Summary
抗原特異的 T 細胞は特性またはその極低周波による治療を利用しにくい。本明細書で我々 はこれらの細胞を豊かにする抗原特異的 T 細胞に結合することができます磁性粒子を開発するためのプロトコルを提供し、それらをいくつか展開する特性評価および治療の両方の 100 倍。
Abstract
両方豊かにし、抗原特異的 T 細胞を拡大するツールを開発しました。これは A) 抗原特異的 T 細胞の存在を検出、B) 抗原特異的応答のダイナミクスのプローブ、C) を理解するよう場合に有用することができます抗原特異的応答など自己免疫疾患の状態に影響を与える、どのように D) 分かり異種抗原特異的 T 細胞、または E の応答) は、抗原特異的細胞療法を利用します。ツールは、抗原特異的および T 細胞共刺激シグナルを共役我々 ことと人工抗原提示細胞 (aAPCs) として長期的に磁性粒子に基づいています。その結果、技術は生成に簡単です、のでそれが簡単に採用される; 他の所でしたがって、本研究の目的は作製と、aAPCs の後の使用について詳しく説明します。我々 は、aAPCs に特定の抗原、共刺激シグナルを添付する方法、抗原特異的 T 細胞を豊かにするそれらを活用する方法と抗原特異的 T 細胞を拡張する方法について説明します。さらに、我々 は設計の考慮事項は、抗原特異的 T 細胞を特徴と私たちの経験の実験的および生物学的情報に基づくを強調表示されます。
Introduction
多くの免疫療法の上昇、特性し、免疫応答を制御することができる必要があります。特に、適応免疫応答は、関心の特異性とセルの耐久性のためです。最近では、キメラ抗原受容体の T 細胞療法がん治療として承認されましたしかし、抗原受容体は、がん1に固有の抗原ではなくに一般的な細胞表面抗原 CD19、オフに基づいています。を超えて、特異性免疫療法もコントロール、および限られたがんや自己免疫疾患に免疫応答を理解の欠如から苦しむことができます。
抗原特異的応答の研究の課題の一つは、超低周波、 e.g。、抗原特異的 T 細胞がすべての 10 の 14 106 T 細胞2,3。したがって、T を調査する細胞が存在または応答して、セルを充実・拡大し、する必要がありますまたはその信号を増幅する必要があります。高価、抗原特異的細胞の拡大に焦点を当てた現在の技術を使用してフィーダー細胞を維持することは困難です。抗原特異的 T の信号増幅に焦点を当てた現在の技術細胞、酵素 immunospot (しなさい) 試金のようなこれらの T 細胞4の再利用を制限します。最後に、感度が低いためしばしばこれらの 2 つの手法組み合わせることが必要抗原特定の列挙。
これらの問題に対処するため、磁性ナノ粒子を用いた人工抗原提示細胞 (aAPC)5,6,7、8を開発しました。AAPC は抗原特異的信号ペプチド ロード主要組織適合遺伝子複合体 (pMHC) と共刺激分子修飾することができます例えば、抗 CD28 抗体-抗原特異的 T 細胞を豊かにし、その後。(図 1) の拡大を刺激します。粒子は、抗原特異的刺激に合わせてカスタマイズまだ実験と患者全体で標準化することができますコスト効果の高い市販製品をすることができます。濃縮および拡張を実行する抗原特異的 cd 8 + T 細胞の数千倍の拡大に何百もの結果の処理、周波数で起因できる特性や大型の治療上の使用を有効にするちょうど 1 週間後に 60%セルの数。ここ、ナノ粒子 aAPCs、ナノ粒子のプロパティを選択する際にいくつかの重要な設計の考慮事項を確認する方法について説明し、これらの粒子を分離すると、希少な抗原特異的 cd 8 + T 細胞の拡大を利用してからいくつかの典型的な結果を示します。
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Protocol
すべてのマウスは、ジョンズ ・ ホプキンス大学の制度検討委員会によって承認されたガイドラインに従って維持されました。
1. 目的の抗原ペプチド配列と二量体の主要組織適合抗原免疫グロブリン融合蛋白質 (MHC Ig) をロードします。
注: H-2 Kb を使用している場合: Ig、次手順 1.1; で詳細なプロトコルH を使用している場合-2Db:Ig、次のステップ 1.2 詳細なプロトコル。
- アクティブなペプチッド シーケンスに H、2 Kb の読み込み: Ig。
- 必要なバッファーを準備します。脱イオン水で 150 mM の NaCl と 15 mM Na2CO3の溶液を作ると、11.5 に pH を調整することによって変性バッファーを準備します。脱イオン水で 250 mM トリス塩酸の溶液および 6.8 pH の調整によって下のバッファーを準備します。
注: 通常、必要になります約 5 mL 変性、下の両方のバッファーの 1 mg の H、2 Kb: Ig。 - H-2 Kb を変化させなさい: 強化されたペプチド結合を許可する Ig。H 2 Kb をもたらす: 0.5-2 の間に免疫グロブリン濃度 mg/リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で mL。H 2 Kb を希釈して: 5-10 ボリューム相当する変性バッファーし、15 分間室温でインキュベートすることで 100-200 μ G/ml の最終的な集中のイグ。
- ペプチドのモル超過分 50 を追加シーケンス (通常在庫ペプチドは-80 ° C で 1 mM に保たれて) H-2 Kb に: Ig ソリューション。
注: 通常ペプチド抗原の少なくとも 10% に溶解する必要はジメチルスルホキシド (DMSO) し、水溶性のままに PBS にゆっくりと追加。アミノ酸シーケンスに応じて DMSO の量が増加する必要があります。 - Renature H-2 Kb: ペプチドと Ig。下のバッファーを追加することによって pH 7.4 にソリューションをもたらす、ペプチド添加の直後します。中和のソリューションを 4 ° C で 48 時間インキュベートします。
