Summary
Questa tecnica viene descritto la registrazione in tempo reale del consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare nei tessuti retinici explanted del mouse utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare.
Abstract
Alta acuità visione è un processo fortemente che consumano energia, e la retina ha sviluppato diversi adattamenti unici per soddisfare proprio queste esigenze pur mantenendo la trasparenza dell'asse visivo. Perturbazioni di questo delicato equilibrio causano malattie accecante, quali la retinopatia diabetica. Di conseguenza, la comprensione dei cambiamenti di metabolismo energetico nella retina durante la malattia è indispensabile per lo sviluppo di terapie razionali per varie cause di perdita di vison. Il recente avvento di analizzatori di flusso extracellulare commercialmente disponibile ha reso più accessibile lo studio del metabolismo energetico della retina. Questo protocollo descrive l'uso di un tal analizzatore per misurare contributi all'approvvigionamento energetico della retina attraverso le braccia due principio - fosforilazione ossidativa e la glicolisi - quantificando le variazioni dei tassi di consumo di ossigeno (OCR) ed extracellulari tariffe di acidificazione (ECAR) come proxy per queste vie. Questa tecnica viene eseguita prontamente in tessuto retinico explanted, facilitando la valutazione delle risposte agli agenti farmacologici multipli in un singolo esperimento. Metaboliche firme in retine da animali carenti asta del fotoricettore segnalazione sono confrontate ai comandi di selvaggio-tipo utilizzando questo metodo. Una limitazione importante in questa tecnica è la mancanza di capacità di discriminare tra l'utilizzazione di energia luce-adattato e scuro-adattato, una considerazione importante fisiologica in tessuto retinico.
Introduction
La retina è tra i tessuti più esigente di energia nel sistema nervoso centrale1. Come la maggior parte dei tessuti, che genera l'adenosina trifosfato (ATP) tramite la glicolisi nel citosol o tramite fosforilazione ossidativa nei mitocondri. La convenienza energetica di fosforilazione ossidativa sopra glicolisi per produrre ATP da una molecola di glucosio è chiara: 36 molecole di ATP generato dal ex vs 2 molecole di ATP generata da quest'ultimo. Di conseguenza, neuroni retinici dipendono principalmente dalla respirazione mitocondriale per l'approvvigionamento energetico e questo si riflette dalla loro alta densità di mitocondri2. Ancora, la retina anche dipende fortemente dalle macchine glicolitica anche quando l'ossigeno è abbondante. Questo processo di glicolisi aerobica è stata originariamente descritta in cellule tumorali di Otto Warburg3, che una volta ha notato che la retina era il solo post-mitotico tessuto capace di questa forma di metabolismo4. Da tali osservazioni iniziali, molti tessuti post-mitotici sono stati descritti per impegnarsi in vari gradi di glicolisi oltre alla fosforilazione ossidativa per soddisfare le loro richieste di ATP.
Fototrasduzione, pigmento visivo, riciclaggio, biosintesi di segmenti esterni del fotoricettore ed attività sinaptica sono tutti i processi di energia esigente nei fotorecettori, la sottoclasse predominante di un neurone nella retina. Ma la necessità di trasportare attivamente gli ioni contro loro elettrico e gradienti di concentrazione è di gran lunga il processo più energico che richiede in neuroni1. Fotorecettori sono neuroni peculiari nel senso che essi sono depolarizzate in assenza di stimolazione (cioè, al buio), considerando che uno stimolo luminoso innesca la chiusura del canale e successive hyperpolarization. Di conseguenza, al buio, la retina consuma grandi quantità di ATP per mantenere sua depolarizzazione o "corrente di buio", come viene comunemente chiamato. Dal punto di vista adattativo, una sfida importante nella fornitura di queste vaste quantità di ATP è la necessità di organismi mantenere la chiarezza visiva attraverso l'asse ottico. L'architettura retinica invertito visto in creature moderni è la soluzione dominante, come mantiene la fitta rete capillare fornitura fotorecettori lontano dal percorso della luce. Ma questa meraviglia di Bioingegneria naturale mette la retina a un precipizio in termini di riserva metabolica. Anche i piccoli insulti alla retina potenzialmente possono compromettere il delicato equilibrio di energia offerta alla domanda, e la disfunzione visiva o cecità frank può seguire rapidamente.
