Summary
טכניקה זו מתארת הקלטה בזמן אמת של צריכת החמצן ואת המחירים acidification חוץ-תאית ברקמות רשתית העכבר explanted באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית.
Abstract
חזון חדות גבוהה היא תהליך בכבדות הצורכים אנרגיה, הרשתית פיתחה מספר עיבודים ייחודיים לדרישות בדיוק כזה תוך שמירה על שקיפות של הציר חזותי. לפליטת כדי איזון עדין זה לגרום מחלות מסנוור, כגון רטינופתיה סוכרתית. לכן, ההבנה של האנרגיה חילוף החומרים משתנה ברשתית במהלך המחלה הכרחי להתפתחות של טיפולים רציונלי עבור גורמים שונים של אובדן vison. הופעתו האחרונה של מנתחי השטף חוץ-תאית זמין מסחרית הפך המחקר של חילוף החומרים האנרגיה ברשתית נגיש יותר. פרוטוקול זה מתאר את השימוש כזה מנתח כדי למדוד את התרומות לאספקת אנרגיה ברשתית באמצעות זרועותיה עיקרון שני - זרחון חמצוני, גליקוליזה - מאת לכימות שינויים בשערי צריכת חמצן (OCR), חוץ-תאית המחירים acidification (ECAR) כאל שליחים עבור המסלולים הללו. טכניקה זו מבוצעת בקלות ברקמת הרשתית explanted, הקלה על הערכה של התגובות מרובות סוכנים תרופתי בניסוי יחיד. חתימות מטבולית הרשתיות מחיות חסר רוד קולט אור איתות מושווים לפקדים פראי-סוג בשיטה זו. מגבלה משמעותית בטכניקה זו הוא חוסר היכולת להבחין בין ניצול האנרגיה הותאם-אור, dark-adapted, שיקול חשוב הפיזיולוגיות ברקמת הרשתית.
Introduction
הרשתית היא בין הרקמות ביותר דורש אנרגיה מערכת העצבים המרכזית1. כמו רוב רקמות, שהיא מייצרת אדנוזין טריפוספט (ATP) דרך גליקוליזה ב זרחון חמצוני ציטוזול או דרך בתוך המיטוכונדריה. היתרון האנרגטי של זרחון חמצוני על גליקוליזה לייצר ATP ממולקולה אחת של גלוקוז נקי: 36 מולקולות של ATP שנוצר מתוך לשעבר לעומת 2 מולקולות של ATP שנוצר האחרון. בהתאם לכך, הנוירונים ברשתית תלויים בעיקר נשימה מיטוכונדריאלי לאספקת אנרגיה, זה משתקף על ידי שלהם צפיפות גבוהה של המיטוכונדריה2. ובכל זאת, הרשתית גם מסתמכת במידה רבה על מכונות glycolytic גם כאשר חמצן בשפע. תהליך זה של אירובי גליקוליזה תוארה לראשונה על ידי אוטו ורבורג3, מי פעם ציין, כי הרשתית הרקמה רק שלאחר mitotic מסוגל צורה זו של חילוף החומרים4בתאים סרטניים. מאז תצפיות ראשוניות אלה, ברקמות רבות שלאחר mitotic תוארו לעסוק בדרגות שונות של גליקוליזה בנוסף זרחון חמצוני כדי לענות על דרישותיהם ATP.
Phototransduction, פיגמנט חזותי מיחזור, ביוסינטזה של מקטעי החיצוני קולט אור, בפעילות הסינפטית הם כל התהליכים תובעניים אנרגיה photoreceptors, מחלקת המשנה השולט עצביים ברשתית. אך הצורך להעביר באופן פעיל יונים נגד שלהם חשמל ומעברי הריכוז הוא עד כה התהליך לארוך ביותר אנרגטית נוירונים1. Photoreceptors הם נוירונים מוזר במובן שהם אינם depolarized בהיעדר גירוי (קרי, בחושך), ואילו גירוי אור מפעילה ערוץ הסגר, hyperpolarization הבאים. לכן, בחושך, הרשתית צורכת כמויות גדולות של ATP כדי לשמור על דפולריזציה או "זרם אפל" שלה, כפי שהיא מכונה בדרך כלל. מההיבט אדפטיבית, הוא אתגר גדול באספקת אלה כמויות אדירות של ATP עבור אורגניזמים לשמור על בהירות חזותית באמצעות לציר האופטי. הארכיטקטורה ברשתית הפוך אצל יצורים מודרני הוא הפתרון דומיננטי, כמו זה שומרת את הרשת נימי צפופה הספקת photoreceptors לברוח מדרכו של אור. . אבל זה מעורר פליאה bioengineering טבעי מקומות הרשתית צוק במונחים של שמורת מטבולית. עלבונות קטן אפילו לרשתית פוטנציאלי יכול לשבש את האיזון העדין של אספקת אנרגיה לדרוש, תפקוד חזותי או עיוורון פרנק עשוי לנבוע במהירות.