- 集中させ、ペプチド ロード H 2 Kb: Ig 50 kDa の分子量カットオフ (MWCO) と遠心濃縮器を利用したペプチド ロード H-2 Kb を洗浄する製造元の指示に従ってください: Ig ソリューション 3 回 PBS、少なくとも 1 mg/mL に集中。分光光度計で濃度を定量化します。
- 必要なバッファーを準備します。脱イオン水で 150 mM の NaCl と 15 mM Na2CO3の溶液を作ると、11.5 に pH を調整することによって変性バッファーを準備します。脱イオン水で 250 mM トリス塩酸の溶液および 6.8 pH の調整によって下のバッファーを準備します。
- アクティブな H にペプチッド シーケンスの読み込み-2Db:Ig。
- 必要なバッファーを準備します。脱イオン水でクエン酸 131 mM、150 mM の NaCl と 124 mM Na2HPO4溶液を作ると、6.5 に pH を調整することによって変性バッファーを準備します。脱イオン水で 120 mM トリス塩酸の溶液および 8.8 pH の調整によって下のバッファーを準備します。
注: 通常は、それが必要になります変性バッファーと下のバッファー 1 mL 約 5 mL H の 1 mg の-2Db:Ig。 - H を変化させなさい-強化されたペプチド結合を許可する 2Db:Ig。H をもたらす-0.5-2 の最終的な集中に 2Db:Ig 濃度 mg/mL の PBS の。その後、希釈 H-2Db:Ig 最終濃度 100-200 μ G/ml 変性バッファーの 5-10 ボリュームに相当します。
- ペプチドのモル超過分 50 を追加シーケンス (通常在庫ペプチドは-80 ° C で 1 mM に保たれて) H-2Db:Ig ソリューション、37 ° C で 1 時間インキュベートすること
- Β 2 ミクログロブリンと renature H を追加-ペプチド 2Db:Ig。Β 2 ミクログロブリンの 2 倍モル超過を追加します。その後、下のバッファーを追加することによって pH 7.4 にソリューションをもたらします。中和のソリューションを 4 ° C で 24 時間インキュベートします。
- 集中させ、ペプチド ロード H-2Db:Ig. 50 kDa、MWCO と遠心濃縮器を利用したペプチド ロード H-2 Kb を洗浄する製造元の指示に従ってください: Ig ソリューション、PBS で 3 回少なくとも 1 mg/mL に集中し、定量化、分光光度計の濃度。
- 必要なバッファーを準備します。脱イオン水でクエン酸 131 mM、150 mM の NaCl と 124 mM Na2HPO4溶液を作ると、6.5 に pH を調整することによって変性バッファーを準備します。脱イオン水で 120 mM トリス塩酸の溶液および 8.8 pH の調整によって下のバッファーを準備します。
2. 共役ペプチド-MHC 複合体、磁性ナノ粒子の表面に共刺激分子ナノ人工抗原提示細胞を形成します。粒子サイズとアプリケーションに応じて 3 つの異なる方法のいずれかを使用します。
注: 粒子の表面に蛋白質の共役するさまざまなテクニックの数を使用できます。3 種類の方法の説明ここで、: アミン被覆粒子 (ステップ 2.1) N ヒドロキシスクシンイミド (NHS)-被覆粒子 (ステップ 2.2) と反 biotin 被覆粒子 (ステップ 2.3)。これらのプロセスは、2 つの論文公開6、7の方法セクション内で詳細に記載されています。バイオ セーフティ発煙のフード滅菌ソリューション株式 aAPC 粒子の無菌性を維持するすべての手順を実行します。
- アミン被覆磁性粒子 (図 2) に抗原特異的および刺激信号をコートします。この手順は 100 nm、アミン被覆超常磁性ナノ粒子。
注: アミン被覆粒子の表面に抗体を取り付けるための詳しいプロトコルにあります https://www.micromod.de/en/technotes-2.html、Technote 201 がどのようにチオレート抗体と共役したマレイミドを施してへについて説明します粒子と 202 は、マレイミド官能基を持つアミン被覆粒子の高機能化に必要なプロセスを説明します。ここでは、MHC Ig とこれらの粒子に接続されている共刺激シグナルだけのわずかな変更が強調表示されます。- チオレート トラウトの試薬 (Technote 201) と抗体。
- PBS エチレンジアミン四酸 (EDTA) バッファー (0.1 M PBS と 100 ミリメートルの EDTA) x 10 を準備します。PBS-EDTA バッファー x 10 抗体を加える、1:10 で抗体に追加無料のチオール基の酸化を防ぐために比率。
- 抗体にトラウトの試薬 (2-iminothiolane) のモル超過分 20 を追加し、混合室内温度で 2 時間インキュベートします。チオール基にアミン グループを変換する呼吸を避けるために化学の発煙のフード内でトラウトの試薬 (粉末) を測定します。
- X 3 回は遠心濃縮器を用いた 50 kDa MWCO、PBS EDTA バッファー 1 で徹底的に洗浄し、500 μ L の最終巻測定による抗体溶液の濃度までを集中して、製造元の指示に従って、分光光度計。
- Sulfosuccinimidyl 4-(N maleimidomethyl) を使用したマレイミド グループへ磁気ナノ微粒子のアミン官能基を変換するシクロヘキサン-1-カルボン酸 (スルホ SMCC、Technote 202)。
- PBS-EDTA バッファー x 10 抗体を加える、1:10 で粒子の比。
- 1 Mg/ml の濃度で再懸濁しますに脱イオン水と渦のスルホ SMCC を溶解します。マレイミド グループにアミン グループを変換する呼吸を避けるために化学の発煙のフード内スルホ SMCC (粉末) を測定します。
