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Engineering

Enrichir et élargir les cellules rares T antigène-spécifiques avec des nanoparticules magnétiques

Published: November 17, 2018 doi: 10.3791/58640
Automatic Translation
1,2,3,4, 2,4
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 2Institute for Cell Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 3Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 4Department of Pathology, School of Medicine, Johns Hopkins University

Summary

Lymphocytes T antigène-spécifiques sont difficiles à caractériser ou utiliser dans les thérapies en raison de leur fréquence extrêmement basse. Ici, nous fournissons un protocole visant à développer une particule magnétique qui peut lier aux cellules T spécifiques de l’antigène à enrichir ces cellules, puis d’en faire plusieurs techniques pour la caractérisation et le traitement.

Abstract

Nous avons développé un outil pour enrichir et développer des lymphocytes T spécifiques de l’antigène. Cela peut être utile dans des cas tels que A) détecter l’existence de lymphocytes T spécifiques de l’antigène, B) sonde la dynamique des réactions antigène-spécifiques, C) comprendre les réactions antigène-spécifiques influencent l’état de la maladie telles que l’auto-immunité, D) démystifier hétérogènes réponses spécifiques de l’antigène des cellules T, ou E) utilisent des cellules antigène-spécifiques pour la thérapie. L’outil est basé sur une particule magnétique que nous avons conjugué antigène-spécifiques et les signaux de costimulation des lymphocytes T, et que nous appelons comme artificiels (VAMP) des cellules présentatrices d’antigènes. Par conséquent, étant donné que la technologie est simple à réaliser, il pourra facilement être adopté par d’autres laboratoires ; ainsi, notre but ici est de décrire en détail la fabrication et l’utilisation subséquente de la vamp. Nous expliquons comment attacher les signaux de costimulation et antigène-spécifiques à la VAMP, comment les utiliser pour enrichir des lymphocytes T spécifiques de l’antigène et comment développer des lymphocytes T spécifiques de l’antigène. Par ailleurs, nous mettrons en évidence de conception technique, les considérations liées à l’information expérimentale et biologique de notre expérience avec la caractérisation des cellules T spécifiques de l’antigène.

Introduction

Avec la montée des immunothérapies beaucoup, il y a un besoin d’être en mesure de caractériser et de contrôler les réponses immunitaires. En particulier, la réponse immunitaire adaptative est intéressant en raison de la spécificité et la longévité des cellules. Récemment, les thérapies de récepteurs chimériques-antigène des lymphocytes T ont été approuvés pour le traitement du cancer ; Cependant, les récepteurs d’antigènes sont basées hors de la cellule surface antigène commun CD19, au lieu des antigènes spécifiques du cancer1. Au-delà de la spécificité, immunothérapies peuvent aussi souffrent du manque de contrôle et limitée à comprendre la réponse immunitaire dynamique au sein du cancer ou d’auto-immunité.

Un des défis de l’étude des réponses spécifiques à l’antigène est leur fréquence extrêmement basse, par exemple., lymphocytes T antigène-spécifiques sont : 1 de chaque 104 106 T cellules2,3. Ainsi, afin d’étudier quel T, les cellules sont présentes ou en réponse, les cellules doivent soit être enrichi et élargi, ou besoin de leur signal à amplifier. C’est cher et difficile à maintenir les cellules nourricières en utilisant les techniques actuelles qui mettent l’accent sur l’expansion des cellules antigène-spécifiques. Les techniques actuelles qui mettent l’accent sur l’amplification du signal de T antigène-spécifiques des cellules, comme le dosage de l’enzyme-linked immunospot (ELISPOT), limiter la réutilisation de ces cellules T4. Enfin, en raison de la faible sensibilité, souvent ces deux techniques doivent être combinés pour le dénombrement de l’antigène-spécifiques.

Pour résoudre ces problèmes, nous avons développé l’antigène artificiel à base de nanoparticules magnétiques présentant cellulaire (VAMP)5,6,7,8. La VAMP peut être fonctionnalisée avec un complexe antigène-spécifiques-peptide signal chargé majeur d’histocompatibilité (pMHC) et les molécules de costimulation -e.g., un anticorps anti-CD28-à la fois enrichir des lymphocytes T spécifiques de l’antigène et puis par la suite stimuler leur expansion (Figure 1). Les particules peuvent ainsi être un produit sur étagère rentable qui peut être aussi bien personnalisé pour répondre aux stimulations de l’antigène-spécifiques encore standardisé à travers des expériences et des patients. L’enrichissement et l’expansion traiter les résultats dans des centaines de milliers-pli expansion des cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène et peut entraîner des fréquences jusqu'à 60 pour cent après seulement une semaine, ce qui permet la caractérisation ou l’utilisation thérapeutique des grandes nombre de cellules. Dans les présentes, nous expliquent comment faire des nanoparticules Vamp, quelques considérations de conception critiques dans le choix des propriétés de nanoparticules et démontrer certains résultats typiques de l’utilisation de ces particules à isoler et à développer des cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène rares.

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Protocol

Toutes les souris ont été maintenues conformément aux directives approuvées par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université Johns Hopkins.

1. Chargez la protéine de Fusion des immunoglobulines dimère complexe majeur d’histocompatibilité (MHC-Ig) avec séquence peptidique antigène désirée.

Remarque : Si vous utilisez la H - 2Kb : Ig, puis suivre le protocole détaillé à l’étape 1.1 ; Si vous utilisez H-2Db:Ig, puis suivre le protocole détaillé dans l’étape 1.2.

