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Engineering

Bereichern Sie und erweitern Sie seltene antigenspezifischen T-Zellen mit magnetischen Nanopartikeln

Published: November 17, 2018 doi: 10.3791/58640
Automatic Translation
1,2,3,4, 2,4
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 2Institute for Cell Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 3Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 4Department of Pathology, School of Medicine, Johns Hopkins University

Summary

Antigen-spezifische T-Zellen sind schwer zu charakterisieren oder Therapien aufgrund ihrer extrem niedrigen Frequenzen zu nutzen. Hier bieten wir ein Protokoll, um eine magnetische Partikel zu entwickeln, die zur antigenspezifischen T-Zellen binden können, um diese Zellen zu bereichern und dann erweitern sie mehrere hundertfachen zur Charakterisierung und Therapie.

Abstract

Wir haben ein Werkzeug, um sowohl bereichern und erweitern antigenspezifischen T-Zellen entwickelt. Dies ist hilfreich in Fällen wie z. B. A) erkennen die Existenz von antigenspezifischen T-Zellen, B) Fühler die Dynamik der Antigen-spezifische Antworten, (C) verstehen wie Antigen-spezifische Reaktionen Krankheitszustand z. B. Autoimmunität beeinflussen, (D) entmystifizieren heterogenen Antworten für Antigen-spezifische T-Zellen, oder E) nutzen Antigen-spezifische Zellen für die Therapie. Das Tool basiert auf einem magnetischen Teilchen, dass wir konjugieren Antigen-spezifische und T-Zell co-stimulatory Signale und wir als künstliche antigenpräsentierende Zellen (aAPCs) bezeichnen. Folglich, da die Technologie einfach herzustellen ist, kann es leicht von anderen Labors angenommen werden; Somit ist unser Ziel hier detailliert zu beschreiben, die Fertigung und die anschließende Nutzung der aAPCs. Wir erklären wie man Antigen-spezifische und co-stimulatory Signale an den aAPCs befestigen, wie man sie zu bereichern für Antigen-spezifische T-Zellen nutzen und wie Sie Antigen-spezifische T-Zellen zu erweitern. Darüber hinaus beleuchten wir Konstruktion Überlegungen anhand von experimentellen und biologische Informationen unserer Erfahrung mit Charakterisierung von antigenspezifischen T-Zellen.

Introduction

Mit dem Aufstieg von vielen Immuntherapien muss man zu charakterisieren und Immunreaktionen Steuern zu können. Insbesondere ist die adaptive Immunantwort von Interesse wegen der Besonderheit und der Lebensdauer der Zellen. Vor kurzem, haben Chimären-Antigen-Rezeptor-T-Zell-Therapien für die Krebstherapie zugelassen sind; Allerdings basieren die Antigen-Rezeptoren aus gemeinsamen Zelle Oberflächenantigen CD19, anstatt die Antigene spezifisch für die Krebs-1. Darüber hinaus die Besonderheit können Immuntherapien auch der Mangel an Kontrolle und begrenzten Verständnis der dynamischen Immunantwort in Krebs oder Autoimmunität leiden.

Eine der Herausforderungen des Studiums Antigen-spezifische Reaktionen ist ihre extrem niedrigen Frequenzen, z. B.., Antigen-spezifische T-Zellen sind 1 von jeden 104 106 T Zellen2,3. So untersuchen die T-Zellen vorhanden sind oder als Reaktion, die Zellen bereichert und erweitert werden, oder ihr Signal müssen verstärkt werden. Es ist teuer und schwer zu pflegen die Feeder-Zellen mit aktuellen Techniken, die sich auf den Ausbau der Antigen-spezifische Zellen. Aktuelle Techniken, die im Fokus verstärkt das Signal des Antigen-spezifische T-Zellen, wie die Enzym-linked Immunospot (ELISPOT) assay, der Wiederverwendung von den T Zellen4zu begrenzen. Zu guter Letzt wegen geringer Sensitivität oft diese beiden Techniken für die Antigen-spezifische Aufzählung kombiniert werden müssen.

Um diese Probleme anzugehen, haben wir die magnetische Nanopartikel basierende künstliche Antigen präsentierenden Zelle (aAPC)5,6,7,8entwickelt. Die aAPC kann mit einem Antigen-spezifische Signalpeptid geladenen großen Histocompatibility Komplex (pMHC)- und co-stimulatory Molekülen - funktionalisiert werdenzB., Antikörpers Anti-CD28-beide bereichern antigenspezifischen T-Zellen und dann anschließend stimulieren Sie ihre Expansion (Abbildung 1). Die Partikel können somit eine kostengünstige handelsübliche Produkt sein, das können sowohl Antigen-spezifische Stimulationen angepasst noch standardisiert über Experimente und Patienten. Durchführung der Bereicherung und Erweiterung Ergebnisse in Hunderte bis Tausende-Fach Ausbau der Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen zu verarbeiten und kann dazu führen, dass die Frequenzen bis zu 60 Prozent nach nur einer Woche, damit die Charakterisierung oder therapeutischen Einsatz der großen Anzahl der Zellen. Hierin, wir beschreiben, wie Nanopartikel aAPCs, einige kritische Überlegungen bei der Auswahl der Eigenschaften der Nanopartikel, machen und zeigen einige typische Ergebnisse von der Verwendung dieser Partikel zu isolieren und Ausbau seltene Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen.

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Protocol

Alle Mäuse wurden entsprechend den Richtlinien von der Johns Hopkins University Institutional Review Board genehmigt beibehalten.

1. Legen Sie dimeres Major Histocompatibility Complex Immunglobulin Schmelzverfahren Protein (MHC-Ig) mit gewünschten Antigen Peptidsequenz.

Hinweis: Wenn H - 2 Kb verwenden: Ig, dann folgen das Protokoll detailliert Schritt 1.1; Wenn H-2Db:Ig, dann folgen das Protokoll detailliert Schritt 1.2.

