Denne protokol beskriver mikroinjektion metoder, som vi har standardiseret og brugt i flere år til at levere bestemte mængder af nukleinsyrer direkte til hemolymph af myg og stuefluer. Denne protokol resultater i minimal injektion dødelighed og tillader dosis korreleret målinger af frugtbarhed.
Syntetiske dsRNAs, anvendes til at fremkalde RNA-interferens, kan have dosis afhængige fænotypisk virkninger. Disse virkninger er vanskelige at definere hvis dsRNAs leveres ved hjælp af en ikke-kvantitativ metode. Præcis levering af kendte mængder af nukleinsyrer eller andre kemikalier er kritisk at måle effekten af den sammensatte testes og give pålidelig sammenligning mellem forbindelser.
Her giver vi en reproducerbar, kvantitative mikroinjektion protokol, der sikrer præcis levering af særlige doser af dsRNA, reducere dødeligheden typisk fremkaldt ved injektion skade. Disse ændringer omfatter tilføjelse af rhodaminfilteret B, en gradueret injektion nål, og en forbedret genoprettelsesmetode lånt fra Isoe og Collins. Denne metode giver mulighed for beregning af dosis svar og letter sammenligninger mellem forbindelser. Versioner af denne metode er brugt med succes på tre slægter af myg samt stuefluer for at vurdere reduktionen i frugtbarhed som følge af genhæmning af ribosomale RNA udskrifter.
Denne protokol giver strategier til at reducere flere udfordringer af små insekt mikroinjektion. Sammen, mekanisk levering af dsRNAs ledsaget af visuel kontrol, identifikation af effektiv steder for levering og medtagelsen af en post injektion tilbagebetalingsperioden sikrer nøjagtig dosering og lave skade dødelighed. Denne protokol beskriver også en oviposition bioassay for ensartet bestemmelse af effekter på fertilitet.
Leverer små biomolekyler, såsom nukleinsyrer, til voksen dipterans har vist sig for at være udfordrende i både Culicidae og Muscidae. Oral optagelse af dsRNAs er blevet rapporteret til at producere sterilitet (når målretning gener udelukkende udtrykt i testiklerne af voksne) og dødelighed (når rettet mod SNF7 og en steroid receptor coactivator) i larve Aedes aegypti1,2 . Dødelighed er også blevet observeret, når målretning HSP70 i larve Musca domestica3. Sådanne fænotypisk virkninger, har imidlertid ikke ført efter fodring dsRNA til voksen Ae. aegypti i sukker måltider4,5.
Mikroinjektion er blevet brugt til at omgå midgut, når vi indfører patogener eller nukleinsyrer, dermed inducere en systemisk reaktion5,6,7,8,9,10 . Flere mikroinjektion teknikker findes, der involverer udstyr lige fra internt producerede apparater, der kræver visuel måling af Injektionsvolumen til mikroprocessor-kontrolleret injektorer, der giver mulighed for automatiseret volumen levering så lavt som 2.3 nL 5 , 9 , 10 , 11. RNA interferens (RNAi) udløser målretning ribosomale mRNAs, forstyrre æggestokkene udvikling i leddyr så forskellige som kvæg kryds Rhipicephalus microplus, myg Aedes aegypti og Culex pipiens, og huset flyve Musca domestica5,9,12,13. I disse undersøgelser var overvågning afbrydelse af oviposition af afgørende betydning for bestemmelse af effektiviteten af inoculant som Fænotypen kan manifestere sig som bringes til ophør eller nedsættelse af afkommet. Dette er en form for mindretalsspørgsmålet dødbringende fænotype, der er en kritisk og ønskede effekt i mange af de ikke-traditionelle biocontrol metoder som Wolbachia –inficeret hanner Introduktion (seksuelle uforenelighed) og RNAi induceret sterilitet5 ,9,14. Sporing af både dødelighed og frugtbarhed er nødvendig for kendetegner og udvikling af meget specifikke biorationals (naturligt forekommende patogener og/eller naturlige derivater)15.