  1. Active le chargement de la séquence peptidique en H - 2Kb : Ig.
    1. Préparez les tampons nécessaires. Préparer le tampon de dénaturation en faisant une solution de NaCl 150 mM et 15mM Na2CO3 dans l’eau désionisée et puis en ajustant le pH à 11,5. Préparer le tampon de renaturation qui en fait une solution de 250 mM Tris HCl dans l’eau désionisée et en ajustant le pH à 6,8.
      Remarque : En règle générale, il faudra environ 5 mL de la dénaturation et la renaturation des tampons pour 1 mg de H - 2Kb : Ig.
    2. Dénaturer la H - 2Kb : Ig pour autoriser la liaison peptidique améliorée. Apporter la H - 2Kb : concentration des Ig à entre 0,5 à 2 mg/mL avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Puis diluer la H - 2Kb : Ig à une concentration finale de 100 à 200 µg/mL avec volume de 5 à 10 équivalents de dénaturation de la mémoire tampon et laisser pour incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
    3. Ajouter 50 excès molaire du peptide séquence (habituellement stock peptide est maintenue à 1 mM à-80 ° C) à la H - 2 Kb : solution d’Ig.
      Remarque : Habituellement antigènes peptidiques devra être dissous au moins 10 % le diméthylsulfoxyde (DMSO) et ensuite ajouté lentement à PBS de rester soluble. Selon la séquence d’acides aminés, la quantité de DMSO devrez être augmentée.
    4. Renaturer H - 2Kb : Ig avec peptide. Immédiatement après l’ajout du peptide, porter la solution à un pH de 7,4 en ajoutant la renaturation tampon. Laissez agir la solution neutralisée à incuber pendant 48 h à 4 ° C.
    5. Concentrer et laver chargement peptide H - 2Kb : Ig. utilisant un concentrateur centrifuge avec une limite de poids moléculaire de 50 kDa (MWCO), suivez les instructions du fabricant pour laver le peptide-chargé H - 2Kb : solution Ig 3 fois avec du PBS, concentré au moins 1 mg/mL et quantifier la concentration sur un spectrophotomètre.
  2. Active le chargement des séquences peptidiques dans H-2Db:Ig.
    1. Préparez les tampons nécessaires. Préparer le tampon de dénaturation en faisant une solution d’acide citrique 131 mM, NaCl 150 mM et 124 mM Na2HPO4 dans l’eau désionisée et puis en ajustant le pH à 6,5. Préparer le tampon de renaturation qui en fait une solution de 120 mM Tris HCl dans l’eau désionisée et en ajustant le pH à 8,8.
      Remarque : En règle générale, il faudra environ 5 mL de tampon de la dénaturation et 1 mL de tampon renaturation pour 1 mg de H-2Db:Ig.
    2. Dénaturer H-2Db:Ig pour autoriser la liaison peptidique améliorée. Mettre le H-2Db:Ig concentration à une concentration finale de 0,5 à 2 mg/mL avec du PBS. Ensuite, diluer le H-2Db:Ig à une concentration finale de 100 à 200 µg/mL avec 5 à 10 équivalents de volume de tampon de dénaturation.
    3. Ajouter 50 excès molaire du peptide séquence (habituellement stock peptide est maintenue à 1 mM à-80 ° C) au H-2Db:Ig solution et laisser pour incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
    4. Ajouter β2 microglobuline et renaturer H-2Db:Ig avec le peptide. Ajouter 2 fois excès molaire de β2 microglobuline. Ensuite, porter la solution à un pH de 7,4 en ajoutant la renaturation tampon. Laissez agir la solution neutralisée à incuber pendant 24 h à 4 ° C.
    5. Concentrer et laver chargement peptide H-2Db:Ig. utilisant un concentrateur centrifuge avec un 50 kDa MWCO, suivez les instructions du fabricant pour laver le peptide-chargé H - 2 Kb : solution Ig 3 fois avec du PBS, au moins 1 mg/mL et de quantifier la concentration sur un spectrophotomètre.

2. conjugué Complexes MHC-peptide et les molécules de costimulation à la Surface des nanoparticules magnétiques pour former des nanoparticules artificielle des cellules présentatrices d’antigènes. Utilisez l’une des trois méthodes différentes selon la taille des particules et Application.

Remarque : Un certain nombre de différentes techniques permet de conjuguer les protéines à la surface des particules. Dans les présentes, 3 approches distinctes sont décrites : particules recouvertes d’amine (point 2.1), N-hydroxysuccinimide (NHS)-enduit des particules (point 2.2) et biotin-enduit (étape 2.3). Ces processus ont également été décrits en détail dans la section méthodes de deux documents publiés6,7. Exécutez toutes les étapes dans une hotte de laboratoire de biosécurité avec des solutions stériles pour maintenir la stérilité des particules stock vamp.