  1. Aktive Belastung der Peptidsequenz in H - 2Kb: Ig.
    1. Bereiten Sie die notwendigen Puffer. Bereiten Sie die Denaturierung Puffer durch eine Lösung von 150 mM NaCl und 15mM Na2CO3 in entionisiertem Wasser und dann einstellen des pH-Werts 11,5. Bereiten Sie die Renaturierung Puffer durch eine Lösung von 250 mM Tris-HCl in entionisiertem Wasser und den pH-Wert auf 6,8.
      Anmerkung: In der Regel benötigen sie ca. 5 mL der Denaturierung und Renaturierung Puffer für 1 mg H - 2Kb: Ig.
    2. H - 2Kb denaturieren: Ig verbesserte Peptid-Bindung zu ermöglichen. Bringen Sie die H - 2Kb: Ig Konzentration zwischen 0,5-2 mg/mL mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Verdünnen Sie die H - 2Kb: Ig, eine Endkonzentration von 100-200 µg/mL mit 5-10-bändige Äquivalente der Denaturierung Puffern und lassen Sie Sie bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.
    3. Fügen Sie 50 Molaren Überschuss des Peptids Sequenz (in der Regel Lager Peptid bleibt bei 1 mM bei-80 ° C), H - 2 Kb: Ig Lösung.
      Hinweis: In der Regel Peptid-Antigene müssen aufgelöst werden, innerhalb von mindestens 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und dann langsam auf PBS wasserlöslich bleiben. Je nach der Aminosäure-Sequenz müssen der Betrag von DMSO erhöht werden.
    4. Renaturierung H - 2Kb: Ig mit Peptid. Sofort nach dem Hinzufügen des Peptids, bringen die Lösung einen pH-Wert von 7,4 durch Zugabe von Renaturierung Puffer. Lassen Sie die neutralisierte Lösung für 48 h bei 4 ° c inkubieren
    5. Konzentrieren und waschen Peptid geladen H - 2Kb: Ig unter Verwendung eines Kreiselpumpen Konzentrators mit einem 50 kDa Molekulargewicht Cut-Off (MWCO), folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, die Peptid geladen H - 2 Kb zu waschen: Ig Lösung 3 Mal mit PBS, zu konzentrieren, um mindestens 1 mg/mL und die Konzentration auf einem Spektrophotometer zu quantifizieren.
  2. Aktive Belastung der Peptidsequenz in H-2Db:Ig.
    1. Bereiten Sie die notwendigen Puffer. Bereiten Sie die Denaturierung Puffer durch eine Lösung von Zitronensäure 131 mM, 150 mM NaCl und 124 mM Na2HPO4 in entionisiertem Wasser und dann durch Anpassen des pH-Werts bis 6,5. Bereiten Sie die Renaturierung Puffer durch eine Lösung von 120 mM Tris-HCl in entionisiertem Wasser und Einstellen des pH-Werts um 8,8.
      Anmerkung: In der Regel benötigen sie ca. 5 mL des Puffers Denaturierung und 1 mL des Puffers Renaturierung für 1 mg H-2Db:Ig.
    2. Denaturieren H-2Db:Ig verbesserte Peptid-Bindung zu ermöglichen. Bringen Sie die H-Konzentration, 2Db:Ig um eine Endkonzentration von 0,5-2 mg/mL mit PBS. Verdünnen Sie dann die H-2Db:Ig, eine Endkonzentration von 100-200 µg/mL mit 5-10 Volumen Äquivalente der Denaturierung Puffer.
    3. Fügen Sie 50 Molaren Überschuss des Peptids Sequenz (in der Regel Lager Peptid bleibt bei 1 mM bei-80 ° C) auf die H-2Db:Ig Lösung und lassen Sie Sie für 1 h bei 37 ° c inkubieren
    4. Hinzufügen von β2-Mikroglobulin und Renaturierung H-2Db:Ig mit Peptid. Fügen Sie 2-fold Molaren Überschuss von β2-Mikroglobulin. Dann bringen Sie die Lösung einen pH-Wert von 7,4 durch Zugabe von Renaturierung Puffer. Lassen Sie die neutralisierte Lösung für 24 Stunden bei 4 ° c inkubieren
    5. Konzentrieren und waschen Peptid geladen H-2Db:Ig. unter Verwendung eines Kreiselpumpen Konzentrators mit einem 50 kDa MWCO, folgen den Anweisungen des Herstellers, die Peptid geladen H - 2 Kb zu waschen: Ig Lösung 3 Mal mit PBS, konzentrieren sich auf mindestens 1 mg/mL und quantifizieren der Konzentration auf einem Spektrophotometer.

(2) konjugieren Sie MHC-Peptid-komplexe und Co-Stimulatory Moleküle auf der Oberfläche der magnetische Nanopartikel Nanopartikel künstliche antigenpräsentierende Zellen bilden. Verwenden Sie eine von drei verschiedenen Methoden je nach Partikelgröße und Anwendung.

Hinweis: Eine Reihe von verschiedenen Techniken kann verwendet werden, die Proteine auf der Oberfläche der Partikel zu konjugieren. Hier sind 3 getrennte Ansätze beschrieben: Amin-beschichteten Partikel (Schritt 2.1), N-Hydroxysuccinimide (NHS)-beschichteten Partikel (Schritt 2.2) und anti-biotin-beschichteten Partikel (Schritt 2.3). Diese Prozesse wurden auch im Detail im Methodenabschnitt in zwei Zeitungen veröffentlichten6,7beschrieben. Führen Sie alle Schritte in einem Biosafety-Abzug mit sterilen Lösungen für die Sterilität der Lager aAPC Partikel zu erhalten.