בהתחשב הדרישות האנרגטי הייחודי של הרשתית עצבית, בשילוב עם הגבלה חזק של אספקת הדם, מדידה מדויקת של צריכת ATP הרשתית ואת שלו משתנה במהלך המחלה עשויות להיות השלכות עמוקה תוך הבנה וטיפול מעלף מצבים כגון רטיניטיס פיגמנטוזה רטינופתיה סוכרתית. באופן מסורתי, מדידות אלה דורשים ציוד יקר, אישית מעוצבת עם רוב המחקרים מתוך קומץ של מעבדות שכולו מוקדש מדידות של פעילות חילוף החומרים2,5,6, 7,8. טכניקות כוללים מבחני בודדים של המטבוליטים ספציפיים, מחקרים מעקב באמצעות התווית על-ידי רדיו סימנים מקדימים, צריכת חמצן הקלטה באמצעות אלקטרודות קלארק, ו metabolomic פרופיל9.
עם ההתקדמות בטכנולוגיית תפוקה גבוהה וזמינות מוגברת של התקנים מסחריים, טכניקות כדי הרשומה מטבוליזם ברשתית הם יותר ויותר נגיש וזול. השיטה המתוארת כאן מודד בשני זרחון חמצוני, גליקוליזה רשתית העין באמצעות explanted רקמות ו זמין מסחרית השטף חוץ-תאית מנתח9,10,11,12. זה מנתח מתעדת בנפרד קצב צריכת החמצן (OCR), שער חוץ-תאית acidification (ECAR), הגשה אינדיקטורים עקיף של זרחון חמצוני, גליקוליזה, בהתאמה13. מדידות אלה נעשית על ידי בדיקה submersed במרחק microchamber שנוצרו על הרקמה של ריבית. זה עיבוד של שיטות שפורסמו בעבר משתמש צלחת לכידת תוכנן במקור עבור לנגרהנס בלבלב כדי להקליט את פעילות חילוף החומרים בסעיפים קטנים, עגולים של רשתית העכבר. חשיפות מרובות תרופתי יכול להיות מועברת הרקמה במהלך הקלטה יחיד כי המערכת מכילה 4 יציאות הזרקת עבור כל דגימה. טוב. באמצעות מערכת זו עם פרוטוקולים נפרד אופטימיזציה עבור הקלטות ECAR, OCR, התגובות של פראי-סוג באדמומיות ניתן להשוות הרשתיות חסר transducin (Gnat1- / -), סיבת עיוורון לילה נייח מולדות ב בני14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקולים עקב האגודה לחקר חזון והצהרת רפואת עיניים עבור שימוש של בעלי החיים ואושרו על-ידי אוניברסיטת וושינגטון.
1. הכנה בעלי חיים
- לשמור חיות בדיור סטנדרטי עם 12 שעות כהה מחזור אור 12 שעות. בגין ניסויים ב סטנדרטית פעמים כדי למנוע תופעות היממה, בדרך כלל בבוקר זמן קצר לאחר אורות דולקים.
2. פתרון הכנה
- להכין בסיס מדיה על ידי המסת 8.4 מ ג של אבקת מדיה מזוקק פעמיים H2O (ddH2O) להתאים את ה-pH ל 7.4 עם HCl או NaOH, לאמצעי אחסון הסופי של 1 ל' מסנן לחטא זה פתרון עם מסנן תרביות רקמה 0.22 מיקרומטר.
- מוסיפים גלוקוז 1 מ' ו- 100 מ מ פירובט נתרן בכלי התקשורת כדי להשיג הסופי ריכוזי גלוקוז 5 מ מ 1 מ"מ פירובט.
- המקום aliquot 50 מ של אמצעי התקשורת הבסיס באמבט מים 37 º C.