Date le richieste energetiche uniche della retina neurale, accoppiato con la sua limitazione stretto di rifornimento vascolare, misura accurata del consumo di ATP in retina e i suoi cambiamenti durante la malattia potrebbe avere profonde implicazioni nella comprensione e nel trattamento condizioni accecante come retinite pigmentosa e retinopatia diabetica. Tradizionalmente, queste misure richiedono attrezzature costose, personalizzati con maggior parte degli studi emergenti da una manciata di laboratori interamente dedicati alle misure di attività metabolica2,5,6, 7,8. Le tecniche includono singoli saggi per specifici metaboliti, gli studi di tracciante usando radio-marcato precursori, consumo di ossigeno registrazione utilizzando elettrodi di Clark e metabolomica profilatura9.
Con gli avanzamenti nella tecnologia ad alta velocità e una maggiore disponibilità di dispositivi commerciali, tecniche per registrare metabolismo retinico sono sempre più accessibile e conveniente. Il metodo qui descritto misura entrambi fosforilazione ossidativa e la glicolisi in retina utilizzando espiantati tessuto e un flusso extracellulare reperibile analizzatore9,10,11,12. Questo analizzatore registra separatamente tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR), che servono come indicatori indiretti di fosforilazione ossidativa e la glicolisi, rispettivamente13. Queste misure sono fatte da una sonda immersa all'interno di un microchamber creato sopra il tessuto di interesse. Questo adattamento dei metodi precedentemente pubblicati utilizza una piastra di acquisizione originariamente progettata per gli isolotti di Langerhans per registrare l'attività metabolica in piccole, circolare sezioni della retina di topo. Esposizioni multiple farmacologiche possono essere consegnate al tessuto nel corso di una singola registrazione perché il sistema contiene ben 4 porte di iniezione per ogni campione. Utilizzando questo sistema con distinti protocolli ottimizzati per registrazioni ECAR e OCR, le risposte delle retine di selvaggio-tipo possono essere paragonate a retine carente transducina (Gnat1- / -), delle cause di cecità notturna congenita stazionaria in gli esseri umani14.
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Protocol
Protocolli di seguirono l'associazione per la ricerca in visione e Oftalmologia istruzione per l'uso degli animali e sono stati approvati dall'Università di Washington.
1. animale preparazione
- Tenere animali in custodia standard con 12 ore di buio per ciclo di 12 ore di luce. Begin esperimenti presso standardizzata volte per evitare effetti circadiani, in genere al mattino poco dopo si accenderanno le luci.
2. soluzione preparazione
- Preparare il supporto di base sciogliendo 8,4 mg di polvere media bidistillata H2O (ddH2O) e regolare il pH a 7.4 con HCl o NaOH, ad un volume finale di 1 L. filtro sterilizzare questa soluzione con un filtro di coltura del tessuto da 0,22 µm.
- Aggiungere 1 M del glucosio e del piruvato di sodio 100 mM ai media per ottenere le concentrazioni finali di glucosio di 5 mM e 1 mM piruvato.
- Posto un'aliquota di 50 mL di base media in bagnomaria a 37 ° C.
- Preparare la soluzione di Lisi, per la quantificazione del tessuto alla fine dell'analisi del flusso, aggiungendo tris base a 10mm, polietilene glicole etere di tert-octylphenyl allo 0,2% (v/v) ed EDTA a 1 mM, tutte in ddH2Mix O. fino a quando tutti i componenti completamente dissolto e regolare pH a 8.0.
- Per il protocollo di sforzo mitocondriale, preparare un brodo di 11 µM di oligomycin, un inibitore di trifosfato di adenosina Synthase, disciolto in base media di indirizzare una concentrazione finale di 1 µM nel pozzo. Preparare un brodo di 11 µM del cianuro di carbonile - 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), un agente disgiungente, disciolto in base media di indirizzare una concentrazione finale di 1 µM nel pozzo. Preparare un cocktail di inibitori della catena di trasporto degli elettroni, rotenone e antimycin A (RAA) aggiungendo rotenone 11 µM e antimycin A 22 µM, disciolto in base media di indirizzare una concentrazione finale di 1 µM rotenone e 2 µM antimycin A nel bene.