- 粒子の表面積毎平方ミリメートルのスルホ SMCC ソリューションの 0.016 nmol を追加します。100 nm 粒子の 1 mg は、スルホ SMCC の 0.3 mg を使用します。室温で 1.5 h の反応することができます。
- 3 回磁気列を持つ磁場を使用して PBS EDTA バッファー x 1 の粒子を洗浄し、500 μ L の PBS EDTA バッファー × 1 で再懸濁します。
注: 場合は 200 より小さい粒子を用いた nm、100 nm の粒子が記載など、最も可能性の高い永久磁石されません水洗または目的を集中して粒子を引くに十分な強力な。したがって、小さい粒子を洗浄するのにには、磁場を増幅するのに強磁性球から成る磁気列を使用します。
- チオール抗体 (Technote 201) マレイミド修飾粒子に反応します。
- シンチレーション バイアルに粒子を追加、ミニ磁気攪拌棒を追加、ちょうどインチ電磁攪拌プレートの上に配置、磁気粒子溶液の混合を誘発します。
- 混合溶液に滴下チオール抗体 (粒子のすべての 1 mg の抗体の 0.5 mg) を追加します。室温で一晩反応できるようにします。
- 3 回磁場を利用した 1 × PBS バッファーで洗浄し、500 μ L の 1 × PBS に再懸濁します。ラベル付けし、4 ° C で最大 6 ヶ月間保存します。
注: 最大活用効率は、マレイミド修飾粒子はすぐに、チオール タンパク質に混ぜた時に発生します。
- チオレート トラウトの試薬 (Technote 201) と抗体。
- NHS 被覆磁性粒子 (図 3) に抗原特異的および刺激信号をコートします。この手順は 200 nm、NHS 被覆超常磁性ナノ粒子。
- 再懸濁バッファー、焼入のバッファー、およびストレージ バッファーを準備します。再懸濁バッファーが 25 mM 2-(N morpholino) ethanesulfonic 酸 (MES) 0.01% にトゥイーン 20 pH 6.0 に調整。焼入のバッファーは、pH 7.4 でトリス-HCl の 100 ミリメートルのソリューションです。記憶域バッファーが 10 mM PBS と 0.01% 溶液 pH 7.4 でトゥイーン。
- 1 mL の再懸濁バッファーで凍結乾燥粒子を再懸濁します。渦精力的に少なくとも 15 分まで集計が表示されません。
- 上澄みを除去、再懸濁バッファーとシンチレーション バイアルへの転送の 0.5 mL で再懸濁しますマグネット スタンドに磁性粒子を配置します。渦まで集計が表示されません。
- 総蛋白再懸濁粒子の 1 mg 当たりの 0.1 mg を追加します。ミックスし、混合しながら 2.5 時間室温で反応する渦。
- バッファーを焼入れの 0.1 mL を追加し、混ぜながら 30 分間室温で反応します。
- マグネット スタンドにシンチレーション バイアルを配置し、粒子を洗浄します。上清が明確な削除するまで待ちます。マグネット スタンドから粒子を除去、集計が表示されませんまで、再懸濁バッファーおよび渦の 1 つの mL を追加します。このプロセスを 3 回繰り返すし、1 mL の再懸濁バッファーで粒子を再懸濁します。最大 6 ヶ月の 4 ° C で粒子を格納します。
- コート抗原特異的および刺激信号 biotin コーティングした磁性粒子 (図 4)。このプロセスは、50-100 nm、ビオチンは反超常磁性ナノ粒子の説明です。
- Biotinylate MHC Ig または共刺激分子。
- 0.5 - 2 蛋白質の集中を調整 mg/mL の PBS バッファー内。脱イオン水で 10 Mg/ml の濃度でスルホ-NHS-ビオチンを再懸濁します、20 モル刺激する余分な抗体を追加します。45 分間室温でインキュベートします。
- 遠心濃縮器を用いて 50 kDa MWCO 回 PBS 3 で徹底的に洗って、500 μ L の最終巻を分光光度計を用いた抗体溶液の濃度測定までを集中して、製造元の指示に従ってください。
- ビオチン標識 MHC Ig および/または反ビオチン ナノ粒子への共刺激シグナルを共役します。株価対策ビオチン粒子の 500 μ L、刺激抗体の 0.5 nmol を追加し、4 ° C で一晩インキュベートします。
- 共役 aAPC ナノ粒子を洗います。これらの粒子は 200 より小さいので nm、磁気柱をウェットし、マグネット スタンドに置きます。
- 粒子・ タンパク質サスペンションを列に追加します。完全に列を入力するためのタンパク質を許可します。
- 列に 3 回 0.5 mL の PBS を追加することによって洗浄します。
- マグネット スタンドからの列の削除、列に 0.5 mL の PBS を追加する、プランジャー、expulse シンチレーション バイアルに粒子 aAPCs を使用して溶出します。最大 6 ヶ月の 4 ° C で粒子を格納します。
注: 粒子は、最大 6 ヶ月 (冷凍しないべきである) の 4 ° C で安定しています。高い温度は、粒子の機能を低下させて、いくつかの粒子の凝集が観察されている (データは示されていない)。保たない室温で長時間のようにこれは、パーティクルの寿命を大幅に減少します。
- Biotinylate MHC Ig または共刺激分子。
3. 人工抗原提示細胞ナノ粒子蛍光抗体の検出を使用して蛋白質内容を特徴付けます。
注: これは作り出された人工抗原提示細胞の有用な品質管理です。バッチ、各種 aAPC 相当 aAPC 用量を生成する刺激信号の量を使用するまた、(e.g。、サイズが異なる)。
- コーティングされた aAPCs の粒子濃度を測定します。
- 原液から非粒子を使用して PBS 100 μ L/ウェルの 96 ウェル平底の組織培養プレートに溶液で 1:2 用量滴定。
- 405 プレート読書分光光度計でパーティクルを読んで知られている粒子濃度から標準曲線を作成する nm。
- 共役 aAPCs のサンプルを取る、100 μ L の総ボリュームに PBS で希釈、分光光度計で読みます。
- 試作した aAPCs のサンプルを削除し、蛍光抗体で染色します。