- להתכונן פירוק פתרון, רקמות כימות בסוף הניתוח השטף, על-ידי הוספת טריס בסיס 10 מ מ, פוליאתילן גליקול טרט-octylphenyl אתר 0.2% (v/v), EDTA עד 1 מ"מ, כל ddH2O. לערבב עד שכל הרכיבים התפרקה לחלוטין, להתאים ה-pH ל 8.0.
- עבור פרוטוקול מתח מיטוכונדריאלי, להכין מלאי של מיקרומטר 11 של oligomycin, מעכב ATP סינתאז, מומס בסיס מדיה למטרה הסופית ריכוז 1 מיקרומטר בבאר. להכין מלאי של מיקרומטר 11 של ציאניד קרבוניל - 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), סוכן uncoupling, מומס בסיס מדיה למטרה הסופית ריכוז 1 מיקרומטר בבאר. להכין קוקטייל של מעכבי שרשרת האלקטרונים תחבורה, rotenone antimycin A (ראה) על-ידי הוספת rotenone 11 מיקרומטר, antimycin א 22 מיקרומטר, מומס מדיה בסיס היעד הסופי ריכוז rotenone מיקרומטר 1 ו- 2 מיקרומטר antimycin א ב טוב.
- עבור פרוטוקול גליקוליזה, להכין מלאי 220 מ מ של גלוקוז מומס מדיה הבסיס, כדי להתמקד ריכוז סופי של 20 מ מ בתוך הבאר. גם להכין מלאי 1.1 מ' של 2-deoxyglucose (2-DG), מעכב תחרותי של גלוקוז, אנטגוניסט glycolytic, על ידי המסת זה בתקשורת הבסיס. זה יעד ריכוז סופי של 100 מ מ 2-DG בבאר.
3. מכשיר כיול
- כדי לכייל את ומכשור וזמינותו השטף חוץ-תאית, להוסיף 1 מ"ל של כיול פתרון כל טוב של המחסנית חיישן (סה כ 24 בארות), דגירה ב 37 ° C ב- CO2-חינם חממה לילה (או לפחות 8 שעות).
- לטעון תוספים עבור פרוטוקול מיטוכונדריאלי מתח או בפרוטוקול גליקוליזה ליציאת כל מזרק, A עד D, שעל מחסנית חיישן, התאמת נפח שינויים בתוך הבאר.
הערה: לדוגמה, יכלול assay טיפוסי 45 µL של תוסף ליציאת ה-מזרק הראשון, µL 49.5 לתוך השני, µL 54.5 לתוך µL השלישי, 60 לתוך האחרון, בהנחה אמצעי טוב הראשונית של 450 µL. - במהלך הניסויים מספר הראשון, לטעון מדיה בסיס ליציאה A לאמוד כמה רקמות תנועה/החפץ מתרחשת לאחר זריקה יציאה.
- לאפשר את הצלחת חיישן טעון על דגירה-37 מעלות צלזיוס חממה-CO2 לפחות 60 דקות.
4. בידוד של רקמת רשתית העכבר טרי
הערה: השלב זה ממאמרו של הטכניקה של ד ר בארי ווינקלר15.
- לאחר ניהול הרדמה עמוקה באמצעות קוקטייל קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים סטנדרטי, המתת חסד עכברים מאת נקע בצוואר הרחם.
- השתמש זוג מלקחיים מעוקל בגודל בינוני תופסים את העולם האחורי על עצב הראייה, בעדינות קדימה אל תפעילו לחץ על proptose העין (איור 1 א').
- עם סכין גילוח נקי, ליצור חתך לימבוס כדי לימבוס על פני הקרנית באמצעות כרטיס יחיד, מכוונת של הלהב.
- שימוש בסדר, מלקחיים מקפירסון בסגנון זוויתי, צבוט הגלובוס האחורי כדי לבטא את העדשה וממברנות הקדמי hyaloid מתוך החתך הקרנית. להתעלם רקמות אלו.
- חזור על התמרון צובט עם מלקחיים לבטא עצביים ברשתית.
- עם המלקחיים כמו כפית כדי להרים את הרשתית, במקום להבין את הרקמה, העברת הרשתית מן החתך הקרנית ומניחים ישירות לתוך המדיה חמה תבשיל 3-ס"מ או צלחת אשכול 6-ובכן תרביות רקמה.