  1. Enrober les signaux spécifiques de l’antigène et stimulateurs amine recouvert de particules magnétiques (Figure 2). Ce processus est décrit pour 100 nm, nanoparticules superparamagnétiques amine-enduit.
    Remarque : Les protocoles détaillés pour fixer l’anticorps à la surface d’une particule d’enduit amine se trouve à https://www.micromod.de/en/technotes-2.html, où 201 note technique décrit comment de thiolate anticorps et conjugué à la maléimide fonctionnaliser particules et 202 décrivent le processus nécessaire pour fonctionnaliser particules recouvertes d’amine avec groupes fonctionnels maléimide. Ici, seulement de légères modifications sont mises en évidence pour le MHC-Ig et les signaux de costimulation attachés à ces particules.
    1. Thiolate les anticorps avec le réactif de Traut (Technote 201).
      1. Préparer un 10 x PBS-tétraacétique (EDTA) l’acide un tampon (0,1 M PBS et 100 mM EDTA). Ajouter les 10 de tampon PBS-EDTA pour les anticorps à un 01:10 ratio pour empêcher l’oxydation des thiols libres ajoutés aux anticorps.
      2. Ajouter 20 excès de réactif de Traut (2-iminothiolane) à l’anticorps et incuber pendant 2 h à température ambiante avec le mélange. Mesurer dans une hotte chimique pour éviter la respiration qu’il convertit les groupes amine aux groupes thiol réactif de la Traut (poudre).
      3. Laver soigneusement avec 1 x tampon PBS-EDTA 3 fois à l’aide d’un concentrateur centrifuge avec un 50 kDa MWCO et suivre les indications du fabricant, concentrant jusqu'à ce qu’un volume final de 500 µL. mesurer la concentration de la solution d’anticorps, en utilisant un spectrophotomètre.
    2. Convertir les groupes fonctionnels amine sur les nanoparticules magnétiques maléimide groupes à l’aide de sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-CCAP, Technote 202).
      1. Ajouter les 10 de tampon PBS-EDTA pour les anticorps à un 01:10 ratio aux particules.
      2. Dissoudre la Sulfo-CCAP dans l’eau désionisée et vortex pour remettre en suspension à une concentration de 1 mg/mL. Doser le Sulfo-CCAP (poudre) dans une hotte chimique pour éviter la respiration qu’il convertit les groupes amine maléimide groupes.
      3. Ajouter 0,016 nmol de la solution Sulfo-CCAP pour chaque millimètre carré de surface des particules. Pour 1 mg de 100 particules nm, utilisez 0,3 mg de Sulfo-CCAP. Laisser pour réagir pendant 1,5 h à température ambiante.
      4. Laver les particules avec 1 x tampon PBS-EDTA 3 fois en utilisant un champ magnétique avec une colonne magnétique et remettre en suspension dans 500 µL de 1 x tampon PBS-EDTA.
        Remarque : Si vous utilisez des particules inférieures à 200 nm, tels que les particules nm 100 décrit ci-après, aimants très probables ne sera pas assez puissants pour retirer les particules pour le lavage ou la concentration des fins. Ainsi, pour laver les particules plus petites, vous pouvez utiliser une colonne magnétique composée de sphères ferromagnétiques pour amplifier le champ magnétique.
    3. Réagissent les particules maléimide fonctionnalisés avec des anticorps THIOLÉS (Technote 201).
      1. Ajouter les particules d’un flacon en verre de scintillation, ajouter un mini-magnétique, placez juste un pouce au-dessus une plaque magnétique remuer et induire magnétique de mélange de la solution de la particule.
      2. À la solution de mélange, ajouter goutte à goutte les anticorps THIOLÉS (0,5 mg d’anticorps pour chaque 1 mg de particules). Laisser pour réagir pendant une nuit à température ambiante.
      3. Lavez avec un tampon PBS 1 x 3 fois en utilisant un champ magnétique et remettre en suspension dans 500 µL de PBS 1 x. Étiqueter et stocker à 4 ° C pendant 6 mois.
        Remarque : Le rendement maximal en conjugaison se produit lorsque fonctionnalisés maléimide particules sont immédiatement mélangées avec des protéines THIOLÉS.
  2. Enrober les signaux spécifiques de l’antigène et stimulateurs NHS-enduit de particules magnétiques (Figure 3). Ce processus est décrit pour 200 nm, nanoparticules superparamagnétiques NHS-enduit.
    1. Préparer la solution tampon de resuspension, tampon trempe et tampon de stockage. Le tampon de resuspension est 25 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acide (MES) avec 0,01 % de Tween 20 ajusté à pH 6.0. Le tampon trempe est une solution de 100 mM Tris-HCl pH 7,4. Le tampon de stockage est une solution de 10 mM PBS et 0,01 % Tween à un pH de 7,4.
    2. Remettre en suspension les particules lyophilisées dans 1 mL de la solution tampon de resuspension. Vortex vigoureusement pendant au moins 15 min, jusqu'à ce qu’aucun agrégat n’est visibles.
    3. Placez les particules magnétiques sur un support magnétique pour retirer le surnageant, resuspendre avec 0,5 mL de tampon de resuspension et transférer dans un flacon en verre de scintillation. Vortex jusqu'à ce qu’aucun agrégat n’est visibles.
    4. Ajouter 0,1 mg de protéines par 1 mg de particules remises en suspension. Vortex pour mélanger et réagissent à la température ambiante pendant 2,5 h tout en mélangeant.
    5. Ajouter 0,1 mL de tampon de trempe et réagissent à température ambiante pendant 30 min en mélangeant.
    6. Placer le flacon à scintillation sur un support magnétique et les particules de lavage. Attendez que le surnageant est clair à supprimer. Retirer les particules de magnétique, ajouter 1 mL de tampon de resuspension et vortex jusqu'à ce qu’aucun agrégat n’est visibles. Répéter cette opération trois fois et remettre en suspension les particules dans 1 mL de solution tampon de resuspension. Stocker les particules à 4 ° C pendant 6 mois.
  3. Enrober les signaux spécifiques de l’antigène et stimulateurs biotin-enduit de particules magnétiques (Figure 4). Ce processus est décrit pour 50 à 100 nm, anti-biotine nanoparticules superparamagnétiques.
    1. Biotinylater MHC-Ig ou les molécules de costimulation.
      1. Ajuster la concentration en protéine de 0,5 à 2 mg/mL dans le tampon PBS. Resuspendre le sulfo-NHS-biotine à une concentration de 10 mg/mL dans l’eau désionisée et ajouter 20 fois molaire anticorps excès de stimulation. Incuber à température ambiante pendant 45 min.
      2. Laver soigneusement avec du PBS 3 fois avec un concentrateur centrifuge avec un 50 kDa MWCO, suivez les instructions du fabricant, concentrant jusqu'à ce qu’un volume final de 500 µL. mesurer la concentration de la solution d’anticorps à l’aide d’un spectrophotomètre.
    2. Biotinylé conjugué MHC-Ig et/ou des signaux de costimulation aux nanoparticules anti-biotine. Pour 500 µL de stocks anti-biotine particules, ajouter 0,5 nmol d’anticorps stimulant et incuber une nuit à 4 ° C.
    3. Laver les nanoparticules de vamp conjugués. Parce que ces particules sont inférieurs à 200 nm, mouiller une colonne magnétique et poser sur un support magnétique.
    4. Ajouter la suspension de particules/protéine à la colonne. Permettre à toutes les protéines/particules d’entrer complètement dans la colonne.
    5. Laver en ajoutant 0,5 mL de PBS trois fois à la colonne.
    6. Éluer en enlevant la colonne du support magnétique, ajouter 0,5 mL de PBS à la colonne et en utilisant le piston, expulser la VAMP de particules dans un flacon en verre de scintillation. Stocker les particules à 4 ° C pendant 6 mois.
      NOTE : Les particules sont stables à 4 ° C (ne doit pas être congelé) jusqu'à 6 mois. Des températures plus élevées diminuent la fonctionnalité des particules et une agrégation de particules ont été observés (données non présentées). Ne laissez pas à température ambiante pendant de longues périodes de temps que cela diminue de manière significative la durée de vie des particules.