  1. Mantel Antigen-spezifische und stimulierende Signale zu Amin-beschichtete magnetische Partikel (Abbildung 2). Diesen Prozess bezeichnet man für 100 nm, Amin-beschichtete superparamagnetischen Nanopartikeln.
    Hinweis: Ausführliche Protokolle zur Befestigung des Antikörpers auf der Oberfläche ein Amin beschichteten Teilchen finden Sie unter https://www.micromod.de/en/technotes-2.html, wo beschreibt Technote 201 wie funktionalisieren, Thiolate Antikörper und Konjugat, maleimide Partikel und 202 beschreiben den Prozess musste Amin-beschichteten Partikeln mit Maleimide funktionellen Gruppen zu funktionalisieren. Hier sind nur geringfügige Änderungen für die MHC-Ig und co-stimulatory Signale angebracht, diese Partikel hervorgehoben.
    1. Thiolate die Antikörper mit Traut Reagenz (Technote 201).
      1. Bereiten Sie ein 10 x PBS-Ethylenediaminetetraacetic-Säure (EDTA)-Puffer (0,1 M PBS und 100 mM EDTA). Fügen Sie 10 x PBS-EDTA Puffer an die Antikörper an ein 01:10 Verhältnis, die Oxidation von freien Thiole hinzugefügt, um die Antikörper zu verhindern.
      2. Der Antikörper 20 Molaren Überschuss an Traut Reagenz (2-Iminothiolane) hinzu und inkubieren Sie für 2 h bei Raumtemperatur mit dem mischen. Messen Sie die Traut Reagenz (Trockenpulver) innerhalb einer chemischen Abzugshaube, Atmung zu vermeiden, da es Amin Gruppen zu Thiol-Gruppen umgewandelt.
      3. Mit 1 x PBS-EDTA Puffer 3 Mal mit einem zentrifugalen Konzentrator mit einer 50 kDa MWCO gründlich waschen, und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, Konzentration, bis ein Endvolumen von 500 µL. messen die Konzentration der Antikörper-Lösung mit einem Spektrophotometer.
    2. Konvertieren Sie die Amin-Funktionsgruppen auf die magnetische Nanopartikel in Maleimide Gruppen mit Sulfosuccinimidyl 4-(N-Maleimidomethyl) Cyclohexan-1-Carboxylat (Sulfo-SMCC, Technote 202).
      1. Fügen Sie 10 x PBS-EDTA Puffer an die Antikörper an ein 01:10 Verhältnis zu den Partikeln.
      2. Lösen Sie Sulfo-SMCC in entionisiertem Wasser und Wirbel, bei einer Konzentration von 1 mg/mL Aufschwemmen auf. Messen Sie die Sulfo-SMCC (Trockenpulver) innerhalb einer chemischen Abzugshaube, Atmung zu vermeiden, da es Amin Gruppen zu Maleimide Gruppen umgewandelt.
      3. 0,016 Nmol Sulfo-SMCC-Lösung für jeden Quadratmillimeter Fläche der Partikel hinzufügen. Verwenden Sie für 1 mg 100 nm Partikel 0,3 mg Sulfo-SMCC. 1,5 h bei Raumtemperatur einwirken lassen.
      4. Die Teilchen mit 1 x PBS-EDTA Puffer 3 Mal mit einem Magnetfeld mit einer magnetischen Spalte Waschen und in 500 µL 1 x PBS-EDTA Puffer aufzuwirbeln.
        Hinweis: Wenn Partikel kleiner als 200 nm, wie hier beschrieben die 100 nm Partikel am ehesten Permanentmagnete werden nicht stark genug, um die Partikel zum Waschen oder Konzentration Zwecke zu ziehen. So um die kleineren Teilchen zu waschen, verwenden Sie eine magnetische Spalte bestehend aus ferromagnetischen Kugeln, um das Magnetfeld zu verstärken.
    3. Maleimide funktionalisiert Teilchen mit Thiolated Antikörper (Technote 201) reagieren.
      1. Eine Glasflasche funkeln fügen Sie die Partikel hinzu, fügen Sie eine Mini-magnetische Stir Bar platzieren Sie nur einen Zoll über eine magnetische rühren Platte zu und induzieren Sie, magnetische Mischen der Partikel-Lösung.
      2. Mixing-Lösung tropfenweise fügen Sie Thiolated Antikörper (0,5 mg des Antikörpers für jeden 1 mg Partikel hinzu). Lassen Sie über Nacht bei Raumtemperatur zu reagieren.
      3. Waschen mit 1 X PBS-Puffer 3 Mal mit einem magnetischen Feld und in 500 µL 1 X PBS aufzuwirbeln. Beschriften und bei 4 ° C für bis zu 6 Monate zu speichern.
        Hinweis: Maximale Effizienz Konjugation tritt auf, wenn Maleimide funktionalisiert Teilchen sofort mit Thiolated Eiweiß vermischt werden.
  2. Mantel Antigen-spezifische und stimulierende Signale an NHS-beschichtete magnetische Partikel (Abbildung 3). Diesen Prozess bezeichnet man für 200 nm, NHS-beschichtete superparamagnetischen Nanopartikeln.
    1. Bereiten Sie die Wiederfreisetzung Puffer, abschrecken Puffer- und Puffer speichern. Die Wiederfreisetzung Puffer ist 25 mM 2-(N-Morpholino) Ethanesulfonic Säure (MES) mit 0,01 % Tween 20 bis pH 6.0 angepasst. Der abschrecken Puffer ist eine 100 mM-Lösung von Tris-HCl bei pH 7,4. Der Speicher-Puffer ist eine Lösung aus 10 mM PBS und 0,01 % Tween bei pH 7,4.
    2. Die gefriergetrockneten Teilchen in 1 mL des Puffers Wiederfreisetzung aufzuwirbeln. Vortex kräftig für mindestens 15 Minuten bis keine Aggregate sichtbar sind.
    3. Legen Sie die Magnetpartikel auf Magnetstativ zu entfernen den Überstand, mit 0,5 mL Wiederfreisetzung Puffer und Transfer zu einem Glas funkeln Fläschchen Aufschwemmen. Wirbel, bis keine Aggregate sichtbar sind.
    4. 0,1 mg Gesamt-Protein pro 1 mg aufgewirbelten Partikel hinzufügen. Vortex mischen und reagieren bei Raumtemperatur für 2,5 h beim Mischen.
    5. 0,1 mL Puffer zu stillen und reagieren bei Raumtemperatur für 30 min beim Mischen.
    6. Legen Sie das Funkeln-Fläschchen auf ein Magnetstativ und waschen Sie die Partikel. Warten Sie, bis der Überstand klar zu entfernen ist. Entfernen Sie die Partikel aus dem Magnetstativ, fügen Sie 1 mL Wiederfreisetzung Puffer und Wirbel, bis keine Aggregate sichtbar sind. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal und Aufschwemmen der Teilchen in 1 mL Wiederfreisetzung Puffer. Speichern Sie die Partikel bei 4 ° C für bis zu 6 Monaten.
  3. Mantel Antigen-spezifische und stimulierende Signale zur anti-biotin-beschichtete magnetische Partikel (Abbildung 4). Dieser Prozess wird für 50-100 nm, Anti-Biotin superparamagnetischen Nanopartikeln beschrieben.
    1. Biotinylate MHC-Ig oder co-stimulatory Moleküle.
      1. Passen Sie die Proteinkonzentration, 0,5-2 mg/mL in PBS-Puffer. Aufschwemmen Sie Sulfo-NHS-Biotin in einer Konzentration von 10 mg/mL in entionisiertem Wasser und fügen Sie 20-fold Molaren Überschuss zu stimulierende Antikörper. Bei Raumtemperatur für 45 min inkubieren.
      2. Gründlich waschen mit PBS 3 Mal mit einem zentrifugalen Konzentrator mit einer 50 kDa MWCO, folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, Konzentration, bis ein Endvolumen von 500 µL. messen die Konzentration der Antikörper-Lösung mit einem Spektralphotometer.
    2. Konjugat biotinylierte MHC-Ig und/oder co-stimulatory Signale zu Anti-Biotin Nanopartikel. Für 500 µL Lager Anti-Biotin Partikel 0,5 Nmol stimulierende Antikörper hinzufügen und über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
    3. Waschen Sie konjugierte aAPC Nanopartikel. Da diese Teilchen kleiner als 200 sind nm, eine magnetische Spalte nass und legte auf einem Magnetstativ.
    4. Die Spalte die Partikel/Protein-Suspension hinzufügen. Können Sie die Protein/Partikel vollständig die Spalte eingeben.
    5. Waschen Sie durch Zugabe von 0,5 mL PBS dreimal auf die Spalte.
    6. Durch Entfernen der Spalte aus der Magnetstativ, 0,5 mL PBS zu der Spalte hinzufügen und verwenden den Kolben, Ausspülung der Partikel-aAPCs in ein Glas funkeln Fläschchen eluieren. Shop-Partikel bei 4 ° C für bis zu 6 Monaten.
      Hinweis: Partikel sind für bis zu 6 Monaten stabil bei 4 ° C (sollte nicht gefroren). Höhere Temperaturen reduzieren die Funktionalität der Teilchen und einige Partikel Aggregation eingehalten worden (Daten nicht gezeigt). Halten Sie nicht bei Raumtemperatur über einen längeren Zeitraum hinweg wie dies deutlich die Haltbarkeit der Partikel verringert.

