Summary
Ce protocole décrit une méthode de microinjection que nous avons normalisé et utilisé depuis plusieurs années à livrer des quantités d’acides nucléiques spécifiques directement à l’hémolymphe des moustiques et des mouches domestiques. Ce protocole se traduit par la mortalité injection minime et permet des mesures de dose en corrélation de la fécondité.
Abstract
ARN doubles brins synthétiques, utilisé pour induire l’interférence ARN, peuvent avoir des effets phénotypiques dépendantes des doses. Ces effets sont difficiles à définir si de l’ARNdb est livrés à l’aide d’une méthode non quantitatifs. Livraison précise des quantités connues d’acides nucléiques ou autres produits chimiques est essentiel pour mesurer l’efficacité de la molécule testée et pour permettre une comparaison fiable entre les composés.
Ici, nous fournissons un protocole de microinjection reproductible, quantitative qui assure la prestation exacte des doses précises de dsRNA, réduisant le taux de mortalité généralement induite par injection blessure. Ces modifications comprennent l’ajout de la Rhodamine B, une aiguille à injection graduée, et une méthode de récupération améliorée emprunté Isoe et Collins. Cette méthode permet le calcul des doses réponses et facilite les comparaisons entre les composés. Les versions de cette méthode ont été utilisées avec succès sur trois genres de moustiques, mais aussi des mouches domestiques afin d’évaluer la réduction de la fécondité résultant de silençage génique de transcription de l’ARN ribosomique.
Ce protocole fournit des stratégies de réduction de plusieurs défis de petite insecte microinjection. Livraison ensemble, mécanique de dsRNA accompagnée d’une vérification visuelle, identification des sites efficaces pour la livraison et l’inclusion d’une période de récupération après l’injection assurer un dosage précis et mortalité faible préjudice. Ce protocole décrit également un essai biologique de ponte pour uniforme détermination des effets sur la fécondité.
Introduction
Livraison petits biomolécules, tels que les acides nucléiques, de diptères adultes s’est avéré pour être difficile dans les Culicidae et Muscidae. L’absorption orale de dsRNA a été signalée pour produire la stérilité (en ciblant exclusivement les gènes exprimés dans les testicules des adultes) et la mortalité (lors du ciblage de SNF7 et un de stéroïdes récepteur) dans les larves d’Aedes aegypti1,2 . La mortalité a également été observée lors du ciblage de HSP70 en larves Musca domestica3. Cependant, ces effets phénotypiques, n’ont pas abouti après s’être nourries ARNdb pour adultes Ae. aegypti en sucre repas4,5.
Microinjection a été utilisée pour contourner l’intestin moyen lors de l’introduction d’agents pathogènes ou les acides nucléiques, induisant ainsi une réponse systémique5,6,7,8,9,10 . Il existe des plusieurs techniques de microinjection, impliquant des équipements allant des appareils produits internes nécessitant une mesure visuelle du volume d’injection aux injecteurs contrôlé par microprocesseur qui permettre la livraison automatisée des volumes aussi bas que 2.3 nL 5 , 9 , 10 , 11. RNA interférence (ARNi) déclencheurs ciblant l’ARNm ribosomique, perturber le développement ovarien chez les arthropodes aussi divers que la tique du bétail Rhipicephalus microplus, les moustiques Aedes aegypti et Culex pipiens, et la mouche domestique, Musca domestica5,9,12,13. Dans ces études, la perturbation de la ponte de surveillance était essentielle pour déterminer l’efficacité de l’inoculant comme le phénotype peut-être se manifester comme la cessation ou la réduction de la descendance. Il s’agit d’une forme de multigénérationnelle phénotype létale qui est un effet critique et désiré dans un grand nombre des méthodes non traditionnelles de lutte biologique comme Wolbachia -infecté introduction mâles (incompatibilité sexuelle) et Arni induit la stérilité5 ,9,14. Suivi de la mortalité et fécondité est nécessaire pour le caractériser et le développement de biorationals très spécifique (pathogènes naturels ou naturels dérivés)15.
Ce protocole présente les techniques de microinjection détaillées pour les moustiques adultes et mouches domestiques ; un processus qui n’est souvent pas bien décrite dans la littérature. En outre, méthodes d’essai biologique Ponte pour évaluer adéquatement les effets de dsRNA sur diptères adultes sont décrits. Ces protocoles ont été développés spécifiquement pour les Aedes aegypti et Musca domestica , mais peuvent être modifiés pour d’autres espèces.
