brunnen. Förbereda en 11 µM lager av karbonyl cyanid - 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), en uncoupling agent, upplöst i base media att rikta en slutlig koncentration på 1 µM i brunnen. Förbereda en cocktail av elektrontransport kedja hämmare, Rotenon och antimycin A (RAA) genom att lägga till Rotenon 11 µM och antimycin A 22 µm, upplöst i base media att rikta en slutlig koncentration på 1 µM Rotenon och 2 µM antimycin A i den väl.
- För protokollet glykolys, förbereda ett 220 mM lager av glukos upplöst i base media, att rikta en slutlig koncentration på 20 mM i brunnen. Också förbereda ett 1,1 M lager av 2-deoxyglucose (2-DG), en kompetitiv hämmare av glukos och glycolytic antagonist, genom att lösa upp det i base media. Detta kommer att rikta en slutlig koncentration på 100 mM 2-GD i brunnen.
3. instrumentkalibrering
- För att kalibrera instrumenteringen för en extracellulär flux assay, tillsätt 1 mL av kalibreringslösningen till varje brunn av sensorn patronen (24 brunnar totalt) och inkubera vid 37 ° C i en CO2-gratis inkubator över natten (eller åtminstone 8 h).
- Läsa in tillsatser för mitokondriell stress protokollet eller protokollet glykolys i varje injektor hamn, A till D, på sensorn kassetten, justering för volymförändringar i brunnen.
Obs: Exempelvis skulle en typisk analys inkluderar 45 µL av en tillsats i första injektor porten, 49,5 µL in i andra, 54,5 µL till den tredje, och 60 µL till sist, förutsatt att en inledande väl volym av 450 µL. - Under de första flera experiment, Fyll bas i port A att mäta hur mycket vävnad rörelse/artefakt inträffar efter en port injektion.
- Låt den inlästa sensorplatta Inkubera vid 37 ° C i en icke-CO2 inkubator för minst 60 min.
4. isolering av färska musen retinala vävnaden
Obs: Detta steg är anpassade från tekniken att Dr Barry Winkler15.
- Efter administrering av djup anestesi med hjälp av en standard ketamin/xylazin cocktail, eutanasi möss av cervikal dislokation.
- Använd ett par medelstora böjd pincett att förstå bakre världen på synnerven och Applicera försiktigt framåt tryck till proptose ögat (figur 1A).
- Med en ren rakblad, skapa en limbus till limbus snitt över hornhinnan med en enda, avsiktlig pass på bladet.
- Vinklade McPherson-stil tången, med böter, och nyp i bakre världen att uttrycka linsen och främre hyaloid membran av hornhinnan snitt. Kassera dessa vävnader.
- Upprepa klämmande manövern med pincett att uttrycka neurala näthinnan.
- Med hjälp av tången som en sked att lyfta näthinnan, snarare än att förstå vävnaden, överföra näthinnan från hornhinnan snitt och placera direkt i varma media i en 3 cm skålen eller en 6-väl vävnadsodling kluster tallrik.
- Använda två par fina, vinklade McPherson-stil pincett för att dissekera försiktigt återstående glaskroppen från näthinnan. Detta sker bäst genom att greppa glaskroppen på peripheryen av retinal koppen och dra mot centrum, med en sista disinsertion av glaskroppen från stadens som helhet. Med tången, ta bort eventuella kvarvarande pigmentepitelet ljusmätare ytan av näthinnan.
- Skär ett P1000 Pipettera tips med ett rakblad till skapa en ~ 4 mm öppning för att förhindra onödigt trauma till delikat retinala vävnaden under överföring manövrar.
- Över isolerade retinala vävnaden till färska media med en skära P1000 Pipettera spets.
- Skär 1 mm slag av näthinnan runt synnerven med en 1 mm biopsi punch utrustad med en kolv att rubba vävnaden i fall det blir inkom hål (figur 1B). Ange de retinala slag undan i ren medier hålls på en 37 ° C block eller värmedyna.
5. test protokoll
- Överföra enskilda slag till en 24-väl holme fånga mikroplattan använder ett skär P1000 tips, aspirera 450 µL av media tillsammans med vävnaden.