(3) charakterisieren Sie den Eiweißgehalt auf künstliche antigenpräsentierende Zellen Nanopartikel mit fluoreszierenden Antikörpernachweis.

Hinweis: Dies ist eine nützliche Qualitätskontrolle der hergestellten künstlichen antigenpräsentierende Zellen. Auch die Höhe der stimulierende Signal wird verwendet, um gleichwertige aAPC Dosen in Chargen und verschiedene aAPC zu produzieren (z.B.., verschiedene Größen).

  1. Messen Sie die Partikelkonzentration der beschichteten aAPCs.
    1. Verwenden Sie unconjugated Partikel aus der Stammlösung und machen Sie eine Dosistitration 1:2 in einer Lösung von PBS über eine 96-Well mit flachem Boden Gewebekultur-Platte mit 100 µL pro Bohrloch.
    2. Lesen Sie die Partikel auf einem Teller-Lesung-Spektralphotometer bei 405 nm eine Standardkurve aus einem bekannten Partikelkonzentration zu erstellen.
    3. Nehmen Sie eine Probe von der konjugierten aAPCs, verdünnen mit PBS-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 100 µL und lesen das Spektrophotometer.
  2. Entfernen einer Stichprobe von vorgefertigten aAPCs und Flecken mit fluoreszierenden Antikörpern.
    1. Um zu berechnen wieviel Probe zu entfernen, schätzen die Zahl der Antikörper auf der Oberfläche des Partikels.
      Hinweis: Für diese Techniken, die übernehmen Sie eine Dichte von rund 1000 Antikörper/µm2 Teilchen Fläche. Um die Fluoreszenz erkennen zu können, bedarf es etwa 1011 MHC-Ig oder CD28 Moleküle pro fluoreszierende Test.
    2. Bringen Sie das Gesamtvolumen des aAPCs bis zu 100 µL mit PBS-Puffer, fügen Sie die Färbung Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 100 und 1 h bei 4 ° c inkubieren
      Hinweis: Beispiel Antikörper erfolgreich im Einsatz sind, FITC konjugiert Ratte-Anti-Maus Ig λ1, λ2, λ3 Lichterkette, Klonen R26 46 um zu erkennen, dass Klonen MHC-Ig und FITC konjugierten Maus anti-armenische/syrischen Hamster IgG, G192-1, um Anti-Maus-CD28 zu erkennen.
  3. Waschen Sie die Partikel und lesen Sie die Fluoreszenz auf eine fluoreszierende Platte-Reader zu.
    1. Waschen Sie magnetisch (wie in Schritt2 beschrieben) die gefärbten aAPC Fraktionen dreimal mit 0,5 mL PBS.
    2. Eluieren Sie die gewaschenen aAPCs mit 0,5 mL PBS.
    3. 100 µL der eluierten aAPCs Hinzufügen einer 96-Well mit flachem Boden Platte die Konzentration über die Extinktion wie in Schritt 3.1 zu lesen.
    4. Nehmen Sie die restlichen 400 µL, aufgeteilt in zwei 200 µL Aliquots und zwei Brunnen in einem schwarzen, Polystyrol 96-Well, flachen Teller hinzuzufügen. Titrieren Sie im Verhältnis 1:2 nach unten die Platte durch Einnahme von 100 µL der Lösung und mischen mit dem nächsten Brunnen, der 100 µL PBS in jedem Na wenigstens viermal hat.
      Hinweis: Durchschnittliche mehrfach repliziert der Messung zur Lärmminderung bei der Messung.
    5. Machen Sie auf der gleichen schwarz 96-Well-Platte eine Standardkurve die fluoreszierende Antikörper verwendet, um Flecken, indem es auf 1: 200 in einem Brunnen mit 200 µL PBS und titrieren nach unten im Verhältnis 1:2 für mindestens 12 Brunnen.
    6. Nachdem aAPC und fluoreszierende Antikörper auf der Platte sind, gelesen Sie die Platte mit einem fluoreszierenden Platte Lesegerät.
  4. Berechnen Sie die Menge an Protein pro Partikel. Bestimmen die Konzentration der Antikörper durch den Vergleich der Werte der Standardkurve, wo die Antikörperkonzentration bekannt ist, vorausgesetzt, ein 1:1 Verhältnis der Färbung Antikörper Antikörper erkannt. Dann teilt diese Konzentration von erkannten Antikörper mit der Konzentration der Partikel durch die Extinktion-Assay bestimmt geben die Anzahl der Antikörper pro Partikel.

(4) Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen mit vorbereiteten Nanopartikel künstliche antigenpräsentierende Zellen zu bereichern.