Protocol
1. insecte préparation
- Anesthésier les moustiques en eux au froid à 4 ° C pendant plusieurs heures ou en cas d’exposition au CO2 2 min puis maintenant à 4 ° C avant les injections. Froide anesthésier mouches à 4 ° C 2\u20123 h avant les injections. S’assurer que les moustiques et les mouches sont accouplés si la ponte est une variable de réponse.
Remarque : La méthode d’anesthetization de moustique dépend de l’espèce et la souche, par exemple, Culex récupérer beaucoup plus vite du froide anesthetization que Aedes aegypti et CO2 knockdown est donc préférable. - Sur la glace, soigneusement les moustiques stade ou mouches à l’aide de pinces souples aux pour mettre sur le ventre exposés sur microscope slides ~0.5 cm de distance. Lames standards peuvent contenir deux rangées de 6 moustiques chaque ou mouches de la maison 6 – 7. Laissez un espace de 1 à 1,5 cm à l’extrémité gauche ou droite de la diapositive claire de moustiques et les mouches pour faciliter la manipulation de diapositive.
- Garder les diapositives d’insectes mis en scène à 4 ° C dans grandes boîtes de Pétri jusqu’au moment de l’injection.
Remarque : Percer un trou dans le couvercle de la boîte de Pétri aidera à empêcher les insectes d’être dérangé par déplacement d’air lors de la limitation. Mise des diapositives sur un couple de capillaires en verre fixée sur le fond du plat facilitera la suppression de la boîte de Pétri.
2. insecte Injection
- Préparer des ARNdb tel que décrit par Estep et al. 5 et Sanscrainte et al. 9. si exempt de contaminants, dsRNA peut être quantifiée à l’aide d’un spectrophotomètre pour mesurer l’absorbance à 260 nm et calcul concentration d’ARN en μg/mL comme un facteur central des dilution260 × 40.
- Mettre en place dissection microscope et microinjector au-dessus d’une table de refroidissement éolien ou peu profond seau à glace pour effectuer des injections sur le froid anesthésiés moustiques et des mouches (voir étape 1.1-1.3 et Figure 1).
- Tirez des capillaires en verre d’une pointe fine avec extracteur de l’aiguille (paramètres : chauffage = 15 unités, solénoïde = 4 A).
Remarque : Consultez la Table des matières pour plus d’informations du fabricant. - Placez l’aiguille capillaire dans un microinjector selon les instructions du fabricant et la pointe aiguille pause en pinçant avec une paire de pinces pour produire une pointe acérée.
Remarque : Taille suggérée de l’aiguille est ~ 150 µm pour les moustiques et ~ 250 µm pour la mouche domestique. - La valeur microinjector pour le volume de livraison souhaitée. Ménisque mouvement d’aliquotes nL ~ 50 est recommandé pour des microinjections de moustique et facilement observables. Le cas échéant, activez les paramètres de l’injection rapide. Rincer l’aiguille en remplissant et en expulsant l’eau exempte de nucléase 3 fois.
- Préparer des solutions pour injection à une concentration telle que 100\u2012150 nL fournira la dose souhaitée pour les moustiques et 500 nL volonté fournir désiré dose pour les mouches domestiques.
NOTE : A suggéré des doses initiales : 1 µg pour chaque moustique et 5 µg pour chaque mouche5,9. - Éventuellement pour les moustiques, ajouter Rhodamine B (pour aider à la visualisation) aux solutions à une concentration finale de 3,0 µg/mL.
Remarque : Le colorant sera clairement visible par sa couleur rose après injection à travers la cuticule presque claire sur le ventre à l’intersection de l’abdomen/thorax. - Distribuer 3 – 4 µL de solution d’injecter sur une surface propre (par exemple, un morceau de pellicule de paraffine) et amener l’aiguille de verre sans aspirer tout l’air. Enfoncez le bouton d’inject à plusieurs reprises jusqu'à ce que le liquide commence à distribuer de l’aiguille et effacer doucement gouttes avec un chiffon de tâche délicate.
Remarque : Bien que certains modèles de microinjectors doivent remblayer la seringue, l’injecteur référencée dans la Table des matières ne fonctionne pas. - À l’aide d’un marqueur pointe ultra fine, dessiner dièses ~ 1 mm apart à partir le ménisque du liquid sur le manche de l’aiguille. Cela aidera à visualiser le mouvement du ménisque et veiller à ce que la solution est entré dans le moustique pendant l’injection.