- Per il protocollo di glicolisi, preparare un brodo di 220 mM di glucosio disciolto in media base, a una concentrazione finale di 20 mM nel pozzo di destinazione. Anche preparare uno stock di 1,1 M di 2-deoxyglucose (2DG), un inibitore competitivo di glucosio e glicolitica antagonista, scioglierlo in base media. Questo sarà destinato a una concentrazione finale di 100 mM 2-DG nel pozzo.
3. strumento taratura
- Per calibrare la strumentazione per l'analisi di un flusso extracellulare, aggiungere 1 mL di soluzione di calibrazione in ciascun pozzetto della cartuccia sensore (in totale 24 pozzetti) e incubare a 37 ° C in un CO2-free incubatore durante la notte (o almeno 8 h).
- Caricare gli additivi per il protocollo di sforzo mitocondriale o la glicolisi in ciascuna porta iniettore, da A D, la cartuccia sensore, regolazione per variazioni di volume nel pozzo.
Nota: Ad esempio, un dosaggio tipico includerebbe 45 µ l di un additivo alla prima porta iniettore, 49,5 µ l nella seconda, 54,5 µ l nel terzo e 60 µ l nell'ultimo, assumendo un volume iniziale di ben 450 µ l. - Durante i primi esperimenti diversi, caricare i supporti base nel porto A misurare quanto tessuto movimento/manufatto si verifica dopo un'iniezione di Porto.
- Fate la piastra sensore caricato Incubare a 37 ° C in un incubatore non-CO2 per almeno 60 min.
4. isolamento del tessuto retinico Mouse fresco
Nota: Questo passaggio è adattato dalla tecnica del Dr. Barry Winkler15.
- Dopo aver somministrato l'anestesia profonda usando un cocktail di chetamina/xilazina standard, eutanasia topi di dislocazione cervicale.
- Utilizzare un paio di pinze curve medie per afferrare il globo posteriore al nervo ottico e applicare una leggera pressione in avanti per proptose l'occhio (Figura 1A).
- Con una lama di rasoio pulita, è necessario creare un'incisione di limbus a limbus attraverso la cornea utilizzando un pass singolo, deliberato della lama.
- Usando bene, forcipe angolato di McPherson-stile, pizzicare il globo posteriore per esprimere la lente e membrane ialoide anteriore fuori l'incisione corneale. Eliminare questi tessuti.
- Ripetere la manovra pizzicare con il forcipe per esprimere la retina neurale.
- Utilizzando le pinze come un cucchiaio per sollevare la retina, anziché cogliere il tessuto, trasferire la retina lontano l'incisione corneale e inserire direttamente in media caldo in un piatto di 3 cm o una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti cluster.
- Utilizzare due paia di pinze McPherson-stile fine, angolate per sezionare delicatamente rimanente vitreo dalla retina. Questo è fatto meglio afferrando il vitroso alla periferia della Coppa retinica e tirando verso il centro, con un finale disinsertion del corpo vitreo dal centro nel suo complesso. Utilizzando le pinze, rimuovere qualsiasi epitelio pigmentato retinico residuo dalla superficie dei fotorecettori della retina.
- Tagliare una punta di pipetta P1000 con una lama di rasoio per creare un'apertura di ~ 4 mm per evitare inutili traumi il delicato tessuto retinico durante manovre di trasferimento.
- Trasferire il tessuto retinico isolato in media fresco utilizzando un taglio puntale P1000.
- Tagliare pugni di 1 mm della retina intorno al nervo ottico con una biopsia di 1mm punzone dotato di un pistone per sloggiare il tessuto nel caso in cui esso rimane incastrato nel foro (Figura 1B). Impostare i pugni della retina da parte nella media pulito tenuto su un blocco di 37 ° C o rilievo di riscaldamento.
5. protocollo
- Trasferire singoli punzoni di una micropiastra di cattura dell'isolotto 24 pozzetti utilizzando una tagliata punta P1000, aspirando 450 µ l di media con il tessuto.
- Bene, utilizzare forcipe dritto per manipolare delicatamente pugni nel centro della micropiastra. Tenere pugni orientati nella stessa direzione (ad es., lato della cellula del ganglio verso l'alto).
- Appoggiare la piastra di cattura su un rilievo di riscaldamento o riscaldamento insieme di blocchi a 37 ° C come questi passaggi vengono ripetuti per gli altri campioni.