  1. CD8 + T-Zellen zu isolieren.
    1. Einschläfern Sie die Tiere durch die Einwirkung von Isofluran gefolgt von zervikale Dislokation.
    2. Entfernen Sie der Milz und Lymphknoten von Wildtyp C57BL/6j Mäusen und in einer Lösung von PBS. Einweichen Sie der Organe und eluieren Sie die Zellen durch eine sterile 70 µm Zelle Sieb mit häufigen Wäschen von PBS.
    3. Um nicht - CD8 + T-Zellen zu beseitigen, verwenden Sie eine keine-Touch CD8 + T Zelle Isolierungskit und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
      Hinweis: Jedes Antigen-Zustand erfordert mindestens 3 x 106 CD8 + T-Zellen.
  2. Fügen Sie die Nanopartikel-aAPCs an der CD8 + T-Zellen zu binden.
    1. Im Anschluss an die Isolation konzentrieren Sie sich auf ein Volumen von 100 µL mit PBS-Puffer mit 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA.
    2. Bestimmen Sie die Anzahl der aAPCs hinzufügen, indem die Berechnung basierend auf dem Verhältnis von 1011 aAPC-gebunden, Peptid-MHC-Ig für geladen alle 106 CD8 + T-Zellen.
    3. Brüten aAPC Partikel und CD8 + T-Zellen für 1 h bei 4 ° C mit kontinuierlichen mischen in eine sterile 5 mL Polystyrol Runde Unterrohr.
  3. Bereiten Sie ergänzt Media und T-Zell-Wachstumsfaktor (TCGF) eluieren und Kultur CD8 + T-Zellen.
    1. Ergänzen Sie für ergänzt Medien komplette RPMI 1640 Medien (mit Glutamin) mit 1 x nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 mM Natrium Pyruvat, 0,4 x Vitamin Lösung, 92 µM 2-Mercaptoethanol, 10 µM Ciprofloxacin und 10 % fetalen bovine Serum (FBS).
    2. TCGF, die Protokolle bereits etablierten und referenzierten hier9folgen zu machen.
      Hinweis: TCGF ist eine hauseigene Cocktail aus menschlichen Immunsystem Zytokine, die unerlässlich ist, T-Zellen mit zusätzliche Stimulation Signale benötigt, um wachsen auszustatten. TCGF ausgetauscht werden für bekannte T-Zelle stimulierende Zytokine wie Il-2, IL-7 oder IL-15; jedoch kann jedes der T-Zell-Antwort entsprechend polarisieren. Das hier beschriebene Protokoll wurde nicht mit dieser Cocktails optimiert; damit andere Techniken für die Konzentrationen konsultiert werden sollte und Kombinationen TCGF Nichtbenutzung mit Beispielen aufgeführten10,11.
  4. Waschen Sie und bereichern Sie aAPC und CD8 + T-Zelle-Mischung.
    1. Waschen Sie die Magnetpartikel aAPCs wie in Schritt2 beschrieben. Allerdings waschen zuerst mit PBS-Puffer mit 0,5 % BSA und 2 mM EDTA, zweite mit Medien ergänzt und dritte mit Medien mit 1 % ergänzt TCGF.
    2. Eluieren aAPCs und angereicherte CD8 + T-Zellen in 500 µL ergänzt Medien mit 1 % TCGF.
    3. Zählen der Zellen unter Verwendung eines Hemocytometer und die Platte in einer 96 U-Boden-Platte in 160 µL pro Bohrloch ergänzt Medien mit 1 % TCGF in einer Konzentration von 2,5 x 105 CD8 + T Zellen/mL.
    4. Wenn Isolierung mit aAPCs mit Peptid-geladen nur MHC-Ig auf der Oberfläche (keine co-stimulatory Signale), dann komplette Schritt 4.5. Mit aAPCs mit beiden Peptid beladenen MHC-Ig auf die Oberfläche und co-stimulatory Signale zu isolieren, dann gehen Sie zu Schritt 5.
  5. Die Magnetpartikel beschichtet mit co-stimulatory Signalen auf der Oberfläche der angereicherten Bruchteil dazugeben Sie und ein Magnetfeld um die stimulierende Signale auf der Oberfläche der T-Zellen Co cluster.
    1. Die angereicherten Fraktionen hinzufügen äquimolaren (oder mehr je nach Anwendung-siehe Abschnitt über aAPC Eigenschaften zu kontrollieren) stimulierende Antikörper auf die Anzahl der Peptid beladenen MHC-Ig auf das Teilchen.
    2. Co-stimulatory magnetische Partikel binden an angereicherten CD8 + T-Zellen für 1 h bei 4 ° c zu ermöglichen
    3. Fügen Sie Magnetfeld, indem man die Kultur-Platte zwischen zwei N52 Disk Neodymmagneten von 1,9 cm (0,75 Zoll) in der Länge.
      Hinweis: N52 Disk Magnete haben ein extrem starkes Feld. Darauf sollte geachtet werden, beide zu lagern mit Abstandshaltern zwischen Magneten, da es schwer voneinander zu entfernen und wenn sie auf den Kultur-Platten setzen. Um die Magnete kleben die metallischen Komponenten des Inkubators zu minimieren, legen Sie sie in 50 mL konische Rohr Styropor-Container auf der Unterseite und der Oberseite.

5. erweitern Sie und erkennen Sie Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen mit vorbereiteten Nanopartikel künstliche antigenpräsentierende Zellen zu.

  1. Fügen Sie die 96 U-Talsohle well-Platte mit aAPCs und CD8 + T-Zellen in eine befeuchtete 5 % CO2, 37 ° C Inkubator für 3 Tage. Tag 3 ernähren Sie sich die Zellen mit 80 µL pro Bohrloch ergänzt Medien mit 2 % TCGF und Ort zurück in den Inkubator bis Tag 7.
  2. Am 7. Tag ernten Sie die stimulierten Zellen in eine 5 mL Runde Unterrohr zum zählen.
  3. Sobald alle die Lösung wird geerntet, Spin-down die geernteten Zellen in 0,5 mL PBS mit 0,05 % Natriumazid und 2 % Aufschwemmen FBS. Rechnen Sie entwicklungsfähigen Zellen durch Färbung mit Trypan blau und setzt auf eine Hemocytometer.
  4. 50.000-500.000 gezählte Zellen in zwei neuen 5 mL Rundrohre unten für Antigen-spezifische Färbung zu entfernen. Eine Röhre für den Verwandten Peptid-MHC-Fleck verwendet werden, und der andere Schlauch wird für den nicht-verwandtes Fleck Hintergrundfärbung bestimmen verwendet werden.
  5. Fügen Sie 1 µg der biotinylierte MHC-Ig (mit Hilfe der Technik, die in Schritt2 beschrieben) zu den jeweiligen Cognate und nicht verwandtes Röhren in 100 µL PBS mit 0,05 % Natriumazid und 2 % FBS mit Allophycocyanin (APC)-Ratte konjugierten Anti-Maus CD8a, 53-6,7 (Verdünnungsverhältnis von Klonen 1: 100) für 1 h bei 4 ° C.
  6. Hinzufügen von sekundären Streptavidin und Leben tot Fleck. Überschüssige biotinylierte MHC-Ig mit PBS durch Zentrifugation auswaschen. Dann färben alle Proben mit einem Verhältnis von 1: 350 von Phycoerythrin (PE)-mit der Bezeichnung Streptavidin und 1: 1000-Verhältnis des Fleckes lebenden/Toten fixierbar grüne tote Zelle für 15 min bei 4 ° C.
  7. Lesen Sie alle Proben auf einem Durchflusszytometer bestimmen die Besonderheit und die Anzahl der Antigen-spezifische Zellen.
    1. Überschüssige sekundäre auswaschen und lebenden/Toten Fleck durch Zentrifugation und Aufschwemmen mit 150 µL PBS-Puffer mit 0,05 % Natriumazid und 2 % FBS auf einem Durchflusszytometer zu lesen.
  8. Bestimmen der Anzahl und Prozent der Antigen-spezifische Zellen mit Daten-Analyse-Software.
    1. Um den Prozentsatz der Antigen-spezifische Zellen zu bestimmen, verwenden Sie die folgenden Tore in den jeweiligen Auftrag live + Lymphozyten + (forward Scatter von Side Scatter), CD8 + und Dimer +. Bestimmen Sie das Dimer + Tor durch den Vergleich der nicht-verwandtes auf den cognate Fleck.
    2. Den Anteil der Antigen-spezifische Zellen in einer Probe durch Subtraktion den Prozentsatz der Dimer + cognate MHC-Ig-Fleck aus den nicht-verwandtes MHC-Ig Fleck zu bestimmen.
    3. Multiplizieren Sie mit Hilfe dieser Prozentsatz von Antigen-spezifischen Zellen, ihn durch die Anzahl der Zellen gezählt, die Anzahl der daraus resultierenden Antigen-spezifische Zellen von der Bereicherung und Erweiterung nachgeben.
      Hinweis: Entschädigung müssen auf das Durchflusszytometer eingerichtet, da gibt es spektrale Überlappung mit der Fluorophore in diesem Panel verwendet.