- השתמש שני זוגות של מלקחיים מקפירסון בסגנון בסדר, בזווית לנתח בעדינות הזגוגיות שנותרו מן הרשתית. זה נעשית על ידי האוחז את הזגוגיות בפריפריה של הגביע ברשתית ומושך לכיוון המרכז, עם disinsertion הסופית של הגוף בזגוגית מהמרכז בכללותה. עם המלקחיים, הסר כל אפיתל הפיגמנט ברשתית שיורית משטח קולט אור ברשתית.
- חותכים טיפ pipet P1000 עם סכין גילוח כדי ליצור פתח ~ 4 מ מ כדי למנוע טראומה מיותרת לרקמת הרשתית עדין במהלך העברת תמרונים.
- להעביר את רקמת רשתית מבודד טריים מדיה באמצעות טיפ pipet לחתוך P1000.
- חותכים 1 מ"מ האגרופים של הרשתית סביב עצב הראייה עם ביופסיה 1 מ"מ אגרוף מצויד עם פומפה מכך הרקמה, במקרה זה הופך ונתקע לתוך נשא (איור 1B). הגדר את האגרופים ברשתית הצידה בתקשורת נקייה כל הזמן על בלוק 37 ° C או חימום משטח.
5. assay פרוטוקול
- העברה אגרופים בודדים microplate לכידת 24-ובכן איון באמצעות טיפ P1000 לחתוך, כ רפה בעברית µL 450 של המדיה יחד עם הרקמה.
- השתמש בסדר, ישר מלקחיים בעדינות לתפעל אגרופים למרכז microplate. שמור אגרופים חוקיים באותו כיוון (למשל, תא גנגליון בצד כלפי מעלה).
- הנח את הצלחת הלכידה על כרית חימום או חימום בלוק מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס כפי שלבים אלה חוזרים על עצמם על הדגימות הנותרים.
הערה: עבור ניסוי, להפריש 3-4 בארות ריק עם 450 µL של בסיס מדיה כדי לשמש כפקדי שלילי. הנותרים 20-21 וולס, לבדוק כל שכפול וחיסונים דולר. לכן, כל צלחת 24-ובכן יאפשר עבור הקלטת של 6-7 בעלי חיים שונים או טיפול תנאים.
- הנח את הצלחת הלכידה על כרית חימום או חימום בלוק מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס כפי שלבים אלה חוזרים על עצמם על הדגימות הנותרים.
- הימנעות בועות אוויר, מיקום בעדינות איון ללכוד רשת מוסיף לתוך כל טוב באמצעות מלקחיים, לאבטח את הכיסויים עם פומפה מתכת, או עם טיפ pipet P1000 לחתוך (איור 1 C).
הערה: להימנע התנועה רקמות מופרז במהלך שלב זה כדי לשמור על מיקום הניקוב רשתית בתוך המרכז של microchamber הדגימה. בועות אוויר לעוות קשות OCR קריאות. למרות microchamber יש עומק מספיק כדי להכיל את עכבר אופייני רשתית (איור 1C), לעתים עיבוד שבבי-פגמים הכיסויים רשת עלול לגרום רקמות להיות דחוס מדי במהלך מסך הכניסה. אם זה קורה, פשוט רשום של הרקמה כתוש, אל תכלול הדגימה הניתוח הסופי. - דגירה לצלחת רקמות 37 ° C CO2-חממה חינם לפחות 60 דקות.
- תוכנית במנתח השטף חוץ-תאית באמצעות ערבוב, חכה. מידה, וחזור על פקודות. לדוגמה, ניסוי טיפוסי עם רקמת רשתית עשויים לכלול את הפריטים הבאים: מערבבים 2 דקות, להמתין 2 דקות, וכך למדוד 5 דקות. חזור על הניסוי עם שלושת השלבים בין 5 - 8 פעמים (מחזורים) לצורך הקלטה בסיסית, ואחרי הזרקה של כל המתחם נבדק במהלך הריצה.
- לחץ על לחצן התחל תוכנית במנתח השטף חוץ-תאית, בצע את ההוראות שעל המסך כדי הכנס את מיכל הדיו חיישן לכיול.
- בסוף הכיול, בצע את ההוראות שעל המסך כדי להחליף את הצלחת calibrant עם לוחית המכיל את הדגימות ברשתית.