- 削除するどのくらいのサンプルを計算するには、粒子表面に抗体の数を推定します。
注: これらの技術、粒子表面積の約 1000 の抗体/μ m2の密度と仮定します。蛍光を検出することができる、約 10 の11 MHC Ig や CD28 分子蛍光テストあたり合計それを必要があります。 - PBS 100 μ L まで aAPCs の総容積をもたらす、1: 100 希釈で染色抗体を追加、4 ° C で 1 時間インキュベート
注: 正常に使用例抗体、FITC 標識ラット抗マウス Ig λ1、λ2、λ3 軽鎖、MHC-Ig と FITC 共役マウス アルメニア/シリアのハムスター IgG、抗クローン G192-1、抗マウス CD28 を検出する検出する R26 46 のクローンを作成します。
- 削除するどのくらいのサンプルを計算するには、粒子表面に抗体の数を推定します。
- 粒子を洗浄、蛍光プレート リーダーの蛍光を読み取る。
- 磁気 (手順 2 に従って) 3 回 0.5 mL の PBS とステンド グラス aAPC 分数を洗います。
- 0.5 mL の PBS で洗浄 aAPCs を溶出します。
- ステップ 3.1 と同様に吸光度を用いた濃度を読み取る 96 ウェル平底プレートに 100 μ L の溶出の aAPCs を追加します。
- 残り 400 μ L を取り出して 2 200 μ 因数に分割黒、ポリスチレン 96 ウェル、平底プレートに 2 つの井戸に追加。ソリューションの 100 μ L を取り、よく、少なくとも 4 回それぞれ 100 μ L の PBS は、次もとの混合によって、プレートを 1:2 の比率で滴定しなさい。
注: 測定のノイズを低減する測定の平均、複数をレプリケートします。 - 同じ黒 96 ウェル プレート 200 μ L の PBS および少なくとも 12 の井戸の 1:2 の比率でダウン滴定でよく 1: 200 でそれを追加することで、染色に使用される蛍光抗体の標準曲線を確認します。
- プレート aAPC と蛍光抗体、蛍光プレート リーダーでプレートを読んでください。
- 各パーティクルの蛋白質の量を計算します。抗体を検出する抗体の汚損の 1:1 の比率と仮定すると、標準曲線、抗体濃度が既知の場合に値を比較することによって抗体の濃度を決定します。この吸光度の試金によって決まりますの粒子の濃度と検出された抗体の集中を除算してパーティクルごと抗体の数を与えます。
4. 準備ナノ人工抗原提示細胞の抗原特異的 cd 8 + T 細胞を豊かに。
- Cd 8 + T 細胞を分離します。
- 頚部転位続いてイソフルラン暴露による動物を安楽死させます。
- 野生型 c57bl/6 j マウスから脾臓とリンパ節を取り出し、PBS のソリューションに置きます。臓器を漬け込むし、PBS の頻繁な洗浄と滅菌 70 μ m の細胞ストレーナーを介して細胞を溶出します。
- 非-cd 8 + T 細胞を排除するためにノータッチ cd8 陽性 T 細胞分離キットを使用して、製造元の指示に従ってください。
注: 各抗原の条件には、少なくとも 3 x 106 cd8 陽性 T 細胞が必要です。
- Cd 8 + T 細胞に結合するナノ粒子 aAPCs を追加します。
- 次の分離、0.5% ウシ血清アルブミン (BSA)、2 ミリメートルの EDTA の PBS 100 μ L のボリュームに集中します。
- 数を決定する 1011 aAPC バインドの割合に基づいて計算することによって追加する aAPCs のペプチド負荷 MHC Ig すべて 106 cd 8 + T 細胞。
- AAPC 粒子を孵化させなさいし、5 mL の滅菌ポリスチレンで継続的な混合の 4 ° C で 1 時間の cd 8 + T 細胞のラウンド底部チューブ。
- 補われたメディアと溶出し、cd 8 + T 細胞の培養 T 細胞増殖因子 (TCGF) を準備します。
- 補足のメディアの非本質的なアミノ酸、1 mM ピルビン酸ナトリウム、ビタミン ソリューション、92 μ M 2-メルカプトエタノール、10 μ M シプロフロキサシン、10% 牛胎児血清 (FBS) x 0.4 x 1 (グルタミン) と完全な RPMI 1640 メディアを補足します。
- TCGF をするためには、プロトコル既に確立されると参照ここ9に従ってください。
注: TCGF は追加刺激信号の成長に必要な T 細胞を提供するために不可欠である人間の免疫サイトカインの社内カクテルです。TCGF を IL-2 など知られている T 細胞刺激サイトカインと交換できる IL-7、または IL-15;ただし、T 細胞応答をそれに応じて分極それぞれことがあります。これらのカクテルと記載プロトコルが最適化されていません。したがってその他のテクニックを参照して濃度と TCGF を例と使用しない場合の組み合わせ一覧10,11。
- 洗って、aAPC と cd 8 + T 細胞の混合物を豊かに。
- ステップ 2 で説明したように、磁性粒子 aAPCs を洗ってください。ただし、最初の 0.5 %bsa、2 ミリメートルの EDTA PBS バッファーを使用して洗う、メディア、2 番目を使用して補われ、1% を添加した 3 番目を使用して TCGF。
- AAPCs と 1% と補われたメディアの 500 μ L に濃縮 cd8 T 細胞溶出 TCGF。
- 160 μ L/1% と補われたメディアのウェルの 96 U 底プレートで検定とプレートの使用セルをカウント 2.5 x 105 cd 8 + T 細胞/mL の濃度で TCGF。
- AAPCs を使用して分離する場合のみペプチド-MHC Ig に読み込ま表面 (共刺激シグナルなし)、完了ステップ 4.5。AAPCs を用いた両ペプチド負荷 MHC-Ig からの表面と共刺激シグナルを分離する、ステップ 5 に進みます。
- 豊かな分数に面上に共刺激シグナルをコーティングした磁性粒子と共同 T 細胞の表面に刺激信号をクラスター化する磁気フィールドを追加します。