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Representative Results

Um eine erfolgreiche Bereicherung und Erweiterung der antigenspezifischen T-Zellen zu vervollständigen, die Peptid beladenen MHC-Ig und co-stimulatory Moleküle erfolgreich aAPC Partikel beizufügen. Basierend auf den 3 Methoden der Partikel Anlage, bieten wir einige repräsentativen Daten für eine erfolgreiche Konjugation Verfahren Ergebnis (Abb. 5a). In der Tat, wenn die Liganden-Dichte zu niedrig ist, dann es wird effektive Stimulation der Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen, wo dies, um lineare Abstand zwischen den Liganden über 100 geschieht, nm in unserer Erfahrung (Abb. 5 b)7.

Neben der quantitativen fluoreszierende Antikörper auslesen und transgenen CD8 + T-Zelle-Erweiterungen können Nanopartikel aAPCs durch doping im cognate transgenen Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen für die Qualitätskontrolle überprüft werden. Dies kann durch CD8 + T-Zellen aus einer transgenen Maus wie ein Pmel Maus hat gp100-spezifische Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen zu isolieren und doping in einem B6-Hintergrund im Verhältnis 1: 1000. Zähl- und Färbung vor und nach Anreicherung erlaubt die Enumeration der Falte Bereicherung (Abb. 6a) und Prozent Erholung (Abb. 6 b)6. In diese repräsentative Ergebnisse zeigen wir Ihnen, dass ein-/Ausgang-1 nur aAPCs die meisten bieten Zelle effiziente Anreicherung (fast 10-divisibel) und rund 80 % Erholung, die über traditionelle Signal 1 und 2 aAPCs noch verstärkt wird die unspezifische Anti-CD28 auf das Teilchen haben Auch.

Einmal wurden Partikel aAPCs hinreichend charakterisiert und Qualität kontrolliert, dann sie in die Bereicherung und Erweiterung der seltenen Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen von Wildtyp-Mäusen verwendet werden können. Um genaue Ergebnisse zu erzielen ist es wichtig, funktionelle Nachweisreagenzen, wie z. B. die biotinylierte Dimer haben. Die Qualitätskontrolle der biotinylierte Dimer kann auch auf transgene CD8 + T-Zellen zu beflecken überprüfen erfolgen. Repräsentative Ergebnisse zeigen die positive Färbung mit gp100-spezifische CD8 + T-Zellen mit B6 CD8 + T-Zellen als Hintergrund-Steuerelement (Abbildung 7). Abbildung 7 zeigt, dass auch wenn es zu hohe Niveaus der biotinylierte Dimer gibt, dann es wird seine Gier zu verringern, da sie mit sich selbst konkurrieren und Mono-Valent Bindung aufweisen.

Nach der Bereicherung und Erweiterung der Maus CD8 + T-Zellen für sieben Tage kann man zwischen 5 und 50 Prozent Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen, mit fast 20.000 bis 200.000 Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen nach dem Start mit 5 x 106 CD8 + T-Zellen pro Zustand erwarten. (Abbildung 8) 6. speziell, wenn Färbung für Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen, ist es wichtig zu wissen, die Hintergrundfärbung der biotinylierte Dimer, wo in diesem Fall war es 4.15 %; Jeder Anteil geringer als dies von den Verwandten Fleck gilt ein negatives Ergebnis (Abb. 8a). Darüber hinaus wird dies zeigen, wo die Flow Cytometry Tore, um festzustellen, den tatsächlichen Prozentsatz der Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen zu zeichnen. Dies gilt in Fällen, wo Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen haben keine eindeutige Bevölkerungen (siehe Abbildung 8a) aber erscheint als ein breites Abstrich.

Das gleiche Verfahren kann verwendet werden, zu isolieren und menschliche Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen zu stimulieren. Ähnliche Qualitätskontrolle und Ergebnisse sollte gesehen werden, wo erhebliche Erhöhungen der Prozentsätze und Zahlen der Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen nach nur einer Woche der Expansion nach der Anreicherung (Abbildung 9)5eingehalten werden.