- מאפשר לתוכנית לפעול, כפי מתוכנת. בסיום ההפעלה, בצע את ההוראות שעל המסך כדי להוציא את הצלחת רקמות. הצג את תוצאות המרוץ ולאחסן את קובץ הנתונים.
- עם מחט בקוטר 20 כפופות, מלקחיים, הסר מוסיף רשת כל הבארות, ומותיר את האגרוף ברשתית.
- בזהירות תשאף המדיה מן הרקמה ולשטוף את הרקמה פעמיים עם 0.5 מ ל תמיסת מלח קרות באגירה פוספט (PBS). האחות של PBS לאחר הרחצה.
- להוסיף 100 µL מאגר פירוק כל טוב, pipet למעלה ולמטה כדי homogenize רקמות.
- Quantitate רמות הקלט בהתבסס על סך כפול גדילי הדנ א (dsDNA) או תכולת החלבון הכולל.
הערה: להלן מבוססת על וזמינותו dsDNA זמינים מסחרית. - לדלל דגימות lysed 1:1 על-ידי הוספת µL 100 טריס-EDTA (TE) מאגר ולהעביר µL 100 המדגם מדולל צלחת טוב 96.
- להוסיף 100 µL מאגר זיהוי כל טוב. לאחר ערבוב 2-5 דקות, quantitate קרינה פלואורסצנטית לאחר עירור-480 ננומטר, פליטה-520 nm, השוואת לעקומה סטנדרטי.
- לנרמל את העקיבה raw השטף חוץ-תאי DNA תוכן בתוך הבאר.
הערה: בתוצאות המובאות כאן, דוגמאות הן מנורמל ל 50 ng dsDNA - כמות אופיינית באגרוף ברשתית 1 מ מ. לכן, הערכים המוחלטים המובאות כאן ניתן להשוות מחקרים בהצגת נתונים "לפי ברשתית פאנץ'". לנרמל לשרטוטים כדי תקן פנימי, כגון הבסיס להפעיל בכל ריכוז הגלוקוז של 5 מ מ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוך שימוש בטכניקות המתואר (מסוכם באיור1), explants ברשתית מ 8 בת שבוע פראי סוג (WT) עכברים היו לעומת גיל - ועל רקע-מתאימים transducin null עכברים (Gnat1- / -). כי Gnat1- / - בעלי חיים חסרי המכונות כדי לסגור מחזורית-נוקלאוטיד מגודרת תעלות יונים בתגובה לגירויים קלים, photoreceptors רוד שלהם להישאר depolarized גם ב קל14. עוקבות צריך לשמור על אשלגן בזרימת תיצור ביקוש גדול ATP, וכתוצאה מכך זן bioenergetic. כדי לקבוע אם כזה במאזן בדרישות האנרגיה יגדל זרחון חמצוני או שטף glycolytic, הושוו רקמות פראי סוג עכברים ועכברים Gnat1- / - שימוש במנתח השטף חוץ-תאית. בסיסית, בנוכחות גלוקוז 5 מ מ 1 מ"מ פירובט, רשתית רקמות חיות פראי-סוג יש שיעור דומה של חומצה בזרימת בהשוואה Gnat1- / - מוטציות. דפוסים דומים נראים לאחר תוספת של 20 מ מ גלוקוז glycolytic מעכב 2-ג'י (איור 2 א). נתונים אלה עשויים גם מבחינה מתמטית להיהפך לייצג את השינויים החלקי מקו (איור 2B), תבנית אשר עשוי לאפשר השוואה טובה יותר בין התערבויות שונות ניסיוני.
OCR מוחלט בנקודת ההתחלה שווה בין WT רקמת רשתית מוטציה (איור 3 א). התוספת של 20 מ מ גלוקוז מגביר נשימה מיטוכונדריאלי, אך אין שינוי הוא ציין בין הקבוצות מבחינת כימות מוחלט או במונחים של שינוי מקו (איור 3B). התוספת של 1 מ מ FCCP (סוכן uncoupling) להפגין מקסימלי המחירים הנשימה מיטוכונדריאלי לא להגדיל באופן משמעותי OCR מעל הרמה עם גלוקוז גבוה ברקמות WT או Gnat1- / . עם זאת, אותות שני העכברים ירידה באופן דרסטי לאחר התוספת של אטול ראה קוקטייל.
