Summary
抗原特异性 t 细胞由于其频率极低, 很难在治疗中表征或利用。在此, 我们提供了一个协议, 以开发一个磁性粒子, 它可以结合到抗原特异性 t 细胞, 以丰富这些细胞, 然后扩大他们的几百倍, 用于表征和治疗。
Abstract
我们开发了一种工具, 既能丰富又能扩大抗原特异性 t 细胞。这在 a) 检测抗原特异性 t 细胞的存在等情况下很有帮助, b) 探测抗原特异性反应的动态, c) 了解抗原特异性反应如何影响疾病状态, 如自身免疫性, d) 消除异质性的疾病状态抗原特异性 t 细胞 (e) 的反应利用抗原特异性细胞进行治疗。该工具是基于一个磁性粒子, 我们结合抗原特异性和 t 细胞共刺激信号, 我们将其称为人工抗原呈现细胞 (aAPCs)。因此, 由于该技术生产简单, 可方便地被其他实验室采用;因此, 我们在这里的目的是详细描述的制造和随后的使用的 apc。我们解释了如何将抗原特异性和共刺激信号附加到 aAPCs, 如何利用它们来丰富抗原特异性 t 细胞, 以及如何扩大抗原特异性 t 细胞。此外, 我们将根据我们在抗原特异性 t 细胞特征方面的经验的实验和生物学信息, 重点介绍工程设计方面的考虑。
Introduction
随着许多免疫疗法的兴起, 有必要能够描述和控制免疫反应。特别是, 由于细胞的特异性和耐久性, 适应性免疫反应是有意义的。最近, 嵌合体抗原受体 t 细胞疗法已被批准用于癌症治疗;然而, 抗原受体根据共同的细胞表面抗原 cd19, 而不是抗原特异性的癌症1。除了特异性之外, 免疫疗法还可能缺乏控制, 对癌症或自身免疫功能内的动态免疫反应了解有限。
研究抗原特异性反应的挑战之一是其极低的频率,例如, 抗原特异性 t 细胞是每 10 4 至 106 t 细胞 2,3中的1个。因此, 为了研究哪些 t 细胞存在或响应, 细胞要么需要丰富和扩大, 要么需要放大其信号。使用目前专注于抗原特异性细胞扩张的技术来维护馈线单元是昂贵和困难的。目前的技术, 重点是放大抗原特异性 t 细胞的信号, 如酶联免疫罐 (elispot) 检测, 限制了这些 t 细胞4的再利用。最后, 由于灵敏度较低, 通常需要将这两种技术结合起来才能进行抗原特定的枚举。
为了解决这些问题, 我们开发了基于磁性纳米粒子的人工抗原呈现细胞 (aAPC)5,6,7,8。aAPC 可以功能化与抗原特异性信号肽加载主要组织相容性复合体 (pmhc) 和共同刺激分子-例如, 抗 cd28抗体既丰富抗原特异性 t 细胞, 然后随后刺激它们的扩张 (图 1)。因此, 这些颗粒可以是一种经济高效的现成产品, 既可以定制, 以满足抗原特定的刺激, 但在实验和患者之间实现标准化。执行富集和膨胀过程可使抗原特异性 cd8 + t 细胞膨胀数到千倍, 并可在短短一周内将频率提高到 60%, 从而实现大型 cd8 + t 细胞的表征或治疗使用。细胞的数量。本文介绍了纳米粒子 aAPCs 的制备方法, 在选择纳米粒子性能时的一些关键设计考虑因素, 并展示了利用这些粒子分离和扩展稀有抗原特异性 cd8 + t 细胞的一些典型结果。
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Protocol
所有老鼠都按照约翰·霍普金斯大学机构审查委员会批准的指导方针进行维护。
1. 负载二聚类主要组织相容性复合免疫球蛋白融合蛋白 (mhc-ig) 与所需的抗原肽序列。
注: 如果使用 h-2: ig, 则按照步骤1.1 中详细介绍的协议进行操作; 如果使用 h-2 k:ig, 请遵循步骤1.1 中详细介绍的协议。如果使用 h-2db:ig, 则按照步骤1.2 中详细介绍的协议进行操作。
- 将肽序列主动加载到 h-2kb:ig 中。
- 准备必要的缓冲区。在去离子水中制备 150 mm ncl 和 15mm na 2co3的溶液, 然后将 ph 值调整为 11.5, 从而制备变性缓冲液。在去离子水中制备 250 mm tris hcl 的溶液, 并将 ph 值调整为 6.8, 从而准备再生缓冲液。
注: 通常情况下, 对于1毫克的 h-2 k:ig, 它将需要约5毫升的变性和重变性缓冲液。 - 变性 h-2 k:ig, 以允许增强肽结合。将 h-2kb:ig 浓度带到 0.5-2 mg/ml 之间, 并使用磷酸盐缓冲盐水 (pbs)。然后用5-10 体积等效的变性缓冲液稀释 h-2 k:ig, 使其最终浓度达到 10-200μg/ml, 并允许在室温下孵育15分钟。
- 在 h-2 k:ig 溶液中加入50摩尔过量的肽序列 (通常库存肽在-80°c 时保持在 1 mm)。
注: 通常, 肽抗原需要在至少10% 的二甲基亚硫酸 (dmso) 内溶解, 然后慢慢添加到 pbs 中, 以保持可溶性。根据氨基酸序列的不同, dmso 的数量可能需要增加。 - 与肽的方法 h-2kb:ig。在添加肽后, 立即通过添加再生缓冲液, 将溶液带到7.4 的 ph 值。允许中和溶液在4°c 下孵育48小时。