3. caractériser la teneur en protéines sur artificiel présentatrices de nanoparticules de cellule à l’aide de la détection des anticorps fluorescents.

Remarque : Il s’agit d’un contrôle de la qualité utile de l’antigène artificiel produit cellules présentatrices. Aussi, la quantité de signal stimulateur est utilisée pour produire des doses équivalentes de vamp partout en lots et divers types de VAMP (e.g., différentes tailles).

  1. Mesurer la concentration de particules de vamp couché.
    1. Utiliser des particules non conjuguées de la solution mère et faire une titration de dose de 1:2 dans une solution de PBS sur une plaque de 96 puits à fond plat culture cellulaire avec 100 µL / puits.
    2. Lire les particules sur un spectrophotomètre de plaque-lecture à 405 nm pour créer une courbe d’étalonnage à partir d’une concentration de particules connues.
    3. Prenez un échantillon de la VAMP conjugués, diluer dans du PBS à un volume total de 100 µL et lisez sur le spectrophotomètre.
  2. Enlever un échantillon de vamp fabriqué et tacher avec des anticorps fluorescents.
    1. Pour calculer combien échantillon pour retirer, estimer le nombre d’anticorps à la surface de la particule.
      Remarque : Pour ces techniques, supposent une densité d’environ 1000 anticorps/µm2 de surface de la particule. Pour être en mesure de détecter la fluorescence, il nécessite environ 1011 MHC-Ig ou molécules CD28 totales par essai fluorescent.
    2. Porter le volume total de vamp jusqu'à 100 µL de PBS, ajouter les coloration des anticorps à une dilution au 1/100 et incuber pendant 1 heure à 4 ° C.
      NOTE : Exemple anticorps utilisés avec succès sont FITC conjugué anti rat souris Ig λ1, λ2, λ3 chaîne légère, clone R26 46 pour détecter les MHC-Ig et souris conjuguée FITC anti arménien/Syrian hamster IgG, clone G192-1, afin de détecter la anti-souris CD28.
  3. Laver les particules et lire la fluorescence sur un lecteur de plaque fluorescente.
    1. Magnétiquement laver (tel que décrit à l’étape 2) les fractions de vamp tachée trois fois avec 0,5 mL de PBS.
    2. Éluer la VAMP lavé avec 0,5 mL de PBS.
    3. Ajouter 100 µL de la VAMP éluées dans une plaque 96 puits à fond plat pour lire la concentration à l’aide de l’absorbance comme étape 3.1.
    4. Prendre le restant de 400 µL, divisé en deux 200 µL d’extraits et ajouter aux deux puits dans une plaque à 96 puits, fond plat noire, polystyrène. Titrer à un ratio de 1:2 vers le bas de la plaque en prenant 100 µL de la solution et en mélangeant avec le prochain bien qu’a 100 µL de PBS dans chacun bien au moins quatre fois.
      Remarque : Les multiples moyens réplique de la mesure pour réduire le bruit dans la mesure.
    5. Sur la même plaque 96 puits noire, faire une courbe d’étalonnage de l’anticorps fluorescents utilisés sur la tache, en l’ajoutant au 1 : 200 dans un puits avec 200 µL de PBS et titration vers le bas au rapport 1:2 au moins 12 puits.
    6. Après que les anticorps fois Vamp et fluorescentes sont sur la plaque, lire la plaque avec un lecteur de plaque fluorescente.
  4. Calculer la quantité de protéines par particule. Déterminer la concentration d’anticorps en comparant les valeurs de la courbe d’étalonnage, où la concentration en anticorps est connue, en supposant un ratio de 1:1 des anticorps à la coloration détecté des anticorps. Puis en divisant cette concentration d’anticorps détectés avec la concentration des particules déterminé par l’analyse d’absorbance donnera le nombre d’anticorps par particule.

4. enrichir spécifiques de l’antigène CD8 + cellules de T avec des nanoparticules préparées artificielle des cellules présentatrices d’antigènes.