Denne protokol præsenterer detaljerede mikroinjektion teknikker til både voksne myg og stuefluer; en proces, der ofte ikke er godt beskrevet i litteraturen. Derudover er oviposition bioassay metoder til tilstrækkeligt evaluere dsRNA indvirkning på voksne dipterans beskrevet. Disse protokoller blev udviklet specielt til Aedes aegypti og Musca domestica men kan ændres til andre arter.
Mikroinjektion er en værdifuld laboratorium teknik til at sikre levering af dsRNA eller andre biorationals (dvs., pesticider, virus, microsporidia). Mens mange laboratorier udfører mikroinjektion, er det nøjagtige beløb injiceres ofte uklar på grund af tekniske begrænsninger af den levering systemet hvor leverede volumen ikke direkte målte11. Leveret mængde og koncentration er kritiske parametre, der giver mulighed for beregning af toksikologiske foranstaltninger såsom EC50 eller IC50 eller for at definere minimal effektive doser5,16. Dette er især vigtigt i funktionelle studier ved hjælp af RNAi i voksen insekter, hvor levering af fodring ikke altid fører til systemisk eksponering for de ønskede partikler og den faktiske dosis krydser midgut er uklart5.
Mens mikroinjektion procedure kan være udfordrende, i første omgang, nås hurtige forbedringer i hastighed og levering nøjagtighed med praksis og tålmodighed. Mastering injektion selve proceduren er en gang investering, men når først udført, proceduren, der producerer repeterbare resultater og skade dødelighed af < 3%. Forholdet mellem vellykket injektioner vil stige som færdigheder øger tillade injektion af 300 myg eller fluer per dag.
Mange af udfordringerne ved mikroinjektion skyldes nålen bliver brugt. Bestemmelse af korrekt kapillær nål brudpunkt og spids vinkel er en udfordrende aspekt af proceduren og kræver nogle trial and error til at bestemme den mest effektive åbning størrelse for en given art. Den fin nål mest nyttige for myg mikroinjektion (~ 150 µm) er for små til at hurtigt levere den større mængde injiceres fluer, mens omvendt, større nålen åbning at værker på fluer (~ 250 µm) forårsager omfattende skade skader til mindre myg og uacceptabel injektion dødelighed. En nål med en stump spids er ofte vanskeligt at komme igennem neglebånd uden vævsskader og øget dødelighed. Insekt skalaer eller væv stykker kan tilstoppe nåle i løbet af et eksperiment, så det er ofte nyttigt at have flere nåle trak hvis udskiftning er nødvendig. Vi har fundet, at det er lettere at erstatte en vanskelig nål i stedet for at bruge tid på at forsøge at fjerne et fastklemt eller straffesparksfelt nål.
Observere injektion løsningen ind i insekt er kritisk og derfor forgæves injektioner kan fjernes (Se trin 2.14-2.15). Rodamin B supplement til injektion løsninger giver en klar visuel for at sikre, at kolde-iscenesatte insekter modtager korrekt dosering og er især nyttig, mens øve (Se trin 2.7).
Indsprøjtning og oviposition bioassay metoder præsenteres her har med held induceret gen knockdown og målbare fænotypisk virkninger i voksen Ae. aegypti og M. domestica når du bruger dsRNAs designet mod artsspecifikke ribosomale udskrifter (figur 4 og figur 5A). Desuden, denne metodes evne til præcist levere microvolumes til enkeltpersoner giver mulighed for dosis/respons-kurver skal genereres for små mængder af materiale (så lavt som 50 ng; Figur 5B). Dette er især nyttigt for metoder såsom screening siRNAs eller dsRNAs, som producerer store mængder af disse molekyler kan være cost-uoverkommelige.