- 浓缩和清洗含肽的 h-2k:ig. 利用具有 50 kda 分子量截止器 (mwco) 的离心式集中器, 按照制造商的指示, 用 pbs 3次清洗含肽的 h-2k:ig 溶液, 浓缩到至少 1 mgml并量化分光光度计上的浓度。
- 准备必要的缓冲区。在去离子水中制备 150 mm ncl 和 15mm na 2co3的溶液, 然后将 ph 值调整为 11.5, 从而制备变性缓冲液。在去离子水中制备 250 mm tris hcl 的溶液, 并将 ph 值调整为 6.8, 从而准备再生缓冲液。
- 将肽序列主动加载到 h-2db:ig 中。
- 准备必要的缓冲区。在去离子水中制备 131 mm 柠檬酸、150 mm 氯化钠和 124 mM2hpo4溶液, 制备变性缓冲液, 然后将 ph 值调整为6.5。在去离子水中制备 120 mm tris hcl 的溶液, 并将 ph 值调整为 8.8, 从而制备再生缓冲液。
注: 通常情况下, 对于1毫克的 h-2db:ig, 它需要约5毫升的变性缓冲液和1毫升的重构缓冲液。 - 变性 h-2db:ig, 以允许增强肽结合。用 pbs 将 h-2db:ig 浓度最终浓度达到 0.5-2 mg\ ml。然后, 用5-10 体积等效的变性缓冲液稀释 h-2db:ig, 使其最终浓度达到100-200μg/ml。
- 在 h-2db:ig 溶液中加入50摩尔过量的肽序列 (通常库存肽在-80°c 时保持在 1 mm), 并允许在37°c 下孵育1小时。
- 加入β2微球蛋白和使用肽的 h-2db:ig。加入2倍摩尔过量的β2微球蛋白。然后, 通过添加再生缓冲液, 使溶液的 ph 值达到7.4。允许中和溶液在4°c 下孵育24小时。
- 浓缩和清洗含肽的 h-2db:ig. 利用离心式集中器与 50 kda mwco, 按照制造商的指示, 用 pbs 3次清洗含肽的 h-2b:ig 溶液, 浓缩到至少 1 mg/ml 并量化分光光度计上的浓度。
- 准备必要的缓冲区。在去离子水中制备 131 mm 柠檬酸、150 mm 氯化钠和 124 mM2hpo4溶液, 制备变性缓冲液, 然后将 ph 值调整为6.5。在去离子水中制备 120 mm tris hcl 的溶液, 并将 ph 值调整为 8.8, 从而制备再生缓冲液。
2. 将 mhc-肽配合物和共刺激分子结合到磁性纳米粒子表面形成纳米粒子抗原呈现细胞。根据粒径和应用情况, 使用三种不同的方法之一。
注: 许多不同的技术可以用来结合蛋白质到粒子的表面。这里描述了3种不同的方法: 氨基包覆颗粒 (步骤 2.1)、n-羟基琥珀酰亚胺 (nhs) 包覆颗粒 (步骤 2.2) 和抗生物包覆颗粒 (步骤 2.3)。这些过程也在发表的两篇论文的方法部分详细介绍了6、7.在生物安全烟罩中执行所有步骤, 并采用无菌解决方案, 以保持库存 aAPC 颗粒的无菌性。
- 对氨基涂层磁性颗粒的涂层抗原特异性和刺激信号 (图 2)。该工艺描述了100纳米、氨基涂层超顺磁性纳米粒子。
注: 将抗体连接到胺涂层颗粒表面的详细协议可以在 https://www.micromod.de/en/technotes-2.html 找到, 在, technote 201 描述了如何硫醇抗体和共轭到马来酰亚胺功能化颗粒和202描述了用马来酰亚胺官能团对氨基涂层颗粒进行功能化所需的过程。在这里, 只有轻微的修改, 只有轻微的修改, mhc-ig 和共同刺激信号附加到这些粒子。- 用 traut 的试剂对抗体进行刺激 (technote 201)。
- 制备 10倍 pbs-乙胺-亚胺四乙酸 (edta) 缓冲液 (0.1 m pbs 和 100 mm edta)。以1:10 的比例将 10倍 pbs-edta 缓冲液添加到抗体中, 以防止添加到抗体中的游离硫醇氧化。
- 在抗体中加入20摩尔过量的 trut 试剂 (2-亚马硫烷), 并在室温下混合孵育2小时。在化学烟气罩内测量 traut 的试剂 (干粉), 以避免呼吸, 因为它将胺基团转化为硫醇基团。
- 使用具有 50 kda mwco 的离心式浓缩器, 用 1x pbs-edta 缓冲液彻底清洗 3次, 并按照制造商的指示进行操作, 浓缩至最终体积 500μl. 使用分 光 光度计。
- 使用硫-(n-马来酰甲基) 环己烷-1-羧酸 (sulfo-smcc, technote 202) 将磁性纳米颗粒上的胺官能团转化为马来酰亚胺基团。
- 以1:10 的比例将 10倍 pbs-edta 缓冲液添加到抗体中。
- 将 sulfo-smcc 溶解在去离子水和涡流中, 在浓度为 1 mg/ml 的情况下重新悬浮。测量化学烟气罩内的硫磺-smcc (干粉), 以避免呼吸, 因为它将胺基团转化为马来酰亚胺基团。
- 为粒子的每平方毫米表面积添加 sulfo-smcc 溶液 0.016 nmol。对于1毫克的100纳米颗粒, 使用0.3 毫克的 sulfo-smcc。允许在室温下反应1.5 小时。