באופן אידיאלי, השטף חוץ-תאית ניסויים להפעיל בנוכחות סינתאז ATP מעכב oligomycin סיוע בזיהוי מקורות הנזילה פרוטון, המתרחשים בעת תנועה דרך שרשרת האלקטרונים התחבורה אינה משויכת ATP ייצור16. ב- explants ברשתית של עכברים C57BL/6J בת שבוע 8, oligomycin טיפול robustly מוריד OCR, כמו הצפוי (איור 4). אבל תוספת עוקבות של FCCP, כדי למצוא OCR מקסימלי, רק נומינלית מגדיל OCR בערך 60% של הבסיס, בקנה אחד עם מחקר קודם11.
במנתח XF24 משתמש הגששים מועמסת שהופכים חותם צר בתוך הבאר רקמה, יצירה של microenvironment ארעי למדידת חמצן, שטף חומצה. מיצוב של רקמת רשתית בצלחת טוב (בהקשר החיישנים) יכול שעלולים להשפיע על הקלטות OCR, להוביל confounders לא רצויים ואת כמה reserachers יש דגלו הצבת רקמת רשתית ישירות מתחת חיישן חמצן עם קולט אור מקטעי החיצוני בכיוון חיישן ה11. כדי לבדוק את ההשפעות של רקמת רשתית עמדה על המידות OCR, נותחו רקמות עכברים C57BL/6J צעירים (בן 8 שבועות) שני הכיוונים: תאי גנגליון כלפי מטה על צלחת (קרי, photoreceptors להציב זקוף קרוב חיישן ) או כלפי מעלה לכיוון החיישן. אין הבדל בין יחסי OCR בתגובה FCCP או אטול ראה נצפו, המציין שוות ערך רגישות מקסימלית וללא מינימלי המחירים הנשימה מיטוכונדריאלי בכיוון אחד (איור 5A). בנוסף, מדידות OCR מוחלטת היו גם המקבילה בין רקמות ברשתית או לרוחב (איור 5B).
איור 1 : בידוד של הרשתית explant וההתקנה לתוך במנתח השטף חוץ-תאית. א בידוד של ה עצבי הרשתית בחיי עיר על ידי הפעלת כוח-חליפת על הגלובוס עם מלקחיים, אם הקרנית הסרת הרשתית לאחר השמטת עדשה וממברנות hyaloid הקדמי. B. הכנה של רקמות השטף הקלטה עם היצירה ניקוב חורים ברשתית, מיקום של אגרופים בודדים לתוך איון לכידת microplate ושימוש הוספה רשת כדי למזער את רקמת תנועה עם microchambers (גודל ברים = 1 מ"מ). ג שרטוט, נגזר נתונים שסופקו על-ידי היצרן, מציג את קווי המתאר של ההליך, הוכחת גובה microchamber הוא מספיק כדי להכיל את הרשתית מאתר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : ניתוח מיטוכונדריאלי מתח באמצעות רשתית explanted מחיות בת שבוע 8. א בממוצע לשרטוטים עם שגיאת המדידה (SEM), מנורמל לתוכן ה-DNA של הרקמה, ניסוי אופטימיזציה עבור הקלטות צריכת חמצן, השוואת transducin ההסתרה חיות (Gnat1- / -) פראי סוג פקדים. B. אותו ניסוי עם נתונים טרנספורמציה כזאת בסיסית הקלטות מוגדרים בתור ההפניה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : ניתוח של קצב glycolytic באמצעות explanted רשתית מחיות 8 - בן שבועיים. א Averaged, ה-DNA תוכן-מנורמל, לשרטוטים ניסוי אופטימיזציה עבור הקלטות בזרימת חומצה השוואת transducin ההסתרה חיות (Gnat1- / -) לפקדים פראי סוג. B. נתונים מאותו הניסוי מנורמל להקלטות בסיסית. עקבות להראות זאת אומרת ± ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : תופעות בלתי הפיך של oligomycin על שיעורי הנשימה ברשתית. ב- explants ברשתית בחריפות מוכן של עכברים C57BL/6J בת שבוע 8, oligomycin טיפול