Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

Rina Mogaki; Kou Okuro; Akio Arisaka; Takuzo Aida

doi:10.3791/58631

JoVE Journal > Chemistry

Chemistry

Spatiotemporally kontrolleret nuklear translokation af gæster i levende celler ved hjælp af bur molekylære lim som Photoactivatable Tags

Published: January 17, 2019

doi:

10.3791/58631

Rina Mogaki, Kou Okuro, Akio Arisaka, Takuzo Aida²

¹Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering,University of Tokyo, ²Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

Denne protokol beskriver lys-udløst nukleare translokation af gæster i levende celler ved hjælp af bur molekylære lim tags. Denne metode er lovende for site-selektiv nukleare målrette medicinafgivelse.

Abstract

Cellekernen er en af de vigtigste organeller som subcellulært medicinafgivelse mål, siden graduering af genet replikering og udtryk er effektiv til behandling af forskellige sygdomme. Her, viser vi lys-udløst nukleare translokation af gæster, der benytter bur molekylære lim (^burlim-R) tags, hvis flere guanidinium ion (Gu⁺) vedhæng er beskyttet af en anioniske photocleavable gruppe (butyrat-substituerede nitroveratryloxycarbonyl; ^BA NVOC). Gæsterne markeret med ^Cagedlim-R er taget i levende celler via endocytose og forblive i endosomes. Dog ved photoirradiation, er ^Cagedlim-R omdannet til uncaged molekylære lim (^Uncagedlim-R) transporterer flere Gu⁺vedhæng, som letter endosomal flugt og efterfølgende nukleare translokation af gæsterne. Denne metode er lovende for site-selektiv nukleare målrette medicinafgivelse, da de mærkede Gæster kan migrere ind i cytoplasmaet efterfulgt af cellekernen kun når photoirradiated. ^Bur Lim-R tags kan levere makromolekylære gæster såsom quantum dots (QDs) samt små-molekyle gæster. ^Bur Lim-R tags kan være uncaged med UV-lys, men også to-foton nær-infrarødt (NIR) lys, der kan trænge dybt ind i vævet.

Introduction

Cellekernen, der bærer genetisk information, er en af de vigtigste organeller som subcellulært medicinafgivelse mål, siden graduering af genet replikering og udtryk er effektiv til behandling af forskellige sygdomme herunder kræft og genetiske lidelser¹^,²^,³. For nukleare leveringen af narkotika, konjugation af peptid tags som nukleare lokalisering signaler (NLS)⁴^,⁵^,⁶ har været bredt undersøgt. Men for at reducere uønskede bivirkninger, spatiotemporelle kontrol af den nukleare translokation er nødvendigt.

Tidligere, lys-udløst translokation af proteiner i cellekernen er opnået ved hjælp af bur NLS⁷^,⁸^,⁹. NLS vandrer ind i cellekernen ved binding til cytoplasmatisk transport proteiner⁶. I de rapporterede metoder, er gæst proteiner forsynet med bur NLS direkte indarbejdet i cytoplasma ved mikroinjektion⁸ eller udtrykt i target-cellerne bruger en genetiske kode ekspansion teknik⁹. Derfor, en metode, der kan opnå både cellulære optagelse og foto-induceret nukleare translokation er fordelagtige for praktiske anvendelser.

Heri, beskriver vi lys-udløst nukleare translokation af gæster i levende celler ved hjælp af dendritiske bur molekylære lim (^Cagedlim-Rasmussen, figur 1) tags. Vandopløselige molekylære lim¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² ^, ²³ forsynet med flere Gu⁺ vedhæng er tidligere udviklet, som overholder stramt proteiner¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^, ¹⁶^,¹⁷, nukleinsyrer¹⁸^,¹⁹^,²⁰, phospholipid membraner²¹og ler nanosheets²²^,²³ gennem den dannelsen af flere salt broer mellem deres Gu⁺ vedhæng og oxyanionic grupper på målene. Gu⁺ vedhæng af ^Cagedlim-R er beskyttet af en anioniske photocleavable gruppe, butyrat-substituerede nitroveratryloxycarbonyl (^BANVOC). Gæsterne markeret med ^Cagedlim-R er taget i levende celler via endocytose og ophold i endosomes (figur 2). Ved photoirradiation, er ^BANVOC grupper af ^Cagedlim-R adskilt for at give en uncaged molekylære lim (^Uncagedlim-R) transporterer flere Gu⁺ vedhæng, som derefter letter overførslen af mærket gæsten i cytoplasmaet efterfulgt af cellekernen (figur 2). ^Cagedlim-R tag kan være uncaged ved udsættelse for UV- eller to-foton nær-infrarødt (NIR) lys uden alvorlige fototoksicitet. Vi demonstrere spatiotemporally kontrolleret nuklear levering af makromolekylære gæster samt små-molekyle gæsterne med ^Cagedlim-R tags, ved hjælp af quantum dots (QDs) og et fluorescerende farvestof (nitrobenzoxadiazole; NBD), henholdsvis som eksempler.