Nota: Per ogni esperimento, mettere da parte 3-4 pozzetti del bianco con 450 µ l di base media di servire come controlli negativi. Nel restante 20-21 pozzi, testare ogni replica biologica in triplice copia. Di conseguenza, ogni piastra a 24 pozzetti permetterà per la registrazione da 6-7 diversi animali o condizioni di trattamento.
- Appoggiare la piastra di cattura su un rilievo di riscaldamento o riscaldamento insieme di blocchi a 37 ° C come questi passaggi vengono ripetuti per gli altri campioni.
- Evitando bolle d'aria, delicatamente posizione l'isolotto catturare inserti in mesh in ciascun pozzetto usando il forcipe e fissare gli inserti con uno stantuffo di metallo, o con un taglio puntale P1000 (Figura 1 C).
Nota: Evitare eccessivo tessuto movimento durante questo passaggio di mantenere la posizione retinica punzone all'interno del centro della microchamber di campione. Bolle d'aria falsare gravemente letture OCR. Anche se il microchamber ha una profondità adeguata per ospitare la retina di topo tipico (Figura 1), occasionalmente lavorazione-difetti negli inserti mesh possono causare tessuti diventare eccessivamente compresso durante l'inserimento di schermo. Se questo accade, semplicemente prendere nota del tessuto schiacciato ed escludere che il campione dall'analisi finale. - Incubare la piastra di tessuto in una di 37 ° C CO2-gratis incubatore per almeno 60 min.
- L'analizzatore di flusso extracellulare utilizzando Mix, attesa, misura del programma e ripetere i comandi. Ad esempio, un tipico esperimento con tessuto retinico può includere quanto segue: mescolare 2 minuti, attendere 2 minuti e misurare 5 minuti. Ripetere l'esperimento con questi tre passaggi tra 5 - 8 volte (cicli) per una registrazione di base e dopo l'iniezione di ogni composto in fase di test durante l'esecuzione.
- Premere il pulsante di avvio del programma sull'analizzatore flux extracellulare e seguire le istruzioni sullo schermo per inserire la cartuccia di sensore per la calibrazione.
- Al termine della calibrazione, seguire le istruzioni sullo schermo per sostituire la piastra di calibratore con la piastra che contiene i campioni della retina.
- Consentire al programma di eseguire, come programmato. Al completamento dell'esecuzione, seguire le istruzioni sullo schermo per espellere la piastra del tessuto. Mostra i risultati dell'esecuzione e archiviare il file di dati.
- Con un ago di calibro 20 piegato ed il forcipe, rimuovere tutti gli inserti in mesh dai pozzi, lasciando il punzone della retina.
- Attentamente i media dal tessuto di aspirare e lavare il tessuto due volte con 0,5 mL di soluzione tampone fosfato (PBS) e freddo. Aspirare il PBS dopo il lavaggio.
- Aggiungere 100 µ l di tampone di lisi in ciascun pozzetto e dispensare su e giù per omogeneizzare il tessuto.
- Quantificare i livelli di input basati su totale DNA a doppia elica (dsDNA) o contenuto proteico totale.
Nota: Di seguito si basa su un'analisi di dsDNA disponibile in commercio. - Diluire i campioni lisati 1:1 con l'aggiunta di 100 µ l di tampone Tris-EDTA (TE) e trasferire 100 µ l del campione diluito ad una piastra ben 96.
- Aggiungere 100 µ l di tampone di rilevazione in ogni pozzetto. Dopo la miscelazione per 2-5 minuti, quantitate fluorescenza dopo eccitazione a 480 nm ed emissione a 520 nm, rispetto ad una curva standard.
- Normalizzare l'analisi di flusso extracellulare crudo al contenuto di DNA all'interno del pozzo.
Nota: Nei risultati presentati qui, i campioni vengono normalizzati a 50 ng dsDNA - un importo tipico in un pugno di retinica di 1 mm. Di conseguenza, valori assoluti qui presentati può essere paragonati agli studi che presentano dati "a punzone retinica". Normalizzare i tracciati a uno standard interno, ad esempio la linea di base di esecuzione ad una concentrazione di glucosio di 5 mM.