מפחית OCR המקסימלי המושרה על ידי תוספת עוקבות של FCCP. עקבות להראות זאת אומרת ± ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : ההשפעות של רקמות מיצוב על מדידת OCR. ברשתית רקמות עכברים C57BL/6J בת שבוע 8 הונחו בבארות עם תאי גנגליון הפונה לכיוון החיישן (גנגליון תאים למעלה) או הרחק את החיישן (גנגליון תאים למטה). בין קבוצות, השטף חוץ-תאית דומה הקלטות הם נצפו במונחים של קיבולת מערכת הנשימה (A) יחסית בסיסית או (B) במונחים של כימות מוחלטת. עקבות להראות זאת אומרת ± ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OCR, ECAR נמדדים ברצון ברקמת הרשתית explanted באמצעות bioanalyzer תוך שימוש בטכניקות המתואר. שיטה זו יוצאת מאלו של קבוצות אחרות במספר שלבים קריטיים. רקמות ברשתית מבודדים דרך חתך גדול הקרנית ללא enucleating העולם, כפי שהם במקור מתוארת על ידי וינקלר15. שיטה זו של בידוד ברשתית מאפשר העברה מהירה מעינו החי המשקולת לכידת רקמות (לרוב בתוך 5 דקות). רקמות נשמרים ב 37 מעלות צלזיוס לאורך כל התהליך, אשר משמר נשימה תאית טוב יותר כאשר הם ממוקמים על קרח. מדיה עם תוספות מינימליות משמשים עבור מדידות ראשוניות, תוך השמטת כל סוכנים חציצה כגון HEPES או סודיום ביקרבונט, סרום או macronutrients עודף, זה מאפשר אמין יותר מדידות של חילוף החומרים האנרגיה הבזליים, לא לעכב הערכה של ECAR. אגרופים ברשתית הטוב נרשמים בתבנית 24-ובכן, במקום 96-וולס, כדי למזער את טראומה לרקמות. רקמת רשתית הוא ממוקם במרכז של הבאר, בתוך microchamber רקמות, והוא מאובטח עם הוספה רשת. עושה מאפשר הקלטה מדויקת של ECAR, OCR, תוך מניעת תנועה רקמות מופרז במהלך הריצה, וכך מבטלת את הצורך אחרים ריאגנטים כגון רקמות דבקים. זריקה הרכב במהלך הריצה מומלץ, במיוחד בעת הגדרת הקלטה ניסויים בפעם הראשונה, כמו זה ייתן תחושה של מה טוב הרקמה מאובטח בתוך הצלחת הלכידה. OCR הקלטות בעזרת טכניקה זו אינם תלויים התמצאות רשתית בתוך הבאר, אבל הכיוון חייב להישמר עקבית בין דגימות בתוך ניסויים. כל המדידות נלקחים רק לאחר מטבוליזם ברשתית הגיע מצב יציב לאחר ההזרקה של תרכובות הבדיקה.
פרוטוקול זה מתאר הנורמליזציה של נתונים לתוכן ה-DNA הכולל, כמדד עבור מספר הטלפון הנייד. טכניקה כזו היא יתרון כי זה יעבור לחשבון עבור שינויים מספר הטלפון הנייד מונע על ידי וריאציה עובי הרשתית, גודל אגרוף או ההבדלים cellularity בין מדגמים שונים מבחינה גנטית. נורמליזציה חלבון מבוססת הכולל גם שיטה אמינה, יש את היתרון של מזעור הבדלים ברוטו מיטוכונדריאלי בין דגימות ברשתית. עם זאת, נורמליזציה בהתבסס על תכולת החלבון ברקמה כל עשוי להיות מבולבל על ידי שינויים מטריצה חוץ-תאית בין דגימות. נורמליזציה של שטף ההקלטות לקו הבסיס, כפי שניתן לראות את התוצאות נציג, יש יתרון כי זה ממזער את השתנות בגודל אגרוף רשתית בין משכפל בקלות מאפשר פרשנות של שינויים עקב התערבויות תרופתי. עם זאת, דיווח של ערכים raw מאפשרת השוואה טובה יותר בין ניסויים שונים ועל ניסויים המבוצעת באמצעות שיטות הקלטה השטף שונים.