  1. Isoler des lymphocytes t CD8 +.
    1. Euthanasier les animaux par une exposition à l’isoflurane suivie par dislocation cervicale.
    2. Enlever la rate et les ganglions lymphatiques des souris C57BL/6j de type sauvage et placer dans une solution de PBS. Faire macérer les organes et éluer les cellules à travers un tamis de cellule µm 70 stériles avec des lavages fréquents de PBS.
    3. Pour éliminer les cellules non - T CD8 +, utiliser un kit d’isolation cellulaire sans contact T CD8 + et suivez les instructions du fabricant.
      Remarque : Chaque condition d’antigène nécessite au moins 3 x 106 cellules T CD8 +.
  2. Ajouter la VAMP de nanoparticules pour lier aux cellules T CD8 +.
    1. Suite à l’isolement, se concentrer sur un volume de 100 µL de PBS avec 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM EDTA.
    2. Déterminer le nombre de vamp à ajouter en calculant selon le ratio de 1011 vamp-lié, peptide-chargé MHC-Ig pour chaque 106 cellules de T CD8 +.
    3. Incuber les particules de Vamp et cellules T CD8 + pendant 1 h à 4 ° C, avec un mélange continuel dans un polystyrène stériles 5 mL rond tube inférieur.
  3. Préparer les médias complétée et facteur de croissance des lymphocytes T (TCGF) à éluer et culture des lymphocytes t CD8 +.
    1. Pour les médias supplémentés, Supplément médias RPMI 1640 (avec glutamine) avec 1 x non essentiels, acides aminés, pyruvate de sodium 1 mM, 0,4 x solution de vitamine, 92 2-mercaptoéthanol µM, 10 µM ciprofloxacine et 10 % sérum fœtal (SVF).
    2. Pour rendre le TCGF, suivre les protocoles déjà établis et référencés ici9.
      Remarque : TCGF est un cocktail maison de cytokines immunitaire humaine, qui est essentiel pour fournir des cellules T avec des signaux de stimulation supplémentaires nécessaires à la culture. TCGF pourrait être échangé pour des lymphocytes T connu stimulateur cytokines telles qu’il-2, IL-7, ou IL-15 ; Cependant, chacun peut polariser la réponse des lymphocytes T en conséquence. Le protocole décrit ci-après n’a pas été optimisé avec ces cocktails ; donc autres techniques devraient être consultés pour les concentrations et regroupements si TCGF n’est pas utilisé avec les exemples énumérés10,11.
  4. Laver et enrichir la vamp et mélange de cellules T CD8 +.
    1. Laver la VAMP de particule magnétique tel que décrit à l’étape 2. Cependant, laver tout d’abord, avec le tampon PBS avec 0,5 % BSA et 2 mM EDTA, à l’aide de deuxième complétée médias et à l’aide de tiers complétés médias avec 1 % TCGF.
    2. Éluer la vamp et enrichi des cellules T CD8 + dans 500 µL de médias supplémentés avec 1 % TCGF.
    3. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et la plaque dans la plaque de fond U 96 dans 160 µL / puits des médias supplémentés avec 1 % TCGF à une concentration de 2, 5 x 105 T CD8 + cellules/mL.
    4. S’isoler à l’aide de vamp avec ne peptide-chargés MHC-Ig sur la surface (aucun signal de costimulation), puis complète étape 4.5. Si l’isolant à l’aide de vamp avec les deux chargés en peptide MHC-Ig sur les signaux de costimulation et de surface, passez à l’étape 5.
  5. Ajoutez les particules magnétiques revêtues avec des signaux de costimulation sur la surface à la fraction enrichie ainsi un champ magnétique pour cluster conjointement les signaux de stimulation sur la surface des cellules T.
    1. Les fractions enrichies, ajouter un équimolaire (ou plus selon la demande-Voir la section sur les propriétés de la VAMP de contrôle) d’anticorps stimulant au nombre de chargés en peptide MHC-Ig sur la particule.
    2. Laisser des particules magnétiques costimulation se lier à des cellules T CD8 + enrichis pendant 1 h à 4 ° C.
    3. Ajouter champ magnétique en plaçant la plaque de culture entre deux aimants en néodyme N52 disque de 1,9 cm (0,75 po) de longueur.
      NOTE : N52 disque aimants ont un champ extrêmement fort. Il faut aussi bien les entreposer avec entretoises entre les aimants, comme il est difficile d’enlever un de l’autre et quand mettre sur les plaques de culture. Pour minimiser les aimants de coller sur les parties métalliques de l’incubateur, les placer dans des contenants en styromousse 50 mL tube conique sur le bas et le haut.

5. développez et détecter des cellules de T spécifiques de l’antigène CD8 + avec nanoparticules préparées artificielle des cellules présentatrices d’antigènes.

  1. Ajouter la plaque bien à fond U 96 avec Vamp et lymphocytes t CD8 + dans un humidifié de 5 % de CO2, incubateur de 37 ° C pendant 3 jours. Le jour 3, nourrir les cellules avec 80 µL / puits des médias supplémentés avec 2 % TCGF et la place dans la couveuse jusqu’au jour 7.
  2. Jour 7, récolter les cellules stimulées dans un rond tube inférieur pour le comptage de 5 mL.
  3. Une fois toutes les solution est récoltée, centrifuger les cellules récoltées pour remettre en suspension dans 0,5 mL de PBS avec l’azoture de sodium 0,05 % et 2 % FBS. Compter les cellules viables par coloration au bleu trypan et compter sur un hémocytomètre.
  4. Retirer 50 000-500 000 cellules comptées dans deux nouveaux 5 mL tubes de fond pour une coloration spécifique de l’antigène. Un tube sera utilisé pour la tache de MHC-peptide apparenté, et l’autre tube servira pour la tache non apparenté à déterminer la coloration de fond.
  5. Ajouter 1 µg de biotinylé MHC-Ig (en utilisant la technique décrite à l’étape 2) pour les tubes apparenté respectif et non apparenté dans 100 µL de PBS avec l’azoture de sodium 0,05 % et 2 % FBS avec allophycocyanin (APC)-anti-souris conjugués rat CD8a, clone 53-6,7 (taux de dilution de 1/100) pendant 1 h à 4 ° C.
  6. Ajouter secondaire streptavidine et tache morte en direct. Lavent par excès biotinylé MHC-Ig avec du PBS par centrifugation. Alors tache de tous les échantillons avec un ratio de 1:350 de la phycoérythrine (PE)-étiqueté ratio streptavidine et 1/1000 d’une tache de vivre/morts fixable cellule morte verte pendant 15 min à 4 ° C.
  7. Lire tous les échantillons sur un cytomètre en flux pour déterminer la spécificité et le nombre de cellules antigène-spécifiques.
    1. Nettoyez secondaires excédentaires et vivre/dé tache par centrifugation et remettre en suspension avec 150 µL de tampon PBS avec l’azoture de sodium 0,05 % et 2 % FBS à lire sur un cytomètre en flux.
  8. Déterminer le nombre et le pourcentage de cellules spécifiques de l’antigène avec logiciel d’analyse de données.
    1. Pour déterminer le pourcentage de cellules antigène-spécifiques, utilisez les portes suivantes dans l’ordre respectif live +, lymphocytes + (forward scatter par diffusion latérale), CD8 + et dimère +. Déterminer la dimère + porte en comparant la non-apparenté à la tache apparentée.
    2. Déterminer le pourcentage de cellules spécifiques de l’antigène dans un échantillon en soustrayant le pourcentage de dimère + de la tache de MHC-Ig apparentée de la tache de MHC-Ig non apparenté.
    3. À l’aide de ce pourcentage de cellules spécifiques de l’antigène, multipliez par le nombre de cellules comptées, ce qui donne le nombre de cellules antigène-spécifiques résultants de l’enrichissement et l’expansion.
      Remarque : Compensation devra être mis en place sur le cytomètre en flux étant donné le chevauchement spectrale avec des fluorophores utilisés dans ce panneau.