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Representative Results
Utilizzando le tecniche descritte (riassunte nella Figura 1), retiniche espianti da topi di 8 settimana-vecchio wild type (WT) sono stati confrontati per età e background-abbinato transducina topi (Gnat1- / -). Perché Gnat1- / - animali mancano la macchina per chiudere ciclico del nucleotide gated scanalature dello ione in risposta a stimoli luminosi, loro fotoricettori dell'asta rimangono depolarizzate anche in luce14. Il successivo necessario mantenere efflusso di potassio creerebbe una grande domanda di ATP, con conseguente sforzo bioenergetico. Per determinare se tali cambiamenti in richieste di energia aumenterebbe fosforilazione ossidativa o cambiamento continuo glicolitico, tessuti da topi wild type e Gnat1- / - topi sono stati confrontati usando l'analizzatore di flusso extracellulare. Al basale, in presenza di glucosio di 5 mM e 1 mM piruvato, tessuto retinico da selvaggio-tipo animali hanno simili tassi di efflusso acido rispetto al Gnat1- / - mutanti. Modelli simili sono veduti dopo l'aggiunta di 20 millimetri di glucosio e l'inibitore glicolitico 2-DG (Figura 2A). Questi dati possono anche essere trasformati matematicamente per rappresentare frazionarie modifiche dalla linea di base (Figura 2B), un formato che può permettere per una migliore confronto tra diversi interventi sperimentali.
OCR assoluta alla linea di base è equivalente tra WT e tessuto retinico mutante (Figura 3A). L'aggiunta di 20 millimetri di glucosio aumenta la respirazione mitocondriale, ma non si notano differenze tra i gruppi in termini di quantificazione assoluta o in termini di variazione dal basale (Figura 3B). L'aggiunta di 1mM FCCP (un agente disgiungente) per dimostrare la massimi ritmi respiratori mitocondriali non aumenta significativamente OCR sopra il livello del visto con alto glucosio nei tessuti- / - WT o Gnat1. Tuttavia, i segnali provenienti da entrambi i topi scendono drasticamente dopo l'aggiunta del RAA cocktail.
Idealmente, esperimenti di flusso extracellulare eseguiti in presenza di ATP sintasi inibitore oligomycin aiuti identificando fonti di perdita di protoni, che si verificano quando il movimento attraverso la catena di trasporto degli elettroni non è associata con produzione di ATP16. In espianti della retina di topi C57BL/6J di 8 settimane, il trattamento oligomycin robustamente abbassa OCR, come previsto (Figura 4). Ma aggiunta successiva di FCCP, per trovare la massima OCR, aumenta solo nominalmente l'OCR a circa il 60% della linea di base coerenza con un precedente studio11.
L'analizzatore di XF24 utilizza sonde sommerse che rendono la tenuta all'interno del pozzo di tessuto, creando un microambiente transitorio per la misura di ossigeno e di flusso acido. Posizionamento del tessuto retinico nella piastra di bene (per quanto riguarda i sensori) potrebbe potenzialmente influenzare le registrazioni OCR e portare a fattori di confondimento indesiderate, e alcuni ricercatori hanno proposto mettendo il tessuto retinico direttamente sotto il sensore dell'ossigeno con il segmenti esterni del fotoricettore orientati verso il sensore11. Per testare gli effetti della posizione di tessuto retinico sulle misurazioni di OCR, tessuti da giovani topi C57BL/6J (8 settimane) sono stati analizzati in due orientamenti: cellule retiniche del ganglio rivolto verso il basso sulla piastra (cioè, fotorecettori posizionati verticalmente più vicino al sensore ) o rivolto verso il sensore. Stata osservata alcuna differenza nella relativa OCR in risposta a FCCP o RAA, che indica la sensibilità equivalente per ritmi respiratori mitocondriali massimi e minimi in un orientamento (Figura 5A). Inoltre, misure assolute di OCR anche erano equivalenti tra tessuto retinico in un orientamento (figura 5B).