- Använd bra, raka pincetten för att försiktigt manipulera stansar in i centrera av mikroplattan. Hålla slag orienterade i samma riktning (t.ex., ganglion cell sida uppåt).
- Vila fånga plattan på en värmedyna eller värme block set till 37 ° C som dessa steg upprepas för de återstående proverna.
Obs: För varje experiment, avsätta 3-4 tomma brunnar med 450 µL av base media att fungera som negativa kontroller. I de återstående 20-21 brunnar, testa varje biologiska replikat i tre exemplar. Därför, varje 24-well platta möjliggör inspelning från 6-7 olika djur eller behandling villkor.
- Vila fånga plattan på en värmedyna eller värme block set till 37 ° C som dessa steg upprepas för de återstående proverna.
- Att undvika luftbubblor, försiktigt ställning Holmen fånga nätisättningar till varje brunn med hjälp av pincetten och säkra skären med en metall kolven eller med ett skär P1000 Pipettera tips (figur 1 C).
Obs: Undvik överdriven vävnad rörelse under detta steg att upprätthålla retinal punch ställning i centrum i det provet microchamber. Luftbubblor snedvrida allvarligt OCR avläsningar. Trots att microchamber har tillräcklig djup att rymma typiska mus näthinnan (figur 1 c), orsaka ibland bearbetning-defekter i nätisättningar vävnader till bli alltför komprimerad under skärmen införande. Om detta händer, gör en anteckning av krossade vävnad och utesluta att prov från den slutliga analysen. - Inkubera vävnad plattan i en 37 ° C CO2-gratis inkubator för minst 60 min.
- Programmera den extracellulära flux analyzer använder Mix, vänta, åtgärd och upprepa kommandon. Som ett exempel, en typisk experiment med retinala vävnaden kan inkludera följande: blanda 2 minuter, vänta 2 minuter och mäta 5 minuter. Upprepa experimentet med dessa tre steg mellan 5 - 8 gånger (cykler) för en baslinje inspelning och efter injektion av varje förening testas under körning.
- Tryck på knappen program START på extracellulära flux analysatorn och följ instruktionerna på skärmen för att tonerkassetten sensor för kalibrering.
- I slutet av kalibrering, följ instruktionerna på skärmen för att ersätta standard plattan med plattan de retinala proverna som innehåller.
- Tillåta programmet att köras som programmeras. Vid slutförandet av körningen, följ instruktionerna på skärmen för att mata ut vävnad plattan. Visa resultaten av körningen och lagra filen.
- Med en böjd 20 gauge nål och tång, ta bort alla nätisättningar från brunnarna, efterlämnade den retinala punschen.
- Noggrant sug ut media från vävnaden och tvätta vävnaden två gånger med 0,5 mL kall fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Aspirera PBS efter tvätt.
- Tillsätt 100 µL lyseringsbuffert till varje brunn och Pipettera upp och ner för att homogenisera vävnad.
- Kvantifiera Indatanivåer baserat på totala dubbelsträngat DNA (dsDNA) eller totalt proteininnehåll.
Obs: Följande är baserad på en kommersiellt tillgänglig dsDNA-analysen. - Späd lyserat prover 1:1 genom att tillsätta 100 µL av Tris-EDTA (TE) buffert och överföra 100 µL av det utspädda provet till en 96 väl platta.
- Tillsätt 100 µL av upptäckt buffert i varje brunn. Efter blandning för 2-5 minuter, kvantifiera fluorescens efter excitation vid 480 nm och utsläpp på 520 nm, att jämföra med en standardkurva.
- Normalisera raw extracellulära flux spårning till DNA innehållet i brunnen.