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Representative Results

Pour compléter un enrichissement réussie et l’expansion des cellules T spécifiques de l’antigène, le peptide-chargé MHC-Ig et les molécules de costimulation doivent être fixés avec succès à la particule de vamp. Basé sur les 3 méthodes de fixation de la particule, nous fournir des données représentatives pour un résultat de procédure conjugaison réussie (Figure 5 a). En effet, si la densité de ligand est trop faible, alors il sera pas une stimulation efficace des cellules de T CD8 + spécifiques de l’antigène où cela se produit autour d’espacement linéaire entre les ligands supérieurs à 100 nm dans notre expérience (Figure 5 b)7.

Outre les affichages quantitative d’anticorps fluorescents et transgéniques expansions de cellules T CD8 +, vamp NANOPARTICULE peut être vérifiée pour contrôle de la qualité par le dopage en délivre-t-il cellules transgéniques de T CD8 + spécifiques de l’antigène. Cela peut être fait en isolant des cellules T CD8 + d’une souris transgénique tel qu’une souris Pmel qui a des cellules de T CD8 + spécifiques de l’antigène spécifique gp100 et dopage dans un fond de B6 à un ratio de 1/1000. Comptage et coloration avant et après enrichissement permettent l’énumération de l’enrichissement de pli (Figure 6 a) et le pourcentage de récupération (Figure 6 b),6. Dans ces résultats représentatifs, nous démontrons que signal-1 seule vamp fournisse le plus efficace enrichissement (presque 10 fois) et près de 80 % cellules récupération, qui s’enrichit sur vamp traditionnelle signal 1 et 2 qui est non spécifiques anti-CD28 sur les particules aussi bien.

Une fois vamp de particules ont été suffisamment caractérisés et contrôle de qualité, alors ils peuvent être utilisés dans l’enrichissement et l’expansion des cellules de T CD8 + spécifiques de l’antigène rares chez des souris de type sauvage. Pour des résultats précis, il est essentiel de disposer des réactifs de détection fonctionnels, tels que le dimère biotinylé. Le contrôle de la qualité du dimère biotinylé est aussi possible sur les cellules T CD8 + transgéniques pour vérifier la coloration. Ici, les résultats représentatifs montrent la coloration positive avec les cellules T CD8 + spécifiques gp100 avec les lymphocytes t CD8 + B6 comme un contrôle de fond (Figure 7). La figure 7 illustre aussi que s’il y en a trop élevé des niveaux du dimère biotinylé, puis elle va diminuer son avidité que rivaliser avec lui-même et pièce de liaison mono-valent.

Après l’enrichissement et l’expansion des cellules T CD8 + souris pendant sept jours, on pourrait s’attendre entre 5 et 50 pour cent cellules T CD8 + d’antigène-spécifiques, avec presque 20 000 à 200 000 cellules de T CD8 + spécifiques de l’antigène après avoir démarré avec 5 x 106 cellules de T CD8 + par condition (Figure 8) 6. plus précisément, en souillant des cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène, il est essentiel de connaître le fond de coloration du dimère biotinylé, où dans ce cas c’est 4,15 % ; un pourcentage inférieur à cela de la tache apparentée est considéré comme un résultat négatif (Figure 8 a). En outre, cela montrera où tracer les portes de cytométrie de flux pour déterminer le pourcentage réel des cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène. Ceci est important dans les cas où les cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène n’ont pas de populations distinctes (tel qu’illustré en Figure 8 a), mais peuvent apparaître comme un frottis large.

Le même procédé permet d’isoler et de stimuler les cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène humains. Contrôle de la qualité et des résultats similaires devraient être considérées où on observe des augmentations substantielles en pourcentages et le nombre de cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène après seulement une semaine d’expansion suite à l' enrichissement (Figure 9)5.

