Summary

Spatiotemporally kontrolleret nuklear translokation af gæster i levende celler ved hjælp af bur molekylære lim som Photoactivatable Tags

Published: January 17, 2019
doi:

Summary

Denne protokol beskriver lys-udløst nukleare translokation af gæster i levende celler ved hjælp af bur molekylære lim tags. Denne metode er lovende for site-selektiv nukleare målrette medicinafgivelse.

Abstract

Cellekernen er en af de vigtigste organeller som subcellulært medicinafgivelse mål, siden graduering af genet replikering og udtryk er effektiv til behandling af forskellige sygdomme. Her, viser vi lys-udløst nukleare translokation af gæster, der benytter bur molekylære lim (burlim-R) tags, hvis flere guanidinium ion (Gu+) vedhæng er beskyttet af en anioniske photocleavable gruppe (butyrat-substituerede nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Gæsterne markeret med Cagedlim-R er taget i levende celler via endocytose og forblive i endosomes. Dog ved photoirradiation, er Cagedlim-R omdannet til uncaged molekylære lim (Uncagedlim-R) transporterer flere Gu+ vedhæng, som letter endosomal flugt og efterfølgende nukleare translokation af gæsterne. Denne metode er lovende for site-selektiv nukleare målrette medicinafgivelse, da de mærkede Gæster kan migrere ind i cytoplasmaet efterfulgt af cellekernen kun når photoirradiated. Bur Lim-R tags kan levere makromolekylære gæster såsom quantum dots (QDs) samt små-molekyle gæster. Bur Lim-R tags kan være uncaged med UV-lys, men også to-foton nær-infrarødt (NIR) lys, der kan trænge dybt ind i vævet.

Introduction

Cellekernen, der bærer genetisk information, er en af de vigtigste organeller som subcellulært medicinafgivelse mål, siden graduering af genet replikering og udtryk er effektiv til behandling af forskellige sygdomme herunder kræft og genetiske lidelser1,2,3. For nukleare leveringen af narkotika, konjugation af peptid tags som nukleare lokalisering signaler (NLS)4,5,6 har været bredt undersøgt. Men for at reducere uønskede bivirkninger, spatiotemporelle kontrol af den nukleare translokation er nødvendigt.

Tidligere, lys-udløst translokation af proteiner i cellekernen er opnået ved hjælp af bur NLS7,8,9. NLS vandrer ind i cellekernen ved binding til cytoplasmatisk transport proteiner6. I de rapporterede metoder, er gæst proteiner forsynet med bur NLS direkte indarbejdet i cytoplasma ved mikroinjektion8 eller udtrykt i target-cellerne bruger en genetiske kode ekspansion teknik9. Derfor, en metode, der kan opnå både cellulære optagelse og foto-induceret nukleare translokation er fordelagtige for praktiske anvendelser.

Heri, beskriver vi lys-udløst nukleare translokation af gæster i levende celler ved hjælp af dendritiske bur molekylære lim (Cagedlim-Rasmussen, figur 1) tags. Vandopløselige molekylære lim10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 forsynet med flere Gu+ vedhæng er tidligere udviklet, som overholder stramt proteiner11,12,13,14,15, 16,17, nukleinsyrer18,19,20, phospholipid membraner21og ler nanosheets22,23 gennem den dannelsen af flere salt broer mellem deres Gu+ vedhæng og oxyanionic grupper på målene. Gu+ vedhæng af Cagedlim-R er beskyttet af en anioniske photocleavable gruppe, butyrat-substituerede nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC). Gæsterne markeret med Cagedlim-R er taget i levende celler via endocytose og ophold i endosomes (figur 2). Ved photoirradiation, er BANVOC grupper af Cagedlim-R adskilt for at give en uncaged molekylære lim (Uncagedlim-R) transporterer flere Gu+ vedhæng, som derefter letter overførslen af mærket gæsten i cytoplasmaet efterfulgt af cellekernen (figur 2). Cagedlim-R tag kan være uncaged ved udsættelse for UV- eller to-foton nær-infrarødt (NIR) lys uden alvorlige fototoksicitet. Vi demonstrere spatiotemporally kontrolleret nuklear levering af makromolekylære gæster samt små-molekyle gæsterne med Cagedlim-R tags, ved hjælp af quantum dots (QDs) og et fluorescerende farvestof (nitrobenzoxadiazole; NBD), henholdsvis som eksempler.