Figure 1
Abbildung 1 : Schaltplan des Prozesses der Antigen-spezifische Bereicherung und Erweiterung durch Nanopartikel künstliche Antigen-präsentierenden Zellen. Zuerst füllen Sie eine keine-Touch-CD8 + T-Zelle-Isolation. Fügen Sie Nanopartikel aAPCs der CD8 + T-Zellen. Mit einem magnetischen Feld, Kultur, bereichern und mit aAPCs zu stimulieren. Zu guter Letzt erkennen Sie angereicherte und erweiterte Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen durch Durchflusszytometrie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: schematische für Konjugation Peptid beladenen MHC-Ig und co-stimulatory Moleküle auf der Oberfläche der Amin-beschichtete Magnetpartikel. Kurz, wird Sulfo-SMCC Vernetzer zur Oberfläche der magnetischen Partikel mit Maleimide funktionellen Gruppen zu funktionalisieren. MHC-Ig und co-stimulatory Moleküle sind gleichzeitig mit Trauts Reagenzien herstellen Thiol funktionellen Gruppen funktionalisiert. Die aktivierten Teilchen Protein Signale reagiert zusammen und dann gewaschen, um die Antigen-spezifische künstliche Antigen-präsentierende Zelle magnetischer Nanopartikel zu produzieren. Diese Zahl wurde von Zusatzmaterial unser Labor Veröffentlichung im Nano Buchstaben7geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: schematische für Konjugation Peptid beladenen MHC-Ig und co-stimulatory Moleküle auf der Oberfläche der NHS-beschichtete Magnetpartikel. Kurz, sind die NHS-beschichteten Partikel zusammen mit Peptid beladenen MHC-Ig und co-stimulatory Moleküle reagiert und dann gewaschen, um die Antigen-spezifische künstliche Antigen-präsentierende Zelle magnetischer Nanopartikel zu produzieren. Diese Zahl wurde von Zusatzmaterial unser Labor Veröffentlichung im Nano Buchstaben7geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Schaltplan für Konjugation Peptid beladenen MHC-Ig und co-stimulatory Moleküle auf der Oberfläche der anti-biotin-beschichtete magnetische Partikel. MHC-Ig und co-stimulatory Molekülen mit NHS-Biotin Biotin funktionellen Gruppen produzieren funktionalisiert werden. Dann werden die anti-biotin-beschichteten Partikel zusammen mit funktionalisierten Peptid beladenen MHC-Ig und co-stimulatory Moleküle reagiert. Danach werden diese Partikel gewaschen, um Antigen-spezifische künstliche Antigen-präsentierende Zelle magnetischer Nanopartikel zu produzieren. Diese Zahl wurde von Zusatzmaterial unser Labor Veröffentlichung im Nano Buchstaben7geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Konjugation Effizienz ist entscheidend für die Bereicherung und Erweiterung der antigenspezifischen T-Zellen. (a) repräsentative Datenbank für Konjugation Effizienz mit den drei Konjugation Methoden auf drei verschiedenen magnetische Partikeln in das Papier beschrieben: Amin-beschichteten Partikeln, NHS-beschichteten Partikel und anti-biotin-beschichteten Partikeln. Jeder Datenpunkt stellt ein anderes Teilchen Präparationstechnik und Fehlerbalken stellen S.E.M (b) wie Liganden Dichte transgenen CD8 + T-Zell-Stimulation, beeinflusst wo die Liganden Dichte als lineare Abstand zwischen den Liganden in Nanometern auf 600 dargestellt wird nm und 50 nm aAPCs (n = 5 und Fehlerbalken darzustellen S.E.M). Diese Zahl wurde von unserem Labor Veröffentlichung im Nano Buchstaben7geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Qualitätskontrolle aAPC Bereicherung. Transgene Pmel gp100-spezifische CD8 + T-Zellen wurden im Verhältnis 1: 1000 in Wildtyp-B6 CD8 + T-Zellen in dotiert. (a) Falte Bereicherung wurde mittels Durchflusszytometrie nach Anreicherung durch Färbung des Congenic Markers gemessen Thy1.1 und CD8. Hier war ein Vergleich zwischen Signal 1 einzige Teilchen oder Db-Ig mit gp100, traditionellen Signal 1 und 2 Partikel oder Db-Ig mit gp100 und Anti-CD28 und nicht verwandtes Signal 1 und 2 Teilchen geladen geladen. (b) Zellen wurden auch vor und nach gezählt, um die Zelle Erholung zu messen durch jede der Methoden. Daten stellt drei unabhängige Experimenten und Fehler Balken repräsentieren S.E.M Daten kombiniert wurde gemessen, indem einfache ANOVA mit Tukey Posttest (*p< 0,05, **p< 0,01). Diese Zahl wurde von unserem Labor Veröffentlichung im Nano Letters6geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 : Qualitätskontrolle von biotinylierte Dimer. Gp100-spezifische CD8 + T-Zellen wurden isoliert von einer transgenen Pmel Maus und gebeizt in 100 µL PBS mit drei Konzentrationen von biotinylierte Db-Ig mit gp100 und APC Anti-CD8a, geladen mit Wildtyp-B6 CD8 + T-Zellen als Negativkontrolle. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8 : Bereicherung und Erweiterung der Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen. B6-Wildtyp-CD8 + T-Zellen wurden angereichert mit entweder Signal nur 1 (Kb-Ig mit TRP2 geladen) oder signal 1 und 2 (Kb-Ig mit TRP2 und Anti-CD28 auf die Oberfläche des Partikels konjugiert geladen). Signal 2 war dann der angereicherten Bruchteil von Signal 1 nur aAPCs hinzugefügt und alle Zellen waren für 7 Tage kultiviert. (a) CD8 + T-Zellen sind gefärbt und eingezäunt auf einem fluoreszierenden lebenden/Toten Fleck, dann gated CD8 + und KbTRP2 + und im Vergleich zu einer nicht verwandtes Kb-Ig, Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen zu erkennen. (b) Prozentsatz und (c) Anzahl der TRP2-spezifische CD8 + T-Zellen könnte somit sein bestimmt, wo höhere Prozentsätze und Zahlen der Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen aus dem Signal 1 einzige Bereicherung Ansatz nachgewiesen werden konnte (n = 7, Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung, zweiseitigen gepaarten t-Test *p < 0,05, **p < 0,01). Diese Zahl wurde von unserem Labor Veröffentlichung im Nano Letters6geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 9
Abbildung 9 : Bereicherung und Erweiterung der menschlichen Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen. (a) Vertreter fließen Cytometry Grundstücke am Tag 0, bevor die Anreicherung und Tag 7 zeigen die dramatischen Auswirkungen der Bereicherung und Erweiterung Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen von gesunden Spendern mit traditionellen Nanopartikel aAPCs wo A2-Ig mit NY-ESO1 und A2-Ig geladen beladen mit MART1 Antigene angezeigt werden. (b) das schafft hohe Prozentsätze (~ 10-20 %) und Zahlen (0,5-1 x 106) Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen von Tag 7 (n = 3 unabhängige Geber, Fehlerbalken darzustellen S.E.M). Diese Zahl wurde von unserem Labor Veröffentlichung im ACS Nano5geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Ergänzende Datei 2-Box 2. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen. 

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Discussion

Wir haben eine neuartige antigenspezifischen T-Zellen Isolationstechnologie basierend auf Nanopartikel künstliche antigenpräsentierende Zellen (aAPCs) erstellt. Nanopartikel aAPCs haben Peptid-MHC auf der Oberfläche geladen, die Antigen-spezifische T-Zell-Bindung und Aktivierung neben co-stimulatory Aktivierung ermöglicht. aAPCs sind ebenfalls paramagnetisch und kann somit verwendet werden, um seltene antigenspezifischen T-Zellen mit einem magnetischen Feld bereichern. Wir haben optimiert und studierte wichtige Nanopartikel Eigenschaften von Größe, Liganden Dichte und Liganden Wahl und deren Einfluss auf Bindung, Anreicherung, Aktivierung und Zelle-Anreicherung (Ergänzende Datei 1-Kasten 1).

So, die Bereicherung und Erweiterung Verfahren Ergebnisse in Antigen-spezifische CD8 + T Zelle Ausbau mehrerer tausendfach produziert Antigen-spezifische Prozentsätze so hoch wie 60 % und einsetzbar in murinen und menschlichen Einstellungen (Ergänzende Datei 2-Box 2 ). Solche hohen Zahlen und Prozentsätze der antigenspezifischen T-Zellen aktivieren die Charakterisierung der Immunantworten gegen Krankheiten (zB., Krebs, Autoimmunerkrankungen, etc.), für die Entdeckung des neuartigen immun Ziele und Mechanismen ermöglichen und bieten die Möglichkeit, sein in Eigenblutimmuntherapie verwendet. Ein Beispiel für eine bestimmte Anwendung ist Sequenz eines Patienten Tumor, Mutationen zu identifizieren, suchen potentielle MHC-Bindemittel aus dem mutierte Sequenzen, aAPCs mit den Top-Kandidaten-Antigenen zu produzieren und nutzen Sie die aAPCs um festzustellen, ob der Patient irgendwelche hat Tumor-spezifische Neoantigens.

