Antigen-spesifikke T-celler er vanskelig å karakterisere eller bruke i terapi på grunn av deres ekstremt lav frekvens. Her gir vi en protokoll for å utvikle en magnetiske partikler som kan binde seg til antigen-spesifikke T celler å berike disse cellene og deretter vise dem flere ganger for både karakterisering og terapi.
Vi har utviklet et verktøy som både berike og utvide antigen-spesifikke T-celler. Dette kan være nyttig i tilfeller som A) oppdage eksistensen av antigen-spesifikke T-celler, B) sonde dynamikken i antigen-spesifikke tiltak, C) forstår hvordan antigen-spesifikke tiltak påvirke sykdom tilstand som autoimmunitet, D) avmystifisere heterogene Svar for antigen-spesifikke T celler eller E) benytte antigen-spesifikke celler for terapi. Verktøyet er basert på en magnetiske partikler som vi bøye antigen-spesifikke og T celle co-stimulatory signaler, og at vi kaller som kunstig antigen presentere celler (aAPCs). Derfor, siden teknologien er enkle å produsere, det kan lett bli vedtatt av andre laboratorier; Dermed er vårt formål her å beskrive i detalj fabrikasjon og påfølgende bruk av aAPCs. Vi forklarer hvordan du knytter antigen-spesifikke og co-stimulatory signaler til aAPCs, hvordan du kan bruke dem til å berike for antigen-spesifikke T celler og hvordan å utvide antigen-spesifikke T-celler. Videre vil vi markere engineering design hensyn basert på eksperimentelle og biologiske informasjon av vår erfaring med karakteriserer antigen-spesifikke T-celler.
Med fremveksten av mange immunotherapies er det behov for å karakterisere og kontrollere immunreaksjoner. Spesielt er tilpasset immunforsvaret interessant spesifisitet og holdbarhet av cellene. Nylig er chimeric-antigen-reseptor T cellen terapi godkjent for kreft terapi; Imidlertid er antigen-receptors basert på felles celle overflate antigen CD19, i stedet for antigener bestemt av kreft1. Utover spesifisitet, kan immunotherapies også lider av mangel på kontroll og begrenset forståelse dynamisk immunrespons i kreft eller autoimmunitet.
En av utfordringene med å studere antigen-spesifikke tiltak er deres ekstremt lav frekvens, f.eks., antigen-spesifikke T-celler er 1 av hver 104 106 T celler2,3. Dermed for å undersøke hvilke T celler er til stede eller svarer, cellene må enten beriket og utvidet, eller deres signal må bli forsterket. Det er dyrt og vanskelig å opprettholde mater cellene med gjeldende teknikker som fokuserer på utvidelse av antigen-spesifikke celler. Dagens teknikker som fokuserer på forsterke signalet av antigen-spesifikke T celler, som de koblede enzym-immunospot (ELISPOT) analysen, begrense viderebruk av disse T celler4. Til slutt, på grunn av lav følsomhet, disse to teknikker må ofte kombineres for antigen-spesifikke opplisting.
For å løse disse problemene, har vi utviklet den magnetiske hydrogenion-basert kunstig antigen presentere celle (aAPC)5,6,7,8. AAPC kan være functionalized med et antigen-spesifikke signal-peptid lastet store histocompatibility kompleks (pMHC) og co-stimulatory molekyler –f.eks., et anti-CD28 antistoff-både berike antigen-spesifikke T celler og deretter stimulere deres ekspansjon (figur 1). Partiklene kan således være en kostnadseffektiv sokkel produkt som kan være både tilpasset antigen-spesifikke stimulations men påkrevd eksperimenter og pasienter. Utfører den berikelse og utvidelse prosessen resulterer i hundrevis til tusenvis ganger utvidelse av antigen-spesifikke CD8 + T celler og kan resultere i frekvenser opptil 60 prosent etter bare en uke, slik at karakteristikk eller terapeutisk bruk av den store antall celler. Her, vi beskrive hvordan gjøre hydrogenion aAPCs, viktige Utformingshensyn velger hydrogenion egenskapene, og viser noen typiske resultater ved disse partiklene i isolere og utvide sjeldne antigen-spesifikke CD8 + T celler.
Vi har opprettet en roman antigen-spesifikke T cellen aisolering teknologien basert på hydrogenion kunstig antigen presentere celler (aAPCs). Hydrogenion aAPCs har peptid-lastet MHC på overflaten som tillater antigen-spesifikke T celle bindende og aktivisering sammen med co-stimulatory aktivisering. aAPCs er også spinn, og således kan brukes å berike sjeldne antigen-spesifikke T celler ved hjelp av et magnetfelt. Vi har optimalisert og studerte nøkkel hydrogenion egenskapene til størrelse, ligand tetthet, og ligan…
The authors have nothing to disclose.
J.W.H. takk NIH kreft nanoteknologi Training Center ved Johns Hopkins Institutt for NanoBioTechnology, National Science Foundation Graduate forskning fellesskap (DGE-1232825) og BUER grunnlaget for fellesskap støtte. Dette arbeidet ble finansiert av støtte fra National Institutes of Health (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/Maryland innovasjon initiativ og Coulter Foundation (JPS).
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 551263 | |
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig | BD Biosciences | 551323 | |
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 550750 | |
Vivaspin 20 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932362 | |
Vivaspin 2 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932257 | |
Purified Human Beta 2 Microglobulin | Bio-Rad | PHP135 | |
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles | Micromod | 79-01-102 | |
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm | Ocean Nanotech | SN0200 | |
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure | Miltenyi | 130-105-637 | |
EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | |
Sulfo-SMCC Crosslinker | ProteoChem | c1109-100mg | |
2-Iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 Sigma | |
96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene | Corning | 3875 | |
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain Clone R26-46 | BD Biosciences | 553434 | |
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG Clone G192-1 | BD Biosciences | 554026 | |
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice | Jackson Laboratory | 005023 | |
C57BL/6J (B6 wildtype) mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi | 130-104-075 | |
MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE | Biolegend | 405203 | |
N52 disk magnets of 0.75 inches | K&J Magnetics | DX8C-N52 | |
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 | Biolegend | 100711 | |
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation | ThermoFisher | L-34969 |