- Réglez la glissière de moustiques et les mouches (tel qu’établi dans les étapes 1,2-1,3) sous l’aiguille sur le refroidissement éolien de table ou de la glace (Figure 1). S’assurer que ce champ de vue au microscope est assez large pour voir le ménisque de solution dans l’aiguille.
- Pour les moustiques, alignez l’aiguille avec le tiers moyen de la mesokatepisternum (Figure 2 a) et tandis que contreventement le moustique contre l’aiguille avec une pince placée du côté opposé, doucement perforer la cuticule avec la pointe d’aiguille à l’aide du micromètre de microinjector.
- Pour les mouches domestiques, alignez l’aiguille avec la mesopleuron (Figure 2 b) et tout en renfort à la volée contre l’aiguille, doucement perforer la cuticule avec la pointe de l’aiguille.
- Doucement glisser l’aiguille dans le moustique ou voler le corps jusqu'à ce que la pointe a traversé la ligne médiane.
NOTE : Insertion de l’aiguille trop peu profonde souvent traduit par perler liquide injecté de l’insecte (voir étape 2.15). - Tout en regardant pour le mouvement du ménisque liquid dans l’aiguille, enfoncez le bouton d’injecter jusqu'à ce que la quantité désirée de liquide a été injectée. Pour les moustiques, si la valeur 50,6 aliquotes de nL, appuyez sur le 2 X pour ~ 100 nL ou 3 X pour ~ 150 nL. Pour les mouches domestiques, enfoncez le bouton d’injecter jusqu'à ~ 500 nL a été injecté (c'est-à-dire, avec 69 aliquotes nL Appuyez sur 7 X pour 483 nL).
- Si le ménisque ne bouge pas, lentement glisser le moustique ou l’aiguille s’envolent tout en regardant pour le mouvement du ménisque. Si une partie des perles solution injectée de la cuticule après retrait de l’aiguille, ou si le ménisque ne parvient pas à se déplacer, jeter l’insecte comme cette injection n’a pas réussie.
- Transférer les moustiques avec succès injectés dans les groupes de 10 à 15 ou mouches domestiques dans des groupes de 5 pour effacer 3.5 oz tenant des tasses. Couvrir avec tulle ou filet et récupérer à température ambiante.
- Après que les moustiques et les mouches ont récupérés (1 – 2 h), il faut inverser chaque tasse tenue sur une boule de coton imbibée d’une solution de sucrose à 10 %.
Remarque : L’inversion de la tasse sur le dessus de la SIDA de coton de saccharose en survie en fournissant un accès plus facile pour un repas de sucre10. - Aiguille de rinçage comme à l’étape 2.5 entre solutions d’injection. Quand fait par injection, jeter utilisé aiguilles dans un récipient approprié pour objets tranchants.
3. essai biologique de aedes aegypti , la mortalité et la ponte
- Pendant trois jours après l’injection, continuer à fournir des moustiques avec 10 % de sucrose et noter le nombre de moustiques visiblement morts.
- Remplir une membrane artificielle ≤ 12 pouces (tels que les boyaux de collagène de saucisse) avec du sang frais (c.-à-d. bovine pour Aedes aegypti) et faire chauffer jusqu'à 60 ° C en bain d’eau chaude.
- Brièvement, sécher la membrane en roulant sur une serviette en papier et déposer le long des caps de tulle du 3,5 oz clair tenant des tasses. Afin d’améliorer l’alimentation, doper le sang avec 1 mM ATP après la morcilla réchauffée avec les mains nues propre à quitter volatiles humains sur la surface du boîtier de chauffage comme un phagostimulant ou par la poignée.
- Après sang alimentation, remplacer la boule de coton imbibée de 10 % de saccharose sur les tasses de tenue et laissez les moustiques se reposer pendant ~ 24 h avant de les transférer aux tasses de ponte.
- Construct Ponte tasses en remplissant clairement 3,5 oz tasses de bioessai avec ~ 30 mL eau désionisée H2O et en plaçant un morceau de papier de germination de graines (~ 4 cm de large et 5 cm de long avec des crêtes vertical) au fond de la coupe et contre la paroi (Figure 3 a) . Couvrir avec tulle ou filet et couper une fente petite (~ 1 cm) dans le bouchon de tulle ou un filet.
- Au repas de sang après 24h, couper une fente petite (~ 1 cm) dans le bouchon de tulle de la tenue de coupe et de transférer seulement les femelles qui ont alimenté avec succès — avec un bolus de sang visible dans abdomen — par aspiration douce bouche dans les tasses de Ponte (1tasse femelle/Ponte). Sceller la petite incision dans le bouchon de ponte avec une boule de coton saturée de saccharose de 10 %.