Methodische Einschränkungen wurden in der Tat ein wesentliches Hemmnis zu studieren und Antigen-spezifische Antworten zu identifizieren. Aktuelle Techniken erfordern (a), dass erhebliche Zeit und arbeitsintensive Verfahren, (b) die derzeitigen Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung der Zell-Linien wie die Notwendigkeit, autologe dendritische Zellen sammeln erfordern (c) Wochen T-Zell-Expansion vor dem Erhalt der Ergebnisse, (d) zur Folge in niedrigen Spezifitäten (1-2 %) und geringe Zahl von Antigen-spezifische CD8 + T können nicht Zellen, (e) oft mit erheblichen Hintergrundsignal und (f) der CD8 + T-Zellen, die oft produziert werden verwendet oder studierte in weiteren Tests. Eine Methode erfordert Immunisierung mit Antigen vor ELISPOT, das Vorhandensein von Antigen-spezifische Antwort14,15,16,17zu charakterisieren. Eine andere Methode, die Verwendung von Tandem-Mini-Genexpression Plasmide um antigenpräsentierende Zellen zu transfizieren erfordert Multiplexen Tetramer Flecken mit Zytokin + Antworten wie IFNγ die Empfindlichkeit18zu erhöhen. Auch Peptid pulsierende endogenen antigenpräsentierende Zellen in in-vitro- Kultur, nur Ergebnisse in einer 0,5 % Erhöhung der Antigen-Spezifität-15.

Unser Ansatz löst diese methodischen Einschränkungen und kann somit als diagnostische und therapeutische Werkzeug handeln. Wichtige Schritte zur Gewährleistung Antigen-spezifische CD8 + T-Zell-Bereicherung und Erweiterung sollen 1) effektiv Laden MHC-Ig mit Peptid-Antigen 2) konjugieren stimulierende Signale an die Oberfläche von Nanopartikeln, (3) die Partikel an T-Zellen binden, 4) bereichern die Zellen gebunden die Nanopartikel mit einem magnetischen Feld, 5) erweitern eluierten Nanopartikel gebunden-T-Zellen in Kultur und 6) Antigen-spezifische CD8 + T Zellen am 7. Tag mit biotinylierte, Peptid beladenen MHC zu erkennen.

Die Hauptprobleme, die sich in der Bereicherung und Erweiterung Protokoll ergeben sich aus unsachgemäßer Herstellung oder abgelaufene Nachweisreagenzen oder Nanopartikel aAPCs. Sicherstellen Sie, dass die biotinylierte Dimer Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen mit Tests an transgenen Antigen-spezifische CD8 + T-Zellen beflecken kann. Wenn die Peptid-MHC-Ig eine entsprechende transgenen Mausmodell nicht kennt, kann es hilfreich sein, eine Positivkontrolle Peptid zu laden und testen Sie die positive Kontrolle um zu überprüfen, laden. Einige Peptide können jedoch nicht in den MHC-Ig geladen; Dies simuliert werden mit MHC-Loading Algorithmen wie Net-MHC oder experimentell mit RMAS-Zelle basierte Assays13. aAPC Partikel Stabilität kann nach 6 Monaten abnehmen, also wenn es gewisse Variabilität in Bereicherung und Erweiterung Ergebnisse, dann noch eine fluoreszierende gibt Platte-Leser-Test durchgeführt werden kann, um die Stabilität zu überprüfen.

In Zukunft arbeiten, wir wollen die Fähigkeiten, Breite und Tiefe des Assays ausbauen. Wir arbeiten auf die Erhöhung des Durchsatzes und die Fähigkeit, mit mehreren Antigenen untersucht auf einmal in eine 96-Well-Plattenformat multiplex. Derzeit ist eine wesentliche Einschränkung, dass nur wenige Antigene gleichzeitig untersucht werden können. Wir arbeiten dies durch die Untersuchung, wie die Größe der Teilchendichte aAPC und Liganden Bereicherung beeinflusst. Darüber hinaus untersuchen wir wie unterschiedlichen Zelle Kompositionen Effekt CD8 + T Zelle Ausdehnung innerhalb der Kultur. Zu guter Letzt wollen wir diese Technologie innerhalb von MHC Klasse II zu bereichern und erweitern Antigen-spezifische CD4 + T-Zellen können zu imitieren.

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Disclosures

Die Autoren erklären die folgenden konkurrierenden finanziellen vorgibt: unter einem Lizenzvertrag zwischen NexImmune und der Johns Hopkins University, Jonathan Schneck ist berechtigt, einen Anteil des Königtums erhielt von der Universität auf den Verkauf von Produkten in diesem beschrieben Artikel. Er war auch einer der Gründer von NexImmune und besitzt Eigenkapital in das Unternehmen. Er dient als Mitglied des Board of Directors und wissenschaftlicher Beirat des NexImmune. Die Bedingungen dieser Vereinbarungen müssen überprüft und genehmigt von der Johns Hopkins University gemäß ihrer Interessenkonflikt Politik wurde.

Acknowledgments

J.W.H. danke das NIH Krebs Nanotechnologie Training Center am Johns Hopkins Institut für Nanobiotechnologie, die National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1232825) und die Bögen Foundation Fellowship Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung durch die National Institutes of Health (P01-AI072677, R01-CA108835 R21-CA185819), TEDCO/Maryland Innovationsinitiative und Coulter Foundation (JPS) finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein BD Biosciences 551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig BD Biosciences 551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein BD Biosciences 550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932257
Purified Human Beta 2 Microglobulin Bio-Rad PHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles Micromod 79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm Ocean Nanotech SN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure Miltenyi 130-105-637
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217
Sulfo-SMCC Crosslinker  ProteoChem c1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene Corning 3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46   BD Biosciences 553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1 BD Biosciences 554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice Jackson Laboratory 005023
C57BL/6J (B6 wildtype) mice Jackson Laboratory 000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse Miltenyi 130-104-075
MS Columns Miltenyi 130-042-201
LS Columns Miltenyi 130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE Biolegend 405203
N52 disk magnets of 0.75 inches  K&J Magnetics DX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 Biolegend 100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation  ThermoFisher L-34969

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References

  1. Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).
  2. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  3. Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
  4. Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).
  5. Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
  6. Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
  7. Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
  8. ,, et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
  9. Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
  10. Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
  11. Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
  12. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
  13. Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
  14. Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
  15. Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
  16. Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
  17. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572 (2014).
  18. Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).

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