שיטות אלה תוצאות דומות לאלה דיווח במקום אחר. למרות oligomycin - מעכב ATP סינתאז - משמש בדרך כלל כדי למדוד פרוטון דליפת בתוך רקמות או תאים עניין, המתחם הזה יש השפעות םיענ על חילוף החומרים ברשתית. בניסויים דיווחו כאן, 60% ירידה רשתית מקסימלי OCR שהפיק FCCP נצפית לאחר חשיפה oligomycin (איור 4), זהה כמעט לחלוטין המחקר הקודם11. הסבר אפשרי לממצא זה הוא נזק בלתי הפיך או שינוי המיטוכונדריה הרשתית על ידי עיכוב ATP סינתאז. יתר על כן, כפי Kooragayala ועמיתיו דיווחו קודם11, רשתית המיטוכונדריה צפויים פועלים ליד תעריפי מקסימאלית בתנאים הבזליים מאז סוכן שרשרת האלקטרונים תחבורה uncoupling, FCCP, רק מגדילה OCR כ 15% (איור 3 , איור 5).
הקלטות השטף חוץ-תאית ברקמות רשתית explanted להפגין קיבולת glycolytic ריזרב גדול, שכן התוספת של 20 מ מ גלוקוז מעוררת עלייה כפולה ECAR (איור 2). בגלל oligomycin, משמש בדרך כלל כדי לאמוד את הקיבולת המקסימלית glycolytic, יש השפעות מזיקות ברקמת הרשתית (איור 4), השימוש של גלוקוז גבוה בנוסף להקלטה עשוי לשמש proxy יותר לאמוד את שמורת glycolytic ברשתית. הקונה חשוב למנוע את השימוש ECAR כמדד טהור עבור קצב glycolytic הוא זה CO2 . משוחררת ע י קרבס יכול להיות מקור לא מבוטל של חומצה בתרבית רקמה17. פירובט עודף אינה מגדילה ECAR מעל הרמות שהפיק גלוקוז גבוהות, שטף glycolytic כמעט חוסלה ב רשתית explants באמצעות יחסי טוחנת עודף של 2-די. ג'י (איור 2). מאז ATP משמש להתחדש קרומית אפשרית המתרחשים מאירועים דפולריזציה ברשתית dark-adapted, בעלי חיים חסר transducin צפויים פשוט מבזבזת יותר אנרגיה מאשר עמיתיהם WT. עם זאת, ב- explants, הבדלים ברשתית אנרגיה חילוף החומרים בין Gnat1- / - פקדים לא נראו הניסויים המתוארים כאן (איור 2 ו- 3). התוצאות אינן עקביות ביחס לאלה שהושגו באמצעות מנגנון זלוף מותאם אישית כדי למדוד OCR Gnat1- / - חיות18. ראוי לציין, המנגנון מותאם אישית בשימוש על ידי Du והתירו עמיתים למדידת OCR בתנאים מותאמים הותאם אור וחשוך. בעשותם כך, ירידה קטנה אך משמעותית OCR לאחר חשיפה קלה מזוהה פראי-סוג רשתית, אך לא Gnat1- / - רשתית18. זה מדגים מגבלה עיקרית של הטכניקה הנוכחית מדידה ECAR, OCR ב רשתית explanted - במנתח השטף חוץ-תאית המשמש כאן מסתמך על עירור אור גלוי של fluorophores נעוץ שלה חיישני חמצן ו- pH, ומבטל האפשרות של ביצוע מדידות ברקמות dark-adapted. מדידות כאלה הרלוונטיים ביותר פיזיולוגיה חזותי, עדיין יחייבו את השימוש שיטות בוגרים המיועד בלעדית עבור המחקר של חילוף החומרים ברשתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ד ר אלכסנדר Kolesnikov, ד ר ולדימיר Kefalov על מתן Gnat1- / -עכברים, משוב מועילים ועצות, ולכל לקרוא את כתב היד.
עבודה זו נתמכה על ידי NIH EY025269 (RR), המרכז לחקר הסוכרת באוניברסיטת וושינגטון - NIH DK020579 (JRM ו- RR), פרס פיתוח הקריירה מן המחקר כדי למנוע עיוורון (RR), קרן Horncrest (RR), פרס פיתוח הקריירה של האגודה לסוכרת נעורים ( JRM), DK101392 NIH (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS), DK114233 (JRM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps - Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals |
References
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
- Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Wubben, T. J., et al. Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration. Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).
- Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers. Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).
- Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging. Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).
- Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
- Winkler, B. S. Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function. The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).
- Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Pearsall, E. A., et al. PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival. BMC biology. 15 (1), 113 (2017).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of visualized experiments. (46), (2010).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Winkler, B. S. The electroretinogram of the isolated rat retina. Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).
- Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Du, J., et al. Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina. The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).