- 用带有磁柱的磁场对 1x pbs-edta 缓冲液清洗颗粒 3次, 并在 1x pbs-edta 缓冲液的500μl 中重新悬浮。
注: 如果使用小于200纳米的粒子, 例如本文中描述的100纳米粒子, 很可能永久磁体的威力不足以拉动这些颗粒用于洗涤或浓缩目的。因此, 要清洗较小的颗粒, 可以使用由铁磁球体组成的磁柱来放大磁场。
- 用硫醇抗体反应马来酰胺功能化颗粒 (technote 201)。
- 将颗粒加入玻璃闪烁小瓶中, 加入一个微型磁搅拌棒, 在磁搅拌板上方仅放置一英寸, 并诱导颗粒溶液的磁性混合。
- 在混合溶液中, 滴注添加硫醇抗体 (每1毫克颗粒为0.5 毫克抗体)。允许在室温下连夜反应。
- 用 1x pbs 缓冲液用磁场清洗 3次, 并在500μl 的 1x pbs 中重新悬浮。在4°c 下贴上标签并存放长达6个月。
注: 当苹果酸功能化颗粒立即与硫代蛋白混合时, 会产生最大的共轭效率。
- 用 traut 的试剂对抗体进行刺激 (technote 201)。
- 对 nhs 涂层磁性颗粒的涂层抗原特异性和刺激信号 (图 3)。这一过程描述了200纳米, nhs 涂层超顺磁性纳米粒子。
- 准备重新悬浮液、淬火缓冲液和存储缓冲液。再悬浮缓冲液为 25 mm 2-(n-吗啡) 乙氨酸 (mes), 0.01% 特温20调整为 ph 6.0。淬火缓冲液是 ph 值7.4 下的 rris-h科尔 100 mm 溶液。存储缓冲液是一个解决方案 10 mm pbs 和 0.01% tween 在 ph 7.4。
- 在再悬浮液缓冲液的1毫升中再悬浮冻干颗粒。涡旋强烈至少 15分钟, 直到没有聚集体是可见的。
- 将磁性颗粒放置在磁性支架上, 以去除上清液, 用 0.5 ml 的再悬浮液重新悬浮, 并转移到玻璃闪烁小瓶中。涡旋, 直到不可见聚合。
- 每1毫克再悬浮颗粒中加入0.1 毫克的总蛋白。涡流在室温下混合和反应2.5 小时, 同时混合。
- 加入0.1 毫升的淬火缓冲液, 在室温下搅拌30分钟。
- 将闪烁小瓶放在磁性支架上, 并清洗颗粒。等待, 直到上清液是明确的删除。从磁性支架上取出颗粒, 添加1毫升的再悬浮缓冲液和涡流, 直到没有聚集体可见为止。重复此过程三次, 并重新悬浮在1毫升的再悬浮缓冲液中的粒子。将颗粒在4°c 下存放长达6个月。
- 对抗生物素涂层磁性颗粒的涂层抗原特异性和刺激信号 (图 4)。该工艺描述了50-100 纳米, 抗生物素超顺磁性纳米粒子。
- 生物素-丁酯 mhc-ig 或共同刺激分子。
- 将 pbs 缓冲液中的蛋白质浓度调整为 0.5-2 mg/ml。在去离子水中, 以 10 mgml 的浓度重新注射磺酸-nhs-生物素, 并在刺激抗体中添加20倍的摩尔过量。在室温下孵化45分钟。
- 使用带有 50 kda mwco 的离心式浓缩器, 用 pbs 彻底清洗 3次, 按照制造商的指示进行浓缩, 直到最后体积 500μl. 使用分光光度计测量抗体溶液的浓度。
- 将生物素化的 mhc-ig 和/或共刺激信号结合到抗生物素纳米颗粒中。对于500μl 的股票抗生物素颗粒, 加入 0.5 nmol 的刺激抗体, 并在4°c 孵育过夜。
- 清洗共轭 aAPC 纳米颗粒。因为这些颗粒小于200纳米, 湿磁柱, 并把一个磁性支架。
- 将部分/蛋白质悬浮液添加到色谱柱中。允许所有的蛋白质颗粒完全进入色谱柱。
- 通过三次在列中添加 0.5 ml 的 pbs 进行清洗。
- 通过从磁支架上取下柱, 在柱中加入 0.5 ml 的 pbs, 并使用柱塞, 将颗粒 aAPCs 排出玻璃闪烁小瓶。将颗粒在4°c 下存放长达6个月。
注: 颗粒在4°c 时稳定 (不应冻结) 长达6个月。较高的温度会降低粒子的功能, 并观察到一些粒子聚集 (未显示数据)。不要长时间在室温下保存, 因为这会显著降低颗粒的保质期。
- 生物素-丁酯 mhc-ig 或共同刺激分子。
3. 利用荧光抗体检测技术鉴定人工抗原呈现细胞纳米粒子的蛋白质含量。
注: 这是一个有用的质量控制所产生的人工抗原呈现细胞。此外, 刺激信号的量用于在批次和各种 aAPC 类型 (例如, 不同大小) 中产生等效 aAPC 剂量。
- 测量涂层 aAPCs 的颗粒浓度。
- 使用库存溶液中的非共轭颗粒, 在96孔平底组织培养板上, 在96孔的平底组织培养板上, 在 pbs 溶液中进行1:2 滴定法, 每口井100μl。
- 在405纳米的平板阅读分光光度计上读取粒子, 从已知的粒子浓度创建一个标准曲线。
- 取一个共轭 aAPCs 的样本, 在 pbs 中稀释到100μl 的总体积, 并在分光光度计上阅读。
- 取出已制作的 aAPCs 样品, 并用荧光抗体染色。
- 要计算要去除的样本量, 请估计粒子表面的抗体数量。
注: 对于这些技术, 假定颗粒表面积的密度约为1000个抗体.为了能够检测到荧光, 每次荧光测试总共需要大约 1011个mhc-ig 或 cd28 分子。 - 在 pbs 中使 aAPCs 的总体积达到 100μl, 在1:100 稀释时添加染色抗体, 在4°c 时孵育1小时。