Denne metode kan ændres til at injicere biologiske agenser (vira, bakterier, microsporidia) eller kemiske pesticider, efter at sikre, at enhver levering buffere er uskadelige ved injektion. Levering volumen er begrænset af størrelsen af insekt, producerer koncentreret er test solutions af betydning.
Til at tilstrækkeligt vurdere dsRNA effektivitet, er det nødvendigt at spore oviposition som dødbringende fænotyper kan kun manifestere i afkom. Som præsenteres her, holde kvindelige Ae. aegypti separat efter blooding giver mulighed for individuelle kobling størrelsesbestemmelse og yderligere test på de samme individer kan gøres neden for oviposition (dvs. gen expression undersøgelser, yderligere gonotrophic cyklusser, væv specifikke knockdown) at korrelere formeringsevnen med andre foranstaltninger såsom genekspression. Som M. domestica oviposit generelt i gruppen svar, er ansporer isolerede fælderne fluer at lægge meget arbejdskraft intensiv og ikke praktisk for et stort antal individer17. Derfor præsenteres en metode til at bestemme betyde kobling størrelse.
Metoden mikroinjektion præsenteres her giver konsekvent systemisk levering til myg og stuefluer. Kombineret med dødelighed og oviposition sporing bioassays, kan disse alsidige værktøjer bruges til at vurdere effekterne transcriptional og fænotypiske små RNA molekyler, biologiske agenser og traditionelle pesticider hvor oral levering er ikke levedygtige.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Hanayo Arimoto (US Navy), Dana Johnson, Lucy Li og Roxie White (USDA-ARS) for hjælpe med dataopsamling og analyse. Vi takker også Drs. Pia Olafson (USDA-ARS) og Ke Wu (University of Florida) for kritisk gennemgang af håndskriftet og Niklaus Hostettler (University of Florida) til at filme mikroskop optagelser. Finansieringen blev leveret af USDA, WII – 141C projektet af søværnet og Marine Corps Public Health Center og indsat krig krigere Protection Program. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i design eller retning af forsøget eller udviklingen af håndskriftet.
needle pulling | |||
vertical pipette puller | Kopf | 720 | settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps |
glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | capillaries for pulling glass needles |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
microinjector station | |||
Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | microinjector |
manual micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-L | left hand KITE manipulator |
magnetic stand | World Precision Instruments | M9 | holds micromanipulator |
precision stereo zoom binocular microscope on boom stand | World Precision Instruments | PZMIII-BS | dissecting scope for microinjections |
1.5X objective | World Precision Instruments | 501377 | objective for microscope |
light LED ring | World Precision Instruments | 504134 | light ring for injection microscope |
laboratory chill table | BioQuip Products | 1431 | chill table for microinjections |
microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | for staging insects while injections |
Rhodamine B, 98+% | Acros Organics | AC296571000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
mosquito oviposition bioassays | |||
large Petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | for holding staging slides |
plastic cup – 3 1/2 oz. | Dart Container Corporation | TK35 | mosquito oviposition bioassay cups |
matte tulle fabric | Joanne Fabrics | 1103068 | caps for oviposition bioassays |
blood source | locally acquired | typically bovine or live chickens | |
1 x 30mm clear edible collagen casing | Butcher and Packer | 30D02-05 | |
heavy weight seed germination paper | Anchor Paper Co | SD7615L | |
oral aspirator with HEPA filter | John W. Hock Company | 612 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
house fly oviposition bioassays | |||
4 L plastic food storage canister | Walmart | 555115143 | |
10-inch stockinette sleeve | Medonthego.com | FS15001H | |
wheat bran | locally acquired | typically found at feed stores | |
Calf Manna performance supplement | ValleyVetSupply.com | 16731 | pelleted livestock feed |
dried egg yolk | BulkFoods.com | 40506 | |
black cotton cloth | locally acquired | typically in craft supplies section | |
60 mL cup | Dart Container Corporation | P200-N |