Figura 1 : Isolamento di explant retinico e installazione nell'analizzatore flux extracellulare. A. isolamento del retina neurale in situ applicando forza propulsiva sul globo con il forcipe, incidendo la cornea e rimozione retina dopo aver scartato lente e membrane ialoide anteriore. B. preparazione del tessuto per il flusso di registrazione con punzone retinica creazione, posizionamento dei singoli punzoni in micropiastra cattura dell'isolotto e l'uso di un inserto in rete per ridurre al minimo movimento del tessuto con microchambers (scala bar = 1 mm). C. un disegno schematico, derivate dai dati forniti dal produttore, mostrando il contorno di procedura e dimostrando che altezza della microchamber è sufficiente per accogliere la retina murina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Analisi di sforzo mitocondriale usando la retina espiantato da 8 settimana-vecchi animali. R. una media di tracciati con errore standard di misura (SEM), normalizzati al contenuto di DNA del tessuto, da un esperimento ottimizzato per le registrazioni di consumo di ossigeno, confrontando animali di knockout transducina (Gnat1- / -) controlli di tipo selvaggio. B. stesso esperimento con dati trasformati che le registrazioni di base siano impostate come riferimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Analisi dell'utilizzo di tasso glicolitico espiantati retina da 8 - settimana-vecchi animali. R. media, DNA contenuto-normalizzato, tracciati da un esperimento ottimizzato per registrazioni di efflusso acido confrontando transducina animali knockout (Gnat1- / -) ai controlli di tipo selvaggio. B. dati dallo stesso esperimento normalizzato alle registrazioni della linea di base. Le tracce mostrano media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Effetti irreversibili di oligomycin su ritmi respiratori retinici. In espianti retiniche acutamente preparati da topi C57BL/6J di 8 settimane, oligomycin trattamento riduce la massima OCR indotta dall'aggiunta successiva di FCCP. Le tracce mostrano media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Effetti del posizionamento di tessuto su misura OCR. Tessuto retinico da topi C57BL/6J di 8 settimane sono stati collocati in pozzetti con cellule del ganglio che si affacciano verso il sensore (cellule del ganglio Up) o dal sensore (cellule del ganglio giù). Tra i gruppi, flusso extracellulare simile registrazioni sono osservate in termini di capacità respiratoria (A) rispetto al basale o (B) in termini di quantificazione assoluta. Le tracce mostrano media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
OCR ed ECAR prontamente sono misurati in tessuto retinico explanted utilizzando un bioanalyzer utilizzando le tecniche descritte. Questo metodo parte da quelle degli altri gruppi in diversi passaggi critici. Tessuto retinico è isolati attraverso una grande incisione cornea senza enucleando il globo, come originariamente descritto da Winkler15. Questo metodo di isolamento retinica consente un rapido trasferimento dall'occhio vivente nella piastra di cattura del tessuto (spesso entro 5 minuti). Tessuti sono tenute a 37 ° C durante tutto il processo, che conserva la respirazione cellulare meglio di quando essi sono posti su ghiaccio. Media con minimi additivi è utilizzati per le misure iniziali, omettendo eventuali agenti di buffering quali HEPES o bicarbonato di sodio, siero o macronutrienti in eccesso, come questo consente misurazioni più affidabili del metabolismo energetico basale e non inibisce valutazione di ECAR. Retiniche pugni migliori vengono registrati in un formato di 24 pozzetti, piuttosto che a 96-wells, per minimizzare il trauma al tessuto. Tessuto retinico è posto al centro del pozzo, all'interno del tessuto microchamber e fissato con un inserto in mesh. Ciò permette la registrazione accurata di ECAR e OCR, impedendo il movimento eccessivo tessuto durante la corsa ed elimina la necessità di altri reagenti come adesivi per tessuti. Un'iniezione di veicolo durante l'esecuzione è consigliata, soprattutto quando si imposta registrazione esperimenti per la prima volta, come questo fornirà un senso di quanto bene il tessuto è fissato all'interno del piatto di cattura. Registrazioni di OCR utilizzando questa tecnica sono indipendenti retinica orientamento all'interno del pozzo, ma l'orientamento deve rimanere coerenza tra i campioni all'interno di esperimenti. Tutte le misurazioni sono effettuate solo dopo metabolismo retinico ha raggiunto allo stato stazionario dopo l'iniezione di sostanze da testare.
Questo protocollo descrive la normalizzazione dei dati di contenuto di DNA totale, come un proxy per il numero di cellulare. Tale tecnica è vantaggiosa perché rappresenterà per le modifiche al numero di cellulare guidato da variazione dello spessore retinico, pugno dimensioni o differenze di cellularità tra campioni geneticamente dissimili. Totale basato su proteine normalizzazione è anche un metodo affidabile e ha il vantaggio di ridurre al minimo le differenze di massa mitocondriale totale tra i campioni della retina. Tuttavia, normalizzazione basata sul contenuto di proteina nel tessuto intero può essere confuso dai cambiamenti nella matrice extracellulare tra campioni. Normalizzazione delle registrazioni di flusso alla linea di base, come mostrato nei risultati rappresentativi, è vantaggioso perché riduce al minimo la variabilità nel formato retinico pugno tra repliche e consente facilmente l'interpretazione di cambiamenti dovuti a interventi farmacologici. Tuttavia, segnalazione di valori non elaborati consente per una migliore confronto tra esperimenti differenti e per gli esperimenti effettuati utilizzando metodi di registrazione di flusso diverse.