- 豊かな分数に等モルの (またはコントロールに aAPC プロパティに関するアプリケーションを参照してくださいセクションによって大きい) を追加刺激抗体ペプチド負荷 MHC Ig 粒子の数の。
- 4 ° C で 1 時間の濃縮の cd 8 + T 細胞に結合する共刺激の磁性粒子を許可します。
- 1.9 cm (0.75 インチ) 長さに 2 つのネオジウム N52 ディスク磁石間培養プレートを配置することによって磁気フィールドを追加します。
注: N52 ディスク磁石は非常に強力なフィールドを持ちます。両方、互いから削除するは難しいが、培養皿にそれらを置くとき、磁石間のスペーサーでそれらを格納する注意をすべき。インキュベーターの金属部品へのこだわりから磁石を最小限に抑えるため、上下両方に 50 mL の円錐管発泡スチロール容器に入れます。
5. 展開し、準備されたナノ人工抗原提示細胞の抗原特異的 cd 8 + T 細胞を検出します。
- AAPCs と cd 8 + T 細胞 96 U 底ウェル プレートを加えて加湿 5% CO2、3 日間の 37 ° C の定温器。3 日目、7 日目までで 80 μ L でセルを 2 %tcgf と場所と補われたメディアの井戸あたりインキュベーターにフィードバックします。
- 7 日を数えるため底部チューブ ラウンド 5 mL に刺激細胞を収穫します。
- 一度すべてのソリューションの収穫は、アジ化ナトリウム 0.05% と 2 %0.5 mL の PBS に再懸濁します収穫セル スピンダウン FBS。トリパン ブルー染色、診断を頼りにして実行可能なセルをカウントします。
- 2 つ新しい 5 mL の抗原特異的染色用底管丸に 50,000 500,000 カウントが設定されたセルを削除します。同族ペプチド-MHC 染色に使用する 1 つの管と他の管は背景の汚損を決定する非同系染色に適用します。
- それぞれ同系とアジ化ナトリウム 0.05% と 2 %100 μ L の PBS で非同系チューブにビオチン化 MHC Ig (手順 2 で説明したテクニックを使用して) の 1 μ g を追加アロフィコシアニン (APC) と FBS-共役ラット抗マウス CD8a、クローン 53 6.7 (希釈倍率の1: 100) 4 ° C で 1 時間
- セカンダリ ストレプトアビジンを追加し、死んだ汚れをライブします。遠心分離による過剰なビオチン PBS の MHC Ig を洗い流します。1:350 比フィコエ リスリン (PE) のすべてのサンプルを染色-4 ° C で 15 分間ライブ/デッド修正緑死んだ細胞染色のストレプトアビジンと 1: 1000 の割合ラベル
- 特異性と抗原特異的細胞の数を決定する流れの cytometer のすべてのサンプルをお読みください。
- 過剰なセカンダリを洗い流すとライブ/デッド遠心沈降法による染色し PBS バッファー アジ化ナトリウム 0.05% と 2% の 150 μ L で再懸濁します FBS 流れの cytometer で読むこと。
- 数とデータ解析ソフトウェアと抗原特異的細胞の割合を決定します。
- 抗原特異的細胞の割合を調べるには、それぞれ注文はライブ + リンパ球 + (側方散乱によって前方散乱)、cd 8 +、ダイマー + 次のゲートを使用します。同種の汚れに非同系を比較することによって二量体 + ゲートを決定します。
- 二量体 + 非同系 MHC Ig 汚れから同種の MHC Ig 汚れの割合を差し引くことによってサンプルの抗原特異的細胞のパーセンテージを決定します。
- この抗原特異的細胞の割合を使用して、濃縮と拡張を産する抗原特異的細胞結果の数カウント、セル数でそれを乗算します。
注: 補償はこのパネルで使用される fluorophores が付いているスペクトルの重複があるので流れの cytometer で設定する必要があります。
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Representative Results
成功した濃縮と抗原特異的 T 細胞の拡大を完了するため、ペプチド負荷 MHC Ig と共刺激分子などへ aAPC 粒子に正常にアタッチする必要があります。粒子の添付ファイルの 3 つの方法に基づいて、成功活用手順結果 (図 5 a) のいくつかの代表的なデータをいたします。確かに、配位子濃度が低すぎる場合ができなくなりますこれが線形間隔 100 を超える配位子の周りに発生した抗原特異的 cd 8 + T 細胞の効果的な刺激の経験 (図 5 b)7nm。
両方定量的蛍光抗体読み出し、トランスジェニック cd8 陽性 T 細胞の拡張のほかは、同種組換え抗原特異的 cd8 陽性 T 細胞でのドーピングによって品質管理のナノ粒子 aAPCs をチェックできます。これは gp100 抗原特異的 cd 8 + T 細胞のあるブイデータ マウスなどの遺伝子改変マウスの cd 8 + T 細胞を分離し、1: 1000 の割合で B6 背景へのドーピングによって行うことができます。カウントと染色の前に、濃縮後により倍濃縮 (図 6 a) とパーセント回復 (図 6 b)6の両方の列挙できます。これらの代表的な結果で、信号 1 aAPCs するためだけ効率的な濃縮 (約 10 倍) 約 80% 細胞と粒子の非特異的抗 CD28 のある伝統的な信号 1 と 2 aAPCs を強化、回復を紹介します。同様に。
一度粒子 aAPCs を十分に特徴づけられている、品質制御、濃縮と野生型マウスから希少な抗原特異的 cd 8 + T 細胞の拡大で使用できます。正確な結果を得るには、機能検出試薬、ビオチン化ダイマーなどを持つことが重要です。染色を確認するトランスジェニックの cd 8 + T 細胞にビオチン化二量体の品質管理ができます。ここでは、代表的な結果表示背景コントロール (図 7) として gp100 固有 B6 cd 8 + T 細胞 cd8 陽性 T 細胞と染色陽性。図 7は、またビオチン化二量体のレベルは高すぎるがある場合ことを示しますし、それ自体に対抗し、モノラル原子価結合を展示、親和は減る。