Figure 1
Figure 1 : Schéma du processus d’enrichissement de l’antigène-spécifiques et expansion à l’aide de cellules présentatrices d’antigène artificielles de nanoparticules. Tout d’abord, compléter une isolation sans contact de cellules T CD8 +. Ensuite, ajoutez des nanoparticules vamp aux cellules T CD8 +. Enrichir avec un champ magnétique, la culture et de stimuler avec vamp. Enfin, détecter des cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène enrichis et élargis par cytométrie en flux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: schéma de conjugaison chargés en peptide MHC-Ig et les molécules de costimulation à la surface des particules magnétiques recouvertes d’amine. En bref, Sulfo-CCAP RETICULATION sert à fonctionnaliser la surface des particules magnétiques avec groupes fonctionnels maléimide. MHC-Ig et les molécules de costimulation sont simultanément fonctionnalisés avec des réactifs de Traut pour produire des groupes fonctionnels de thiol. Les particules activées et les signaux de la protéine sont réagi ensemble et ensuite lavés pour produire l’antigène-spécifiques artificielles présentatrices d’antigène cellulaire des nanoparticules magnétiques. Ce chiffre a été modifié par matériel supplémentaire de publication de notre laboratoire de Nano lettres7. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: schéma de conjugaison chargés en peptide MHC-Ig et les molécules de costimulation à la surface des particules magnétiques enduit NHS. Brièvement, les particules revêtus NHS sont a réagi avec chargement peptide MHC-Ig et les molécules de costimulation et ensuite lavés pour produire l’antigène-spécifiques artificielles présentatrices d’antigène cellulaire des nanoparticules magnétiques. Ce chiffre a été modifié par matériel supplémentaire de publication de notre laboratoire de Nano lettres7. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Schéma de conjugaison chargés en peptide MHC-Ig et les molécules de costimulation à la surface des particules magnétiques biotin-enduit. MHC-Ig et les molécules de costimulation sont fonctionnalisés avec NHS-biotine pour produire des groupes fonctionnels biotine. Puis les particules biotin-enduits sont a réagi ainsi que les chargés en peptide fonctionnalisé MHC-Ig et les molécules de costimulation. Par la suite, ces particules sont lavés pour produire l’antigène-spécifiques artificielles présentatrices d’antigène cellulaire des nanoparticules magnétiques. Ce chiffre a été modifié par matériel supplémentaire de publication de notre laboratoire de Nano lettres7. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Efficacité de conjugaison est critique pour l’enrichissement et l’expansion des cellules T spécifiques de l’antigène. (une) base de données représentante pour l’efficacité de la conjugaison avec les méthodes de la conjugaison de trois à trois différentes particules magnétiques décrites dans le document : particules recouvertes d’amine, particules recouvertes de NHS et particules biotin-enduites. Chaque point de données représente une technique de préparation des différentes particules et barres d’erreur représentent S.E.M. (b) Comment ligand densité affecte transgéniques CD8 + stimulation des lymphocytes T, où la densité de ligand est représentée comme un espacement linéaire entre ligands en nanomètres sur 600 nm et 50 nm VAMP (n = 5 et les barres d’erreur représentent S.E.M.). Ce chiffre a été modifié par la publication de notre laboratoire Nano lettres7. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Contrôle de la qualité de l’enrichissement de la vamp. Cellules T CD8 + de transgéniques Pmel gp100 spécifiques ont été dopés à un ratio de 1/1000 dans les cellules T CD8 + B6 de type sauvage. b fold enrichissement a été mesurée par cytométrie en flux, suite à l’enrichissement par le marqueur congéniques de coloration Thy1.1 et CD8. Voilà une comparaison entre les seules particules signal 1 ou Db-Ig chargés de gp100, particules traditionnel signal 1 et 2 ou Db-Ig chargé avec gp100 et anti-CD28 et particules non apparenté signal 1 et 2. (b) les cellules ont été comptés aussi avant et après pour mesurer la récupération de cellules par chacune des méthodes. Données représentent trois expériences indépendantes et représentent de barres d’erreur S.E.M. données combinées a été mesurée par ANOVA à avec après le test de Tukey (*p< 0,05, **p< 0,01). Ce chiffre a été modifié par la publication de notre laboratoire en Lettres de Nano6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Contrôle de la qualité du dimère biotinylé. Les cellules T CD8 + spécifiques Gp100 ont été isolés chez des souris transgénique Pmel et colorées dans 100 µL de PBS avec trois concentrations de biotinylé Db-Ig chargé avec gp100 et APC anti-CD8a, à l’aide de cellules T CD8 + B6 type sauvage comme témoin négatif. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : L’enrichissement et l’expansion des cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène. B6 type sauvage les cellules T CD8 + ont été enrichis avec soit 1 uniquement (Ko-Ig chargé avec TRP2) de signal ou signal 1 et 2 (Ko-Ig chargé avec TRP2 et anti-CD28, conjugué à la surface de la particule). Signal 2 est ensuite ajouté à la fraction enrichie de signal 1 seul Vamp et toutes les cellules ont été cultivés pendant 7 jours. (a) lymphocytes t CD8 + est colorées et contrôlé sur une tache fluorescente live/morts, puis gated CD8 + et KbTRP2 + et par rapport à une non-apparenté Ko-Ig pour détecter les cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène. (b) pourcentage et (c) nombre de lymphocytes t CD8 + spécifiques TRP2 pourrait donc être déterminé, où un pourcentage plus élevé et le nombre de cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène pouvait être détecté à l’approche de l’enrichissement seul signal 1 (n = 7, barres d’erreur représentent déviation standard, test t apparié à deux queues *p < 0,05, **p < 0,01). Ce chiffre a été modifié par la publication de notre laboratoire en Lettres de Nano6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : L’enrichissement et l’expansion des cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène. (a) représentant flow cytometry parcelles au jour 0 avant l’enrichissement et le 7e jour montrent les effets dramatiques d’enrichir et de développer des cellules de T CD8 + spécifiques de l’antigène de donneurs sains avec Vamp NANOPARTICULE traditionnel où A2-Ig rempli de NY-ESO1 et A2-Ig truffé de MART1 antigènes sont indiqués. (b) cette opération génère un pourcentage élevé (environ 10-20 %) et nombres (0,5 à 1 x 106) des cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène par jour 7 (n = 3 de donateurs indépendants, les barres d’erreur représentent S.E.M.). Ce chiffre a été modifié depuis la publication de notre laboratoire ACS Nano5. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Fichier complémentaire 1-Box 1. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier. 

Fichier complémentaire 2-Box 2. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier. 

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Discussion

Nous avons créé une technologie d’isolement des lymphocytes de T antigène-spécifiques nouveaux issue des nanoparticules artificiel (VAMP) des cellules présentatrices d’antigènes. Vamp de nanoparticules ont peptide-chargés MHC sur la surface qui permet la liaison spécifique de l’antigène des lymphocytes T et activation aux côtés de costimulation activation. Vamp est également paramagnétique et donc peut être utilisé pour enrichir les rares cellules de T antigène-spécifiques en utilisant un champ magnétique. Nous avons optimisé et étudié les propriétés clés de nanoparticules de taille, densité de ligand et choix de ligand et leur influence sur la liaison, enrichissement, activation et cellule-enrichissement (Fichier complémentaire 1-encadré 1).

Ainsi, les résultats de procédure de l’enrichissement et l’expansion dans l’expansion des cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène de plusieurs thousand-fold produisant des pourcentages d’antigène-spécifiques aussi haut que 60 % et, peuvent être utilisés dans des environnements murins et humains (Fichier complémentaire 2-boîte de 2 ). Tel un nombre élevé et les pourcentages de cellules T spécifiques de l’antigène permettent la caractérisation de la réponse immunitaire pour les maladies (p. ex.., cancer, auto-immunes, etc.), permettant la découverte de nouvelles cibles immunitaires et mécanismes et offrent la possibilité d’être utilisé en immunothérapie adoptive. Un exemple d’une application spécifique est de séquencer la tumeur du patient, identifier les mutations, localiser potentiels MHC-liants des séquences de mutants, produire vamp avec des antigènes de meilleur candidat et ensuite utiliser la VAMP pour déterminer si le patient présente une néoantigènes spécifique.