Figure 1
Figur 1: Skematisk strukturer Cagedlim-r. De 9 guanidinium ion (Gu+) vedhæng af Cagedlim-R er beskyttet af en butyrat-substituerede nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) gruppe. BANVOC grupper er kløvet af bestråling med UV- eller to-foton NIR lys. Fokale kernen i Cagedlim-R er functionalized med enten nitrobenzoxadiazole (NBD) eller dibenzocylooctyne (DBCO). Genoptrykt med tilladelse fra reference20. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Skematisk illustration af lys-udløst nukleare translokation af gæsterne konjugeret med et Cagedlim-R tag. Gæsten /Cagedlim-R konjugat er taget i levende celler via endocytose. Ved photoirradiation er Cagedlim-R tag uncaged at give en Uncagedlim-R tag, som kan lette endosomal flugt af mærket gæsten. Efterfølgende vandrer tagged gæsten ind i cellekernen. Genoptrykt med tilladelse fra reference20. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

1. forberedelse af gæsterne med burlim-R Tags Forberede Cagedlim-NBD løsning. Syntetisere Cagedlim-NBD (figur 1) efter de procedurer tidligere beskrevet20. Forberede en stamopløsning af Cagedlim-NBD (10 mM) i tørre dimethylsulfoxid (DMSO).Bemærk: Opbevar stamopløsningen i mørke. Løsningen kan fortyndes med vandig buffere eller celle Kulturmedier efter forbrug. F…

Representative Results

Før photoirradiation, Hep3B cellerne inkuberes med Cagedlim-NBD udstillet punktformet fluorescens emission fra deres indre (λext = 488 nm; Tal 4A og 4 C, grønne). En analog Mikrograf blev fremstillet ved excitation på 543 nm for rødt-fluorescerende farvestof (tal 4B og 4 C, rød), der angiver, at Cagedlim-NBD lokaliseret i endosomes. I overensstemmelse herme…

Discussion

Tidligere undersøgelser af lys-udløst translokation af proteiner i cellekernen er opnået ved hjælp af bur NLS7,8,9. Som tidligere nævnt kræver disse metoder ekstra teknikker til at indarbejde de NLS-tagged proteiner i cytoplasmaet. I modsætning hertil vores Cagedlim-R tag giver mulighed for ikke kun foto-induceret nukleare translokation, men også cellulære optagelse af gæsterne. Denne funktion af Caged<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi anerkender centeret for NanoBio Integration, University of Tokyo. Dette arbejde blev støttet af licensbetaling for unge forskere (B) (26810046) til K.O. og delvist understøttet af licensbetaling for specielt fremmes forskning (25000005) til T.A. R.M. tak Research stipendier af Japan Society for fremme af videnskab (JSP’ER ) for unge videnskabsfolk og programmet for førende kandidat skoler (GPLLI).

Materials

Azide-PEG4-NHS ester Click Chemistry Tools AZ103
Q-dot 655 ITK Invitrogen Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500) NIPPON Genetics TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000) Harvard Apparatus 7425-RC25K
Hep3B Cells ATCC HB-8064
8-chambered glass substrate Nunc 155411JP
96-well culture plate Nunc 167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM) Thermo Fisher Scientific 10370-021
Fetal bovine serum (FBS) GE Healthcare SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS) Wako Pure Chemical Industries 045-29795
LysoTracker Red Lonza Walkersville PA-3015
Hoechst 33342 Dojindo H342
Cell Counting Kit-8 Dojindo CK04
Confocal laser scanning microscope Carl-Zeiss LSM 510 Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8
Xenon light source Asahi Spectra LAX-102
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax Paradigm

References

  1. Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
  2. Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
  3. Verma, I. M., Weitzman, M. D. GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine. Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).
  4. Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences. Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).
  5. Martin, R. M., et al. Principles of protein targeting to the nucleolus. Nucleus. 6, 314-325 (2015).
  6. Sun, Y., et al. Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals. Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).
  7. Ventura, B. D., Kuhlman, B. Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization. Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).
  8. Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells. FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).
  9. Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. Control of Protein Function through Optochemical Translocation. ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).
  10. Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. Guanidinium-based "molecular glues" for modulation of biomolecular functions. Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).
  11. Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization. Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).
  12. Okuro, K., et al. Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic "Molecular Glue" on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).
  13. Uchida, N., et al. Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids. Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).
  14. Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies. ACS Nano. 8, 904-914 (2014).
  15. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues. Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).
  16. Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes. Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).
  17. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions. Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).
  18. Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization. Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).
  19. Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues. Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).
  20. Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).
  21. Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation. Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).
  22. Wang, Q., et al. High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder. Nature. 463, 339-343 (2010).
  23. Tamesue, S., et al. Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants. Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).
  24. Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes. EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).
  25. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
  26. Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).

Play Video

Cite This Article
Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).

View Video