5 と 50% 抗原特異的 cd 8 + T 細胞、条件あたり 5 x 106 cd 8 + T 細胞で始まる後ほぼ 20,000 に 200,000 抗原特異的 cd 8 + T 細胞の間期待される濃縮前後七日間マウス cd 8 + T 細胞の拡大、(図 8)6具体的には、抗原特異的 cd 8 + T 細胞の染色、ビオチン化ダイマーのバック グランドを知ることが重要、この場合は 4.15%;。同種の汚れからこれより低い割合は、否定的な結果 (図 8 a) と見なされます。さらに、抗原特異的 cd 8 + T 細胞の実際の割合を決定する流れ cytometry ゲートを描画する場所が表示されます。これは抗原特異的 cd 8 + T 細胞 (図 8 aで示すように)、異なる集団を持っていないが、広範な塗抹標本として表示される場合に重要です。
同じプロセスは、分離し、ヒトの抗原特異的 cd 8 + T 細胞を刺激するために使用できます。同様の品質管理と結果は、次の濃縮 (図 9)5拡張のわずか 1 週間後のパーセンテージと抗原特異的 cd 8 + T 細胞数の大幅な増加の観察場所見るべきだった。
図 1: ナノ人工抗原提示細胞を用いた抗原特異的濃縮のプロセスの概略図です。まず、ノータッチ cd8 陽性 T 細胞の分離を完了します。その後、cd 8 + T 細胞にナノ粒子 aAPCs を追加します。磁場、文化、豊かにし、aAPCs を刺激します。最後に、フローサイトメトリーによる豊かで展開された抗原特異的 cd 8 + T 細胞を検出します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ペプチド負荷 MHC Ig とアミン被覆磁性粒子の表面に共刺激分子の活用のスケマティック。簡単に言えば、スルホ SMCC 架橋剤は、マレイミド官能基を持つ磁性粒子表面の高機能化に使用されます。MHC Ig と共刺激分子はチオール官能基を生産するトラウトの試薬と同時に官能基化します。活性アルミナと蛋白質信号が一緒に反応し、抗原特異的人工抗原提示細胞磁性ナノ粒子を生成する洗浄し。この図は、 Nano 手紙7で私たちの研究所の出版物の補足資料から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ペプチド負荷 MHC Ig と NHS 被覆磁性粒子の表面に共刺激分子の活用のスケマティック。簡単に言えば、NHS 被覆粒子はペプチド負荷 MHC Ig と共刺激分子反応、抗原特異的人工抗原提示細胞磁性ナノ粒子を生成する洗浄し。この図は、 Nano 手紙7で私たちの研究所の出版物の補足資料から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: ペプチド負荷 MHC Ig と biotin コーティングした磁性粒子の表面に共刺激分子の活用の概略。NHS-ビオチン ビオチン機能グループを生成する MHC Ig と共刺激分子修飾とは。その後、アンチ biotin 被覆粒子の機能性ペプチド負荷の MHC Ig 共刺激分子と反応しています。その後、抗原特異的人工抗原提示細胞磁性ナノ粒子を生成するこれらの粒子を洗浄します。この図は、 Nano 手紙7で私たちの研究所の出版物の補足資料から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 活用効率の濃縮と抗原特異的 T 細胞の拡大のため重要です。(3 つの異なる 3 つの活用方法と活用の効率化のため a) 代表的なデータ ベース紙に記載されている磁性粒子: アミン被覆粒子、NHS 被覆粒子と反 biotin 被覆粒子。各データ ポイントを表す異なる粒子調製法と誤差範囲を表す S.E.M. (b) 遺伝子組換えの cd 8 + T 細胞刺激、リガンド密度が 600 ナノメートルにおける配位子の線形間隔として表されているに影響を与えるリガンド密度nm、50 nm aAPCs (n = 5 の誤差範囲を表す S.E.M. と)。この図は、 Nano 手紙7で当研究室のパブリケーションから変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: AAPC 濃縮の品質管理。トランスジェニック ブイデータ gp100 固有 cd8 陽性 T 細胞を野生型 B6 cd 8 + T 細胞にで 1: 1000 の割合で添加しました。(a) 倍濃縮は、コンジェニック マーカーの汚損によって濃縮を次フローサイトメトリーを用いて測定した Thy1.1 および CD8。シグナル 1 だけ粒子間の比較をここではまたは Db Ig gp100、伝統的な信号 1 と 2 の粒子または Db Ig gp100 と抗 CD28 非同系信号 1 と 2 の粒子とロード搭載します。(b) 細胞も数えられた前に、と後細胞の回復を測定するそれぞれの方法で。3 つの独立した実験を表し、S.E.M. データ結合エラー バーを表す一方通行 ANOVA テューキー事後テストで測定したデータ (*p< 0.05 * *p< 0.01)。この図は、 Nano 手紙6で当研究室のパブリケーションから変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: ビオチン化ダイマーの品質管理。Gp100 固有 cd8 T 細胞ブイデータ トランスジェニック マウスから分離したし、ビオチン化 Db Ig ロード gp100 と APC アンチ-CD8a、ネガティブ コントロールとして野生型 B6 cd 8 + T 細胞を使用しての 3 つの濃度を 100 μ L の PBS のステンド グラスします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: 濃縮と抗原特異的 cd 8 + T 細胞の拡大します。