En effet, les limites méthodologiques ont été des principaux obstacles à l’étude et l’identification des réactions antigène-spécifiques. Les techniques actuelles (a) exigent procédures substantielle et travaux-beaucoup de temps, difficultés (b) présentes dans le maintien des lignées cellulaires tels que la nécessité de recueillir des cellules dendritiques autologues, (c) semaines d’expansion des cellules T avant d’obtenir des résultats, résultat (d) en faible spécificité (1-2 %) et le faible nombre de T CD8 + spécifiques de l’antigène cellules, (e) souvent avec signal de fond importantes et les cellules (f) le T CD8 + qui sont produites souvent non utilisable et étudié lors d’essais de plus. Une méthode exige la vaccination avec l’antigène avant ELISPOT pour caractériser la présence d’antigène-spécifiques réponse14,15,16,17. Une autre méthode utilisant des plasmides de tandem-mini-gene expression pour transfecter cellules présentatrices nécessite multiplexage tétramère taches à l’aide de cytokine + réponses comme IFNγ pour augmenter la sensibilité18. Même peptide "pulsé" endogènes cellules présentatrices dans la culture in vitro , n’entraîne une augmentation de 0,5 % à l’antigène spécificité15.

Notre approche permet de résoudre ces limites méthodologiques et peut donc agir comme un outil diagnostique et thérapeutique. Étapes critiques à faire en sorte de CD8 + enrichissement de lymphocytes T spécifiques de l’antigène et l’expansion sont à 1) effectivement charger MHC-Ig avec antigène peptidique, 2) conjugué des signaux stimulants à la surface des nanoparticules, 3) lier les particules aux cellules T, 4) enrichissent les cellules liés à les nanoparticules avec un champ magnétique, 5) développez éluées nanoparticules lié aux cellules de T en culture et 6) détection spécifique de l’antigène T CD8 + cellules jour 7 avec biotinylé, chargés en peptide MHC.

Les principaux problèmes qui émergent dans le protocole d’enrichissement et d’expansion proviennent de la production inadéquate ou réactifs de détection expirée ou nanoparticules vamp. Veiller à ce que le dimère biotinylés peut tacher les cellules T CD8 + spécifiques à l’antigène des tests sur des cellules T CD8 + spécifiques de l’antigène transgéniques. Si l’Ig-MHC-peptide n’a pas un modèle de souris transgénique correspondant, il peut être utile charger un peptide de contrôle positif et de tester le contrôle positif pour vérifier le chargement. Toutefois, certains peptides ne peuvent pas charger dans le MHC-Ig ; Cela peut être simulée avec des algorithmes tels que Net-MHC MHC-chargement ou expérimentalement avec RMA-cellule selon essais13. stabilité de particules vamp peut-être diminuer après 6 mois, donc si il y a certaine variabilité dans les résultats de l’enrichissement et l’expansion, puis un autre fluorescent assay lecteur de plaque peut être réalisée pour vérifier la stabilité.

Travailler à l’avenir, notre objectif est d’étendre les capacités, largeur et profondeur du dosage. Nous travaillons sur l’augmentation du débit et la possibilité de multiplexer avec plusieurs antigènes examinés simultanément dans un format de plaque à 96 puits. Actuellement, une principale limite est que seulement quelques antigènes peuvent être étudiées en même temps. Nous travaillons en examinant comment la taille de la densité de particule Vamp et ligand influe sur l’enrichissement. En outre, nous examinons comment les différentes compositions effet T CD8 + cell expansion des cellules dans la culture. Enfin, nous visons à imiter cette technologie au sein du CMH de classe II pour pouvoir enrichir et élargir les cellules CD4 + T antigène-spécifiques.

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Disclosures

Les auteurs déclarent les intérêts financiers concurrents suivants : en vertu d’un accord de licence entre NexImmune et l’Université Johns Hopkins, Jonathan Schneck a droit à une part des redevances reçues par l’Université sur les ventes de produits décrits dans ce article. Il a également été des fondateurs de NexImmune et possède l’équité dans la société. Il est membre de la du NexImmune Conseil d’administration et Conseil scientifique. Aux termes de ces arrangements ont été examinés et approuvés par l’Université Johns Hopkins, conformément à sa politique de conflit d’intérêts.

Acknowledgments

J.W.H. remercie le centre de formation de la nanotechnologie de Cancer NIH au Johns Hopkins Institute nanobiotechnologie, la National Science Foundation recherche bourse d’études supérieures (DGE-1232825) et la Fondation d’ARCS de soutien de la bourse. Ce travail a été financé par le soutien de la National Institutes of Health (P01-AI072677, CA108835-R01, R21-CA185819), Initiative Innovation TEDCO/Maryland et la Fondation Coulter (JPS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein BD Biosciences 551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig BD Biosciences 551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein BD Biosciences 550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932257
Purified Human Beta 2 Microglobulin Bio-Rad PHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles Micromod 79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm Ocean Nanotech SN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure Miltenyi 130-105-637
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217
Sulfo-SMCC Crosslinker  ProteoChem c1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene Corning 3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46   BD Biosciences 553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1 BD Biosciences 554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice Jackson Laboratory 005023
C57BL/6J (B6 wildtype) mice Jackson Laboratory 000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse Miltenyi 130-104-075
MS Columns Miltenyi 130-042-201
LS Columns Miltenyi 130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE Biolegend 405203
N52 disk magnets of 0.75 inches  K&J Magnetics DX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 Biolegend 100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation  ThermoFisher L-34969

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References

  1. Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).
  2. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  3. Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
  4. Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).
  5. Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
  6. Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
  7. Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
  8. ,, et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
  9. Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
  10. Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
  11. Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
  12. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
  13. Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
  14. Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
  15. Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
  16. Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
  17. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572 (2014).
  18. Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).

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Ingénierie numéro 141 nanoparticules enrichissement magnétique cellules présentatrices d’antigène artificielles lymphocytes T immunothérapie cancer enrichissement de cellules rares expansion des cellules T adoptifs T cell therapy Neoantigen immunoengineering bio-ingénierie
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