注: 成功使用的抗体示例是 fitc 共轭鼠抗小鼠 ig 1, 2, 3 光链, 克隆 r26 46 检测 mhc-ig, 和 fitc 共轭共轭小鼠抗阿门尼安叙利亚仓鼠 igg, 克隆 g192-1, 检测抗小鼠 cd28。
- 要计算要去除的样本量, 请估计粒子表面的抗体数量。
- 清洗颗粒并在荧光板读取器上读取荧光。
- 磁洗 (如步骤2所述) 染色 aAPC 分数三次与0.5 毫升的 pbs。
- 用0.5 毫升的 pbs 清洗洗过的 aAPCs。
- 在96英寸厚的平底板中加入100μl 的洗脱 aAPCs, 使用步骤3.1 中的吸收率读取浓度。
- 取剩余的 400μl, 分成两个 200μl aliquots, 并添加到两个井在一个黑色, 聚苯乙烯96井, 平底板。以1:2 比的比例在板下的钛率通过采取100μl 的溶液和混合的下一个井, 有100μl 的 pbs 在每个井至少四次。
注: 测量的平均多次复制, 以减少测量中的噪声。 - 在同一黑色96井板上, 通过在 pbs 200μl 的井中添加1:200 时的荧光抗体的标准曲线, 并在至少12口井的1:200 比下拉下。
- aAPC 和荧光抗体都在板上后, 用荧光板读取器读取板。
- 计算每个粒子的蛋白质量。通过将数值与已知抗体浓度的标准曲线进行比较来确定抗体的浓度, 假设检测到的抗体的染色抗体的比例为1:1。然后将检测到的抗体浓度与吸收率测定的颗粒浓度分开, 将给出每个颗粒的抗体数量。
4. 利用制备的纳米粒子人工抗原培养细胞, 丰富抗原特异性 cd8 + t 细胞。
- 分离 cd8 + t 细胞。
- 通过接触异氟醚, 然后对动物进行安乐死, 然后进行宫颈脱位。
- 从野生性 c57bl/6j 小鼠中取出脾脏和淋巴结, 并放入 pbs 溶液中。通过无菌的70μm 细胞过滤器对器官进行 mac, 并通过频繁清洗 pbs 的细胞过滤器对细胞进行清洗。
- 要消除非 cd8 + t 电池, 请使用无接触 cd8 + t 电池隔离套件, 并按照制造商的说明进行操作。
注: 每个抗原条件需要至少 3 x10 6 cd8 + t 细胞。
- 加入纳米粒子 aAPCs 与 cd8+ t 细胞结合。
- 隔离后, 用0.5% 的牛血清白蛋白 (bsa) 和 2 mm edta 浓缩到 pbs 中的100μl 体积。
- 根据每 10个 6个 cd8 + t 细胞的 10 11个 apc 结合、含肽的 mhc-ig 的比率计算, 确定要添加的 aAPCs的数量。
- 在4°c 下培养 aAPC 颗粒和 cd8 + t 细胞 1小时, 并在无菌的5毫升聚苯乙烯圆底管中持续混合。
- 制备补充培养基和 t 细胞生长因子 (tcgf), 以培养 cd8 + t 细胞。
- 对于补充培养基, 补充完整的 rpmi 1640 培养基 (含谷氨酰胺), 配上1x 非必需氨基酸、1x 丙酮酸钠、0.4倍维生素溶液、92μm 2-硫醇、10μm 环丙沙星和10% 的胎牛血清 (fbs)。
- 要制作 tcgf, 请遵循此处已经建立并引用的协议9。
注: tcgf 是人体免疫细胞因子的内部鸡尾酒, 对于为 t 细胞提供生长所需的额外刺激信号至关重要。tcgf 可被交换为已知的 t 细胞刺激细胞因子, 如白细胞介素-2, il-7, 或 il-15;然而, 每个可能会相应地分化 t 细胞的反应。本文所述的协议尚未使用这些鸡尾酒进行优化;因此, 如果 tcgf 没有与列出的例子 10,11,其他技术咨询浓度和组合。
- 清洗和浓缩 aAPC 和 cd8 + t 细胞混合物。
- 如步骤2中所述, 清洗磁性粒子 aAPCs。但是, 先使用 0.5% bsa 和 2 mm edta 的 pbs 缓冲液, 使用补充介质, 第三次使用 1% tcgf 的补充介质。
- 在500μl 的补充培养基中, 用 1% tcgf 提取 aAPCs 和浓缩 cd8 + t 细胞。
- 用血细胞计和板在 96 u 型底板中计数 96 u 型底板, 每井补充 1% tcgf 的培养基, 浓度为 2.5 x 10 5 cd8 + t细胞。
- 如果使用表面只有含肽的 mhc-ig 的 aAPCs 进行隔离 (没有共刺激信号), 则完成步骤4.5。如果使用表面含有肽的 mhc-ig 和共同刺激信号的 aAPCs 进行隔离, 则继续执行步骤5。
- 将表面覆盖着共刺激信号的磁性颗粒添加到浓缩分数中, 并添加磁场, 共同聚集 t 细胞表面的刺激信号。
- 在浓缩分数中, 添加刺激抗体的数量, 并增加粒子上的肽负载 mhc-ig 的数量, 这取决于要控制的应用, 请参见有关 aAPC 特性的部分)。
- 允许共同刺激磁性颗粒在4°c 时与浓缩的 cd8 + t 细胞结合1小时。
- 将培养板放置在两个长1.9 厘米 (0.75 英寸) 的镉 n52 圆盘磁体之间, 加入磁场。
注: n52 磁盘磁体具有非常强的磁场。既要注意在磁体之间用间隔储存它们, 因为很难从彼此身上取出, 也很难把它们放在培养板上。为了最大限度地减少磁铁粘附在孵化器的金属部件上, 将其放置在底部和顶部的50毫升锥形管泡沫塑料容器中。