Obs: I de resultat som presenteras här, är prover normaliserad till 50 ng dsDNA - en typisk mängd i en 1 mm retinal punch. Absoluta värden presenteras här kan därför jämföras studier presentera data ”per retinal punch”. Normalisera tracings till intern standard, som baslinjen springa vid en koncentration av glukos 5 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Retinal bladsticklingar från 8 veckor gamla vildtyp (WT) möss jämfördes med de beskrivna tekniker (sammanfattas i figur 1), och bakgrunden-åldersmatchade transducin null möss (Gnat1- / -). Eftersom Gnat1- / - djur saknar maskinen att stänga cykliska-nukleotid gated jonkanaler som svar på ljus stimuli, sin rod fotoreceptorer förblir Aricebo även i ljus14. Den efterföljande behöva upprätthålla kalium efflux skulle skapa en stor efterfrågan på ATP, vilket resulterar i bioenergetiska stam. För att avgöra om sådana förskjutningar i energibehov skulle öka oxidativ fosforylering eller glycolytic flux, jämfördes vävnader från vildtyp möss och Gnat1- / - möss med hjälp av extracellulära flux analyzer. Vid baslinjen, i närvaro av 5 mM glukos och 1 mM pyruvat, har näthinnans vävnader från vilda djur liknande syra efflux jämfört med Gnat1- / - mutanter. Liknande mönster ses efter tillsats av 20 mM glukos och den glycolytic hämmare 2-DG (figur 2A). Dessa data kan också omvandlas matematiskt för att representera fraktionerad förändringar från baslinjen (figur 2B), ett format som kan tillåta för bättre jämförelse mellan olika experimentella interventioner.
Absoluta OCR vid baslinjen är likvärdiga mellan WT och muterade retinala vävnaden (figur 3A). Tillägg av 20 mM glukos ökar mitokondriernas respiration, men ingen förändring observeras mellan grupperna vad gäller absolut kvantifiering eller i termer av förändring från baslinjen (figur 3B). Tillägg av 1mM FCCP (en uncoupling agent) att Visa maximal mitokondriell andningsfrekvens ökar inte avsevärt OCR över den nivå som sett med hög glukos i WT eller Gnat1- / - vävnader. Dock sjunka signaler från både möss drastiskt efter tillsats av RAA cocktail.
Helst, köra extracellulära flux experiment i närvaro av ATP-syntas hämmare oligomycin stödet att identifiera källor till proton läcka, inträffar när rörelse genom elektron transportkedjan inte är associerad med ATP produktionen16. I näthinnans bladsticklingar från 8 veckor gamla C57BL/6J möss sänker oligomycin behandling kraftfullt OCR, som beräknade (figur 4). Men efterföljande tillägg av FCCP, att hitta maximal OCR, ökar bara nominellt OCR till ca 60% av utgångsvärdet, överensstämmer med en tidigare studie11.
XF24 analysatorn använder dränkbara sonder som gör en tät förslutning inom vävnad brunnen, skapa en övergående närmiljön för mätning av syre och sura flux. Positionering av retinala vävnaden i väl plattan (i förhållande till sensorerna) kan potentiellt påverka OCR inspelningar, och leda till oönskade confounders och vissa forskare har förespråkat att placera näthinnevävnad direkt under syresensorn mot den ljusmätare yttre segment orienterade mot sensorn11. För att testa effekterna av näthinnevävnad position på OCR mätningar, vävnader från unga C57BL/6J möss (8 veckor gamla) analyserades i två riktningar: retinala ganglionceller nedåt på plattan (dvs fotoreceptorer placerad i upprätt läge närmast till sensor ) eller uppåt mot sensorn. Det observerades inga skillnader i relativ OCR som svar på FCCP eller RAA, som visar likvärdig känslighet för maximal och minimal mitokondriell andningsfrekvens i endera riktning (figur 5A). Dessutom var absolut OCR mätningar också motsvarande mellan näthinnans vävnader i endera riktning (figur 5B).