Figur 1: Skematisk strukturer ^Cagedlim-r. De 9 guanidinium ion (Gu⁺) vedhæng af ^Cagedlim-R er beskyttet af en butyrat-substituerede nitroveratryloxycarbonyl (^BANVOC) gruppe. ^BANVOC grupper er kløvet af bestråling med UV- eller to-foton NIR lys. Fokale kernen i ^Cagedlim-R er functionalized med enten nitrobenzoxadiazole (NBD) eller dibenzocylooctyne (DBCO). Genoptrykt med tilladelse fra reference²⁰. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Skematisk illustration af lys-udløst nukleare translokation af gæsterne konjugeret med et ^Cagedlim-R tag. Gæsten /^Cagedlim-R konjugat er taget i levende celler via endocytose. Ved photoirradiation er ^Cagedlim-R tag uncaged at give en ^Uncagedlim-R tag, som kan lette endosomal flugt af mærket gæsten. Efterfølgende vandrer tagged gæsten ind i cellekernen. Genoptrykt med tilladelse fra reference²⁰. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

1. forberedelse af gæsterne med burlim-R Tags Forberede Cagedlim-NBD løsning. Syntetisere Cagedlim-NBD (figur 1) efter de procedurer tidligere beskrevet20. Forberede en stamopløsning af Cagedlim-NBD (10 mM) i tørre dimethylsulfoxid (DMSO).Bemærk: Opbevar stamopløsningen i mørke. Løsningen kan fortyndes med vandig buffere eller celle Kulturmedier efter forbrug. F…

Representative Results

Før photoirradiation, Hep3B cellerne inkuberes med Cagedlim-NBD udstillet punktformet fluorescens emission fra deres indre (λext = 488 nm; Tal 4A og 4 C, grønne). En analog Mikrograf blev fremstillet ved excitation på 543 nm for rødt-fluorescerende farvestof (tal 4B og 4 C, rød), der angiver, at Cagedlim-NBD lokaliseret i endosomes. I overensstemmelse herme…

Discussion

Tidligere undersøgelser af lys-udløst translokation af proteiner i cellekernen er opnået ved hjælp af bur NLS⁷^,⁸^,⁹. Som tidligere nævnt kræver disse metoder ekstra teknikker til at indarbejde de NLS-tagged proteiner i cytoplasmaet. I modsætning hertil vores ^Cagedlim-R tag giver mulighed for ikke kun foto-induceret nukleare translokation, men også cellulære optagelse af gæsterne. Denne funktion af ^Caged<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi anerkender centeret for NanoBio Integration, University of Tokyo. Dette arbejde blev støttet af licensbetaling for unge forskere (B) (26810046) til K.O. og delvist understøttet af licensbetaling for specielt fremmes forskning (25000005) til T.A. R.M. tak Research stipendier af Japan Society for fremme af videnskab (JSP’ER ) for unge videnskabsfolk og programmet for førende kandidat skoler (GPLLI).

Materials

Azide-PEG4-NHS ester	Click Chemistry Tools	AZ103
Q-dot 655 ITK	Invitrogen	Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)	NIPPON Genetics	TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)	Harvard Apparatus	7425-RC25K
Hep3B Cells	ATCC	HB-8064
8-chambered glass substrate	Nunc	155411JP
96-well culture plate	Nunc	167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM)	Thermo Fisher Scientific	10370-021
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare	SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS)	Wako Pure Chemical Industries	045-29795
LysoTracker Red	Lonza Walkersville	PA-3015
Hoechst 33342	Dojindo	H342
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Confocal laser scanning microscope	Carl-Zeiss	LSM 510	Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP8
Xenon light source	Asahi Spectra	LAX-102
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax Paradigm

References

Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
Verma, I. M., Weitzman, M. D. GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine. Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).
Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences. Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).
Martin, R. M., et al. Principles of protein targeting to the nucleolus. Nucleus. 6, 314-325 (2015).
Sun, Y., et al. Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals. Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).
Ventura, B. D., Kuhlman, B. Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization. Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).
Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells. FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).
Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. Control of Protein Function through Optochemical Translocation. ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).
Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. Guanidinium-based "molecular glues" for modulation of biomolecular functions. Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).
Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization. Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).
Okuro, K., et al. Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic "Molecular Glue" on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).
Uchida, N., et al. Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids. Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).
Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies. ACS Nano. 8, 904-914 (2014).
Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues. Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).
Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes. Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).
Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions. Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).
Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization. Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).
Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues. Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).
Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).
Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation. Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).
Wang, Q., et al. High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder. Nature. 463, 339-343 (2010).
Tamesue, S., et al. Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants. Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).
Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes. EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).
Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).