B6 野生型 cd8 陽性 T 細胞は、どちらかの信号のみ 1 (Kb Ig TRP2 搭載) と濃縮した信号 1 と 2 (Kb Ig TRP2 と抗 CD28 の粒子の表面に読み込まれる) または。信号 2 は信号 1 だけ aAPCs の濃縮の割合に添加し、すべてのセルは、7 日間培養しました。(a) cd 8 + T 細胞が染色しライブ/デッド蛍光染色のゲート、ゲート cd8 と KbTRP2 +、抗原特異的 cd 8 + T 細胞を検出する非同系の Kb Ig と比較します。(TRP2 特異的 cd 8 + T 細胞の割合 b) と (c) の数になることが決定、信号 1 唯一の濃縮方法から割合が高いと抗原特異的 cd 8 + T 細胞数を検出できる (n = 7、エラーバーは標準偏差を表す2 尾対 t 検定 *p < 0.05 * *p < 0.01)。この図は、 Nano 手紙6で当研究室のパブリケーションから変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9: 濃縮と抗原特異的 cd 8 + T 細胞の拡大します。(a) 代表 0 日に流れの cytometry プロット、濃縮と 7 日目の充実と A2 Ig が NY ESO1 と A2 Ig 搭載従来のナノ粒子 aAPCs と健康なドナーから抗原特異的 cd8 T 細胞の拡大の劇的な効果を示す前に抗原が表示されます MART1 を搭載しました。(b) これは 7 日目で高い割合 (~ 10-20%) と抗原特異的 cd 8 + T 細胞数 (0.5-1 x 106) を生成する (n = 3 独立したドナーから誤差範囲を表す S.E.M.)。この図は、 ACS Nano5で当研究室のパブリケーションから変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
1 ボックス 1 の補足ファイル。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
2 ボックス 2 の補足ファイル。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
我々 は、ナノ人工抗原提示細胞 (aAPCs) に基づく新規抗原特異的 T 細胞の分離技術を作成しています。ナノ粒子 aAPCs ペプチド-読み込まれている MHC 抗原特異的 T 細胞のバインディングとアクティベーション共刺激活性化と一緒にことができる表面に。aAPCs は、常磁性、また、したがって磁場を用いた希少な抗原特異的 T 細胞を豊かにするために使用できます。我々 は最適化し、キー ナノ粒子特性サイズ、リガンド密度と配位子の選択肢とそのバインディング、濃縮、アクティブ化、および細胞濃縮 (補足ファイル 1 ボックス 1) に及ぼす影響を検討しました。
したがって、いくつかの抗原特異的 cd 8 + T 細胞伸長の濃縮と拡張プロシージャの結果高として抗原特異的割合を 60% に thousand-fold 生産と、マウスと人間の両方の設定 (補足ファイル 2 ボックス 2で使用することができます。).このような高い数字と抗原特異的 T 細胞の割合は病気に対する免疫応答の解析を有効にする (e.g、がん、自己免疫、など)、新規免疫ターゲットおよびメカニズムの発見を可能とする機会を提供。養子免疫療法で使用されます。特定のアプリケーションの例は患者の腫瘍をシーケンスの突然変異を識別、変異体シーケンスから潜在的な MHC バインダーを見つけて、それらのトップ候補抗原と aAPCs を生成し、患者がいずれかを持っているかどうかを決定するための aAPCs を利用腫瘍固有の neoantigens。
確かに、方法論の限界キー障壁にずっと勉強して抗原特異的応答を識別します。現在の技術 (a) 必要の結果、(d) の結果を取得する前に T 細胞の拡大の週間の実質的な時間と作業を集中手順、(b) 細胞、樹状細胞を収集する必要性などの維持に困難 (c) 必要があります。低特異性 (1-2%) と抗原特異的 cd 8 + T の低い数字のセル、(e) しばしば重要なバック グラウンド信号、頻繁に作り出される (f) cd 8 + T 細胞が使用できないかさらなる分析で検討しました。1 つのメソッドには、抗原抗原特異的応答14,15,16,17の存在を特徴付けるしなさい前に予防接種が必要です。サイトカイン +18の感度を高めるための肝腎などの応答で四量体汚れを多重抗原提示細胞を使ってタンデム ミニ遺伝子発現プラスミドを利用した別の方法が必要です。ペプチド パルス内因性抗原提示細胞の体外培養、抗原特異性15の 0.5% の増加の結果だけ。
我々 のアプローチこれらの方法論の限界を解決する、従って診断と治療ツールとして使用できます。抗原特異的 cd 8 + T 細胞濃縮と拡張を確保するために重要なステップは、1) 効果的にペプチド抗原を MHC Ig をロード、2) ナノ粒子の表面に刺激信号を共役、3) T 細胞に粒子をバインド、4) にバインドされているセルの豊か5 磁場を持つナノ粒子) カルチャ、および 6 のナノ粒子バインド T 細胞は溶出を展開) 抗原特異的 cd 8 + T ペプチド負荷ビオチン標識と 7 日目の細胞の MHC を検出します。
濃縮および拡張プロトコルに現れる主な問題は、不適切な生産期限切れ検出試薬またはナノ粒子 aAPCs から生じる。ビオチン化二量体が遺伝子組換え抗原特異的 cd 8 + T 細胞での検証を抗原特異的 cd 8 + T 細胞を染色することを確認します。ペプチド-MHC-Ig に対応するトランスジェニック マウス モデルが設定されていない場合は、肯定的な制御ペプチドを読み込んで読み込みを確認する肯定的なコントロールをテストするために便利です。いくつかのペプチドを MHC-Ig; に読み込めないかもしれませんしかし、これは Net-MHC などの MHC 読み込みアルゴリズムでシミュレートすることができます。 または実験的 RMA 細胞ベースのアッセイ13。充実と拡大の結果のいくつかの変動を別蛍光プレート リーダー アッセイが安定性を確認する実行もありますので、6 ヶ月後 aAPC 粒子安定性が低下します。