5. 利用制备的纳米粒子人工抗原培养细胞扩大和检测抗原特异性 cd8 + t 细胞。
- 在加湿 5% co 2、37°c 孵化器中加入 96个 u 型底井板和 aAPCs 和 cd8 + t 细胞, 为期 3天.第3天, 用每口80μl 的补充培养基给细胞喂食2% 的 tcgf, 然后重新放入孵化器中, 直到第7天。
- 在第7天, 收获被刺激的细胞成一个5毫升圆底管计数。
- 一旦所有的溶液被收获, 旋转收获的细胞, 以重新悬浮在0.5 毫升的 pbs 与0.05% 的钠氮化和2% 的 fbs。用色氨酸蓝色染色, 并指望血细胞仪, 计数活细胞。
- 将50000-50000 计数细胞取出到两个新的5毫升圆底管中, 用于抗原特异性染色。一个管将用于同源肽-mhc 染色, 另一个管将用于非同源染色, 以确定背景染色。
- 在 pbs 100μl 中加入1μg 的生物酰化 mhc-ig (使用步骤2中描述的技术), 用0.05% 的氮化钠和2% 的 fbs 与大纤维化氰氨酸 (apc) 共轭大鼠抗小鼠 cd8a, 克隆 53-6.7 (稀释率1: 100) 在4°c 下为1小时。
- 添加次生链球菌素和活的死渍。用 pbs 离心清洗多余的生物素化 mhc-ig。然后在4°c 下, 用1:350 比例的植物菊酯 (pe) 标记链霉素和1:350 比例染色, 在4°c 时, 用活活固定的绿色死细胞染色15分钟。
- 阅读流式细胞仪上的所有样本, 以确定抗原特异性细胞的特异性和数量。
- 用100% 的氮化钠和2% 的 fbs 离心清洗多余的次生和活-死染色, 并用150μl 的 pbs 缓冲液重新悬浮, 在流动细胞仪上阅读。
- 使用数据分析软件确定抗原特异性单元的数量和百分比。
- 要确定抗原特异性细胞的百分比, 请按相应顺序使用以下门, 分别为活 +、淋巴细胞 + (按侧向散射散射)、cd8 + 和 dier +。通过比较非同源与同源染色来确定 dier + 门。
- 通过从非同源 mhc-ig 染色中减去同源 mhc-ig 染色的 dier + 百分比, 确定样本中抗原特异性细胞的百分比。
- 使用抗原特异性细胞的这一百分比, 将其乘以计数的细胞数, 从而产生因富集和膨胀而产生的抗原特异性细胞的数量。
注: 必须在流式细胞仪上设置补偿, 因为与该面板中使用的荧光体有光谱重叠。
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Representative Results
为了成功地富集和扩展抗原特异性 t 细胞, 应成功地将含肽的 mhc-ig 和共刺激分子附着在 aAPC 粒子上。基于3种粒子连接方法, 我们为成功的共轭过程结果提供了一些有代表性的数据 (图 5a)。事实上, 如果配体密度太低, 那么在我们的经验中, 抗原特异性 cd8 + t 细胞就不会发生在100纳米以上配体之间的线性间距附近 (图 5b)7。
除了定量荧光抗体读出和转基因 cd8 + t 细胞扩张外, 纳米粒子 aAPCs 还可以通过掺杂在同源抗原抗原特异性 cd8 + t 细胞中进行质量控制。这可以通过从转基因小鼠 (如 pmel 鼠标) 中分离 cd8 + t 细胞来实现, pmel 小鼠具有 gp100 特异性抗原特异性 cd8 + t 细胞, 并以1:1000 的比例掺杂到 b6 背景中。浓缩前后的计数和染色允许对褶皱富集 (图 6a) 和百分比回收率 (图 6a) 进行枚举 (图 6a)6。在这些具有代表性的结果中, 我们证明信号1只有 aAPCs 提供最有效的浓缩 (近 10倍) 和大约80% 的细胞恢复, 这比传统信号1和 2 aAPCs 在粒子上具有非特异性抗 cd28 的增强也是如此。
一旦粒子 aAPCs 有了充分的特征和质量控制, 就可以用于野生小鼠罕见抗原特异性 cd8 + t 细胞的富集和扩展。为了获得准确的结果, 必须有功能性检测试剂, 如生物素化二聚体。生物素化二聚体的质量控制也可以在转基因 cd8 + t 细胞上进行, 以验证染色情况。在这里, 代表性的结果显示, 以 b6 cd8 + t 细胞为背景对照的 gp100 特异性 cd8 + t 细胞呈阳性染色 (图 7)。图 7还表明, 如果生物素化二聚体的水平过高, 那么它将降低其亲和力, 因为它将与自身竞争并表现出单价结合。
在小鼠 cd8 + t 细胞富集和膨胀7天后, 人们可能会预期 5% 至 50% 的抗原特异性 cd8 + t 细胞, 在每个条件从 5 x10 6 cd8 + t 细胞开始后, 有将近 20, 000 至 200, 000个抗原特异性 cd8 + t 细胞(图 8)6. 具体而言, 在对抗原特异性 cd8 + t 细胞进行染色时, 了解生物素化二聚体的背景染色是至关重要的, 在这种情况下, 它是 4.15;同源染色中任何低于此百分比的百分比都被认为是负面结果 (图 8a)。此外, 这将显示在何处绘制流式细胞仪门, 以确定抗原特异性 cd8 + t 细胞的实际百分比。这在抗原特异性 cd8 + t 细胞没有不同的群体 (如图 8a所示), 但可能显示为广泛的涂片的情况下很重要。