Figur 1 : Isolering av retinal explant och setup i extracellulär flux analyzer. A. isolering av neural retina i situ av tillämpningen framåtdrivande kraft på Globen med pincett, öppning av hornhinnan och borttagning av näthinnan efter kasta linsen och främre hyaloid membran. B. förbehandling av vävnad för flux inspelning med retinal punch skapelse, placering av enskilda slag i holme fånga mikroplattan och användning av en mesh infoga att minimera vävnad rörelse med microchambers (skala barer = 1 mm). C. en schematisk, härrör från tillverkaren-förutsatt data, visar förfarandet dispositionen och visar att höjden av microchamber är tillräcklig för att rymma murina näthinnan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Mitokondriell stressanalys använder explanterad näthinnan från 8 veckor gamla djur. A. i genomsnitt tracings med standardfel för mätning (SEM), normaliserade till DNA-innehåll av vävnad, från ett experiment som optimerats för syre förbrukning inspelningar, jämföra transducin knockout djur (Gnat1- / -) vildtyp kontroller. B. samma experiment med data omvandlas så att baslinjen inspelningar anges som referens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Analys av glycolytic med hjälp explanterad näthinnan från 8 - veckor gamla djur. A. Averaged, DNA innehåll-normaliserade, tracings från ett experiment som optimerats för syra efflux inspelningar jämföra transducin knockout djur (Gnat1- / -) till vildtyp kontroller. B. Data från samma experiment normaliserat till baslinjen inspelningar. Spår visar medelvärde ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Irreversibla effekter av oligomycin på retinal andningsfrekvenser. I akut beredda retinal bladsticklingar från 8 veckor gamla C57BL/6J möss minskar oligomycin behandling den maximala OCR som induceras av efterföljande tillägg av FCCP. Spår visar medelvärde ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 : Effekter av vävnad positionering på OCR mätning. Näthinnans vävnader från 8 veckor gamla C57BL/6J möss placerades i brunnar med ganglionceller vänd mot sensorn (Ganglion celler upp) eller bort från sensorn (Ganglion celler nedåt). Mellan grupperna, liknande extracellulära flux inspelningar observeras avseende på (A) respiratoriska kapacitet i förhållande till baslinjen eller (B) när det gäller absolut kvantifiering. Spår visar medelvärde ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OCR och ECAR mäts lätt i explanterad retinala vävnaden med hjälp av en bioanalyzer med de beskrivna teknikerna. Denna metod avviker från dem i andra grupper i flera kritiska steg. Näthinnans vävnader isoleras genom en stor hornhinnan snitt utan enucleating i världen, som ursprungligen beskrevs av Winkler15. Denna metod av retinal isolering möjliggör en snabb överföring från levande ögat i vävnad fånga plattan (ofta inom 5 minuter). Vävnaderna hålls vid 37 ° C under hela den process som bevarar cellandningen bättre än när de placeras på is. Media med minimala tillsatser används för inledande mätningar, utelämna någon buffert agenter som HEPES eller natriumbikarbonat, serum eller överflödigt makronäringsämnen, eftersom detta möjliggör mer tillförlitliga mätningar av basal energiomsättning och hämmar inte bedömning av ECAR. Retinal slag registreras bäst i ett 24-väl format i stället för 96-brunnar, att minimera trauma till vävnaden. Näthinnevävnad placeras i mitten av brunnen, inom den vävnad microchamber, och säkrat med en insats i mesh. Gör så möjliggör noggrann registrering av ECAR och OCR, samtidigt förhindra överdriven vävnad rörelse under körningen, och eliminerar behovet av andra reagens såsom lim. Ett fordon injektion under körning rekommenderas, speciellt när du ställer in inspelning experiment för första gången, eftersom detta kommer att ge en känsla av hur väl vävnaden är säkrade inom fånga plattan. OCR inspelningar med denna teknik är oberoende av retinal orientering i brunnen, men orientering måste hållas konsekvent mellan prover inom experiment. Alla mätningar görs endast efter retinal metabolism har nått steady state efter injektion av test föreningar.
Det här protokollet beskriver normalisering av data till totala DNA-innehåll, som en proxy för mobilnummer. Sådan teknik är fördelaktigt eftersom det tar hänsyn till ändringar i cell nummer drivs av variation i retinal tjocklek, punch storlek eller skillnader i cellularitet mellan genetiskt olika prover. Total protein-baserade normalisering är också en tillförlitlig metod, och har fördelen av att minimera skillnader i totala mitokondriemassa mellan näthinnans prover. Dock kan normalisering baserat på proteinhalten i hela vävnad blandas ihop av förändringar i extracellulär matrix mellan prover. Normalisering av flux inspelningar till baslinjen, är som visas i de representativa resultat, fördelaktigt eftersom det minimerar variationen i näthinnans punch storlek mellan replikat och enkelt möjliggör tolkning av förändringar på grund av farmakologiska interventioner. Rapportering av rå värden tillåter dock för bättre jämförelse mellan olika experiment och experiment som utförs med olika flux inspelning metoder.