今後の作業で、アッセイの深さ、幅、機能の拡張を目指しています。スループットと 96 ウェル プレート形式で一度に調査する複数の抗原を多重化する機能の両方を向上に取り組んでいます。現在、主な制限は、いくつか抗原のみを同時に調べることができます。比重 aAPC と配位子のサイズが濃縮をどのように影響するかを調べることでこれを取り組んでいます。さらに、我々 は文化の中での異なる細胞組成効果 cd8 陽性 T 細胞伸長を調べています。最後に、この MHC クラス II に豊かにし、抗原特異的 cd 4 + T 細胞を展開することができる技術を模倣するように目指しています。
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Disclosures
著者宣言次競合金融利益のため: NexImmune とジョンズ ・ ホプキンス大学との間のライセンス契約の下でジョナサン ・ シュネックこれで記載されている製品の販売に大学によって受信料の共有する権利があります。記事。彼も NexImmune の創始者、会社の株式を所有しています。NexImmune の取締役会、科学諮問委員会のメンバーを務めます。これらの契約条件が検討されており、その利益相反ポリシーに従って、ジョンズ ・ ホプキンス大学によって承認されました。
Acknowledgments
J.W.H. は、ナノバイオ テクノロジー、国立科学財団大学院研究員 (DGE-1232825) と交わりを支える円弧財団のジョンズ ・ ホプキンズ大学で NIH がんナノテクノロジー トレーニング センターを感謝します。この作品は、コールター財団 (JPS)、テッドコー/メリーランド州イノベーション イニシアチブ健康の国民の協会 (P01-AI072677、R01-CA108835、R21-CA185819) からの支援によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 551263 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig | BD Biosciences | 551323 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 550750 | |
| Vivaspin 20 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932362 | |
| Vivaspin 2 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932257 | |
| Purified Human Beta 2 Microglobulin | Bio-Rad | PHP135 | |
| nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles | Micromod | 79-01-102 | |
| Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm | Ocean Nanotech | SN0200 | |
| Anti-Biotin MicroBeads UltraPure | Miltenyi | 130-105-637 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | |
| Sulfo-SMCC Crosslinker | ProteoChem | c1109-100mg | |
| 2-Iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 Sigma | |
| 96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene | Corning | 3875 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain Clone R26-46 | BD Biosciences | 553434 | |
| FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG Clone G192-1 | BD Biosciences | 554026 | |
| B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice | Jackson Laboratory | 005023 | |
| C57BL/6J (B6 wildtype) mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi | 130-104-075 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE | Biolegend | 405203 | |
| N52 disk magnets of 0.75 inches | K&J Magnetics | DX8C-N52 | |
| APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 | Biolegend | 100711 | |
| LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation | ThermoFisher | L-34969 |
References
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