同样的过程也可用于分离和刺激人类抗原特异性 cd8 + t 细胞。类似的质量控制和结果也应看到, 抗原特异性 cd8 + t 细胞的百分比和数量在富集后仅膨胀一周后就显著增加 (图 9)5。
图 1: 利用纳米粒子人工抗原呈现细胞进行抗原特异性富集和膨胀过程的示意图.首先, 完成无接触 cd8 + t 细胞隔离。然后, 在 cd8 + t 细胞中添加纳米粒子 aAPCs。富含磁场、培养和刺激 aAPCs。最后, 用流式细胞仪检测富集和扩展抗原特异性 cd8 + t 细胞。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 将含肽的 mhc-ig 和共刺激分子结合到氨基包覆磁性颗粒表面的原理图.简单地说, 硫-smcc 交联剂是用马来酰亚胺官能团对磁粉表面进行功能化的。mhc-ig 和共刺激分子与 traut 的试剂同时功能化, 以产生硫醇功能基团。激活的粒子和蛋白质信号一起反应, 然后清洗产生抗原特异性的人工抗原呈现细胞磁性纳米粒子。这个数字是根据我们实验室在《纳米信件7》中发表的补充材料修改的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 将含肽的 mhc-ig 和共同刺激分子结合到 nhs 涂层磁性粒子表面的原理图.简单地说, nhs 包覆颗粒与含肽的 mhc-ig 和共刺激分子一起反应, 然后清洗以产生抗原特异性的人工抗原呈现细胞磁性纳米粒子。这个数字是根据我们实验室在《纳米信件7》中发表的补充材料修改的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 将含肽的 mhc-ig 和共刺激分子结合到抗生物素包覆磁性颗粒表面的原理图。mhc-ig 和共刺激分子与 nhs-bibin 功能化, 产生生物素功能基团.然后, 抗生物素包覆颗粒与功能化的含肽的 mhc-ig 和共刺激分子发生反应。之后, 对这些颗粒进行洗涤, 以产生抗原特异性的人工抗原呈现细胞磁性纳米粒子。这个数字是根据我们实验室在《纳米信件7》中发表的补充材料修改的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 共轭效率对于抗原特异性 t 细胞的富集和扩展至关重要.(a) 具有代表性的数据, 说明与三种共轭方法的共轭效率, 三种不同的基磁性颗粒在纸上描述: 氨基包覆颗粒, nhs 涂层颗粒, 和抗生物包覆粒子。每个数据点代表不同的粒子制备技术, 误差条表示 s. e. m. (b) 配体密度如何影响转基因 cd8 + t 细胞刺激, 其中配体密度表示为600纳米配体之间的线性间距nm 和 50 nm aAPCs (n = 5 和误差条表示 s. e. m.)。这个数字是根据我们实验室在《纳米信件7》中的出版物修改的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: aAPC 浓缩的质量控制.将转基因 pmel gp100 特异性 cd8 + t 细胞以1:1000 的比例掺杂到野生 b6 cd8 + t 细胞中。(a) 在浓缩后, 用流式细胞仪对同源标记 thy1.1 和 cd8 进行了折叠浓缩。这里是一个比较信号1仅加载 gp100 或 db-ig, 传统信号1和2粒子或 db-ig 加载 gp100 和反 cd28, 和非同源信号1和2粒子。(b) 在每种方法之前和之后还对细胞进行计数, 以衡量细胞的恢复情况。数据代表三个独立的实验, 误差条代表 s. e. m. 数据的组合, 用单向方差分析与 tukey 的后测试 (*p& lt;0.05、** p& lt;0.01) 进行了测量。这个数字是根据我们实验室在《纳米快报》6中的出版物修改的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 生物素化二聚体的质量控制.gp100 特异性 cd8 + t 细胞从转基因 pmel 小鼠中分离, 并在100μl 的 pbs 中染色, 三种浓度的生物素化 db-ig 富含 gp100 和 apc 抗 cd8a, 使用通配型 b6 cd8 + t 细胞作为阴性对照。请点击这里查看此图的较大版本.