Resultat med hjälp av dessa tekniker är jämförbara med de rapporterade någon annanstans. Även om oligomycin - en ATP-syntas hämmare - är vanligtvis används för att mäta proton läcka inom vävnader eller celler av intresse, har denna förening ogynnsamma effekter på retinal metabolism. I de experiment som redovisas här, en 60-procentig minskning maximal retinal OCR framkallas av FCCP observeras efter exponering för oligomycin (figur 4), nästan identisk med en tidigare studie11. En potentiell förklaring till denna slutsats är irreversibla skador eller modifiering av retinal mitokondrier genom ATP synthase hämning. Dessutom som Kooragayala och kollegor först rapporterade11, retinal mitokondrierna är sannolikt verksamt vid nära maximal priser under basala förhållanden sedan elektrontransport kedja uncoupling agent, ökar FCCP, bara OCR med ca 15% (figur 3 , Figur 5).
Extracellulära flux inspelningar i explanterad näthinnans vävnader visar en stor reserv glycolytic kapacitet, eftersom tillägg av 20 mM glukos framkallar en två-faldig ökning ECAR (figur 2). Eftersom oligomycin, vanligen används för att mäta maximal glycolytic kapacitet, har skadliga effekter i näthinnevävnad (figur 4), kan användning av hög glukos tillägg till inspelningen tjäna som bättre proxy att mäta glycolytic reserv i näthinnan. Ett viktigt förbehåll som förhindrar användning av ECAR som en ren proxy för glycolytic rate är att CO2 befriades av citronsyracykeln kan vara en betydande källa till syra i odlade vävnad17. Överskjutande pyruvat ökar inte ECAR över de nivåer som framkallas av hög glukos och glycolytic flux elimineras nästan i näthinnans bladsticklingar med överskott molar förhållandet 2-GD (figur 2). Eftersom ATP används för att regenerera membranpotentialen uppstår från depolarisation händelser i stjärnkartsschema näthinnan, förväntas djur saknar transducin förbruka mer energi än WT motsvarigheter. Dock i bladsticklingar sågs skillnader i näthinnans energiomsättning mellan Gnat1- /- och kontroller ej i de experiment som beskrivs här (figur 2 och 3). Dessa resultat överensstämmer med dem som erhålls med hjälp av en anpassad perfusion apparatur för att mäta OCR i Gnat1- / - djur18. Särskilt anpassade apparaten används av Du och kollegor tillåtna för mätning av OCR ljus-anpassat och mörka anpassade villkor. På så sätt en liten men signifikant minskning OCR efter ljusexponering upptäcks i vildtyp näthinnor, men inte i Gnat1- / - näthinnor18. Detta illustrerar en betydande begränsning av den nuvarande tekniken mäta ECAR och OCR i explanterad näthinnor - den extracellulära flux analyzer används här förlitar sig på synliga ljus excitation av fluorophores inbäddade i dess syre och pH sensorer, vilket eliminerar den möjlighet att utföra mätningar i stjärnkartsschema vävnader. Sådana mätningar är högrelevant för visuell fysiologi och kommer fortfarande att kräva användning av äldre metoder som är avsedda uteslutande för studien av retinal metabolism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Alexander Kolesnikov och Dr. Vladimir Kefalov för att ge Gnat1- / -möss, för bra feedback och råd och läsa manuskriptet.
Detta arbete fick stöd av NIH EY025269 (RR), Diabetes Research Center vid Washington University - NIH DK020579 (JRM och RR), en karriär Development Award från forskning till förhindra blindhet (RR), Horncrest Foundation (RR), en karriär Development Award från JDRF ( JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) och DK114233 (JRM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps - Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals |
References
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
- Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Wubben, T. J., et al. Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration. Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).
- Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers. Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).
- Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging. Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).
- Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
- Winkler, B. S. Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function. The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).
- Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Pearsall, E. A., et al. PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival. BMC biology. 15 (1), 113 (2017).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of visualized experiments. (46), (2010).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Winkler, B. S. The electroretinogram of the isolated rat retina. Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).
- Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Du, J., et al. Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina. The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).