Risultati utilizzando queste tecniche sono paragonabili a quelli segnalati altrove. Anche se oligomycin - inibitore ATP sintasi - viene in genere utilizzato per misurare la perdita di protoni all'interno di tessuti o cellule di interesse, questo composto ha effetti spiacevoli sul metabolismo retinico. Negli esperimenti segnalati qui, un 60% diminuzione massima della retina OCR suscitata da FCCP è osservata dopo l'esposizione a oligomycin (Figura 4), quasi identico a un precedente studio11. Una spiegazione potenziale per questa individuazione è danni irreversibili o modifica ai mitocondri della retina tramite inibizione di ATP sintasi. Inoltre, come Kooragayala e colleghi in primo luogo segnalato11, retinica i mitocondri sono probabili operating a vicino a tassi massimi in condizioni basali dal agente disgiungente catena di trasporto degli elettroni, FCCP, aumenta solo OCR di circa il 15% (Figura 3 , Figura 5).
Le registrazioni extracellulari flusso nei tessuti retinici espiantati dimostrano una grande riserva di potenza glicolitico, poiché l'aggiunta di 20 millimetri di glucosio suscita un aumento duplice nel ECAR (Figura 2). Perché oligomycin, solitamente utilizzato per misurare la massima capacità glicolitica, ha effetti deleteri in tessuto retinico (Figura 4), l'uso di aggiunta di alto glucosio alla registrazione può servire come migliore proxy per misurare glicolitico riserva nella retina. Un avvertimento importante impedendo l'uso di ECAR come proxy puro per tasso glicolitico è quello di CO2 liberato dal ciclo dell'acido citrico può essere una fonte significativa di acido coltivate tessuto17. Piruvato in eccesso non aumenta ECAR sopra i livelli suscitati da alto glucosio e cambiamento continuo glicolitico è quasi eliminato in retiniche espianti utilizzando rapporti molari in eccesso di 2-DG (Figura 2). Poiché ATP è usato per rigenerare la membrana potenziale che si verificano da eventi di depolarizzazione nella retina scuro-adattato, animali carenti transducina dovrebbero spendere più energia rispetto alle controparti WT. Tuttavia, in espianti, differenze nel metabolismo energetico della retina Gnat1- / - e i controlli non sono state vedute negli esperimenti descritti qui (Figura 2 e 3). Questi risultati sono coerenti con quelli ottenuti utilizzando un apparato di aspersione personalizzato per misurare OCR in Gnat1- / - animali18. In particolare, l'apparato personalizzato utilizzato da Du e colleghi ammessi per la misura di OCR in condizioni adattate adattato di luce e buia. In questo modo, una piccola ma significativa diminuzione in OCR dopo esposizione alla luce è rilevata in retine di selvaggio-tipo, ma non in Gnat1- / - retine18. Questo illustra una limitazione importante della tecnica attuale nella misurazione ECAR e OCR in retine explanted - l'analizzatore usato qui per flusso extracellulare si basa sull'eccitazione di luce visibile di fluorofori incorporato nei suoi sensori di ossigeno e di pH, eliminando la possibilità di eseguire misure in tessuti scuro-adattati. Tali misure sono altamente pertinenti alla fisiologia visiva e ancora richiedono l'uso di vecchie tecniche progettato esclusivamente per lo studio del metabolismo retinico.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. Alexander Kolesnikov e Dr. Vladimir Kefalov per fornire Gnat1- / -topi, per utili feedback e consigli e per la lettura il manoscritto.
Questo lavoro è stato supportato da NIH EY025269 (RR), il centro di ricerca del diabete presso la Washington University - NIH DK020579 (JRM e RR), il Career Development Award dalla ricerca per prevenire la cecità (RR), la Fondazione di Horncrest (RR), il Career Development Award dal JDRF ( JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) e DK114233 (JRM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps - Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals |
References
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