图 8: 抗原特异性 cd8 + t 细胞的富集和扩展.b6 型 cd8 + t 细胞仅用信号 1 (装有 trp2 的 kb-ig) 或信号1和 2 (装有 trp2 的 kb-ig 和与粒子表面共轭的反 cd28) 进行了浓缩。然后将信号2添加到信号1的富集部分中, 只培养所有细胞7天。(a) cd8 + t 细胞被染色并在活的/死荧光染色上打开门控, 然后是门控 cd8 + 和 kbtrp2 +, 并与非同源 kb-ig 进行比较, 以检测抗原特异性 cd8 + t 细胞。(b) 因此可以确定 trp2 特异性 cd8 + t 细胞的百分比和数量, 其中可以从信号1唯一浓缩方法检测到抗原特异性 cd8 + t 细胞的较高百分比和数量 (n何 t7, 误差条代表标准偏差,双尾配对 t 测试 *p & lt; 0.05, * *p & lt; 0.01)。这个数字是根据我们实验室在《纳米快报》6中的出版物修改的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 9: 丰富和扩大人类抗原特异性 cd8 + t 细胞.(a) 富集前第0天的代表性流式细胞仪图显示了丰富和扩大传统纳米颗粒 aAPCs 的健康捐献者的抗原特异性 cd8 + t 细胞的巨大影响, 其中 aAPCs 装有 ny-eso1 和 aAPCs中显示了含有 mart1 抗原的内容。(b) 这在第7天产生抗原特异性 cd8 + t 细胞的高百分比 (~ 10-20) 和数量 (0.5-1 x106) (n = 3 来自独立捐献者, 误差条代表 s. e. m.)。这一数字已从我们实验室在 acs nano 5 上的出版物中得到修改。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
我们创造了一种基于纳米粒子人工抗原呈现细胞 (aAPCs) 的抗原特异性 t 细胞分离技术。纳米粒子 aAPCs 表面含有含肽的 mhc, 可在共同刺激激活的同时, 实现抗原特异性 t 细胞的结合和激活。aAPCs 也是顺磁性的, 因此可以利用磁场来丰富罕见的抗原特异性 t 细胞。我们对纳米颗粒的尺寸、配体密度、配体选择及其对结合、富集、活化和细胞富集的影响等关键特性进行了优化和研究 (补充文件 1-box 1)。
因此, 富集和膨胀过程导致抗原特异性 cd8 + t 细胞膨胀的几千倍产生抗原特异性的百分比高达 60%, 可用于小鼠和人类环境 (补充文件 2-box 2).抗原特异性 t 细胞的如此多和百分比如此之高, 从而能够描述对疾病 (如癌症、自身免疫等) 的免疫反应, 从而能够发现新的免疫靶点和机制, 并提供了获得这种特性和机制的机会。用于采用免疫治疗。一个特定应用的例子是对患者的肿瘤进行排序, 识别突变, 从突变序列中找到潜在的 mhc-粘合剂, 用这些顶级候选抗原产生 aAPCs, 然后利用 aAPCs 来确定患者是否有任何肿瘤特异性新抗原。
事实上, 方法上的限制一直是研究和确定抗原具体对策的主要障碍。目前的技术 (a) 需要大量的时间和工作密集的程序, (b) 在维持细胞系方面存在困难, 例如需要收集自体树突状细胞, (c) 需要在获得结果之前进行数周的 t 细胞扩张, (d) 结果在低特异性 (1-2%) 和抗原特异性 cd8 + t 细胞数量少, (e) 往往具有显著的背景信号, 和 (f) 产生的 cd8 + t 细胞往往不能在进一步的检测中使用或研究。一种方法要求在 elispot 之前用抗原进行免疫, 以表征是否存在抗原特异性反应14、15、16、17。另一种利用 tandem-微基因表达质粒转染抗原呈现细胞的方法要求多用具有细胞因子 + 反应 (如 ifnγ) 的四人污渍来提高灵敏度18。即使肽脉冲内源性抗原呈现细胞在体外培养, 只有结果导致抗原特异性增加 0.5% 15。
我们的方法解决了这些方法上的限制, 因此可以作为诊断和治疗工具。确保抗原特异性 cd8 + t 细胞富集和膨胀的关键步骤是: 1) 有效地加载带有肽抗原的 mhc-ig, 2) 将共轭刺激信号连接到纳米粒子表面, 3) 将粒子与 t 细胞结合, 4) 使细胞结合在一起, 使细胞结合在一起。具有磁场的纳米粒子, 5) 在培养中扩展洗脱的纳米粒子结合 t 细胞, 6) 在第7天用生物素化、含肽的 mhc 检测抗原特异性 cd8 + t 细胞。
富集和膨胀协议中出现的主要问题要么是生产不当, 要么是检测试剂过期, 要么是纳米粒子 aAPCs。通过对转基因抗原特异性 cd8 + t 细胞的检测, 确保生物素化二聚体可以染色抗原特异性 cd8 + t 细胞。如果肽-mhc-ig 没有相应的转基因小鼠模型, 加载阳性对照肽并测试阳性对照以验证负载可能会有所帮助。然而, 有些肽可能不会加载到 mhc-ig;这可以用 mhc 加载算法 (如 net-mhc) 进行模拟, 也可以通过基于 rmas 细胞的检测13 进行实验模拟。aAPC 颗粒稳定性可能会在6个月后降低, 因此, 如果富集和膨胀结果有一定的变异性, 则可以进行另一种荧光板读取器检测, 以验证其稳定性。
在今后的工作中, 我们的目标是扩展检测的功能、广度和深度。我们正在努力提高吞吐量和在96孔板格式下同时研究的多种抗原的多重能力。目前, 一个主要的局限性是只能同时研究少数抗原。我们正在研究粒子 aAPC 的大小和配体密度是如何影响富集的。此外, 我们正在研究不同的细胞组合物如何影响 cd8 + t 细胞在培养中的扩张。最后, 我们的目标是在 mhc ii 级中模拟这一技术, 以便能够丰富和扩大抗原特异性 cd4+ t 细胞。
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Disclosures
作者声明了以下相互竞争的经济利益: 根据 neximune 与约翰·霍普金斯大学之间的许可协议, jonathan schk座有权获得该大学在本文件中所述产品销售方面获得的版税份额。文章。他也是 neximune 的创始人, 并在该公司拥有股权。他是 neximmune 董事会和科学咨询委员会的成员。约翰·霍普金斯大学根据其利益冲突政策审查并批准了这些安排的条款。
Acknowledgments
j. w. h. 感谢约翰·霍普金斯生物技术研究所的 nih 癌症纳米技术培训中心、国家科学基金会研究生研究金 (dge-1232825) 和 arcs 研究金支助基金会。这项工作得到了国家卫生研究院 (p01-a072677、r01-ca108835、r21-c185819)、tedco/to01 创新倡议和库尔特基金会 (jps) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 551263 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig | BD Biosciences | 551323 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 550750 | |
| Vivaspin 20 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932362 | |
| Vivaspin 2 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932257 | |
| Purified Human Beta 2 Microglobulin | Bio-Rad | PHP135 | |
| nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles | Micromod | 79-01-102 | |
| Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm | Ocean Nanotech | SN0200 | |
| Anti-Biotin MicroBeads UltraPure | Miltenyi | 130-105-637 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | |
| Sulfo-SMCC Crosslinker | ProteoChem | c1109-100mg | |
| 2-Iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 Sigma | |
| 96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene | Corning | 3875 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain Clone R26-46 | BD Biosciences | 553434 | |
| FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG Clone G192-1 | BD Biosciences | 554026 | |
| B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice | Jackson Laboratory | 005023 | |
| C57BL/6J (B6 wildtype) mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi | 130-104-075 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE | Biolegend | 405203 | |
| N52 disk magnets of 0.75 inches | K&J Magnetics | DX8C-N52 | |
| APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 | Biolegend | 100711 | |
| LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation | ThermoFisher | L-34969 |
References
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