- Contenir des tasses à environ 27 ° C pendant 5\u20127 jours pour permettre à moustiques à pondre pleinement tout en poursuivant la mortalité quotidienne. Compter les oeufs sous une dissection étendue.
4. essai biologique de Musca domestica , la mortalité et la ponte
- Pendant trois jours après l’injection, continuer à fournir les mouches avec 10 % de sucrose et noter le nombre de mouches visiblement morts.
- Trois jours après l’injection, anesthésier les mouches en plaçant brièvement un tube polyéthylène de débitant CO2 sur les tasses d’exploitation jusqu'à ce que toutes les mouches sont immobiles au fond des tasses.
- Transférer les mouches dans une cage propre, composée d’un pot en plastique de 4 L avec un manchon tubulaire en couvrant l’ouverture (10 cm ( Figure 3 b). Fournir des mouches avec de l’eau et un mélange de saccharose granulé, lait en poudre et séchée jaune de œuf dans un 8:8:1 ratio (en volume) pendant quatre jours, d’enregistrement et la suppression de mort vole tous les jours.
- Préparer les ingrédients secs pour un milieu d’élevage larvaire mouche frais en mélangeant 75 % son de blé avec 25 % granulés fourrage en poids. Ajouter de l’eau pour atteindre 62 % d’humidité (jusqu'à ce qu’une goutte d’eau peut à peine être évincée).
- Préparer une boule de diamètre de 2,5 cm d’un mélange de 1:1 des médias larves fraîches ci-dessus et « utilisés » volent larvaire moyen (moyenne où les mouches ont précédemment pupated). Envelopper la boule dans un carré de tissu de coton noir, serrez légèrement jusqu'à ce que le milieu liquide s’infiltre à travers, puis utiliser les bandes élastiques pour maintenir le tissu en place autour de la boule.
- Mettre la balle dans une tasse 60 mL et le placer dans la cage de voler pendant 5 h (Figure 3 b).
- Rincer les oeufs hors de la boule de ponte et veiller à ce que les œufs sont retirés sous plis dans le tissu. Secouez les œufs pour perturber les grappes et les transférer dans un tube à centrifuger jaugée de 20 mL avec une pipette de transfert.
- Attendez jusqu'à ce que les oeufs s’installer et noter le volume des oeufs sédentarisés dans le tube gradué. Ajouter suffisamment d’eau pour compléter le volume jusqu'à 20 X le volume des oeufs sédentarisés. Noter le volume total d’eau plus d’oeufs.
- Tout en mélangeant la suspension de l’eau et des oeufs avec une agitation magnétique bar ou brassage vigoureux, utiliser un embout de pipette de 1 mL (avec l’extrémité de la pointe coupée) pour distribuer 0,5 mL de la suspension de l’eau et des oeufs sur un morceau de tissu noir humide dans une série de lignes. Compter les oeufs sous un microscope à dissection.
- Répétez l’étape 4.9 deux fois plus. Si l’un des chefs d’accusation est une aberration grave (c.-à-d., diffère des deux autres comtes de > 35 %), de faire un quatrième chef et faire abstraction de la valeur aberrante.
- Calculer le nombre moyen d’oeufs par exemple et multiplier cette valeur par 2 pour obtenir le nombre d’oeufs/mL de la suspension. Multipliez la valeur oeufs/mL obtenue par le volume de la suspension de le œuf de l’étape 4,8. Il s’agit de l’estimation du nombre total de œufs pondus.
Representative Results
Microinjection de dsRNA chez les moustiques
Cette méthode de microinjection a été utilisée dans notre laboratoire afin d’évaluer l’expression des gènes, la mortalité et la réponse de ponte pour les plus de 80 dsRNA déclencheurs dans plusieurs genres de moustique (Aedes, Anopheles, Culex). Injection de femelles de la souche de la colonie Ae. aegypti (ORL1952) avec 1 µg d’ARNdb dérivé les transcriptions ribosomiques RPS6 et RPL26 (voir Estep et al. 5 pour les méthodes de production de dsRNA et données séquentielles) a montré importante réduction de l’expression relative (RE) à travers de multiples Ponte cycles par rapport aux moustiques injectés avec un dsGFP de contrôle. Aedes aegypti RE mesurée suivant 2nd cycle gonadotrophique ont montré une réduction significative de l’expression RPS6 (P < 0,05) chez les moustiques, une injection de dsRPS6 tel que déterminé par un test de Student t-entre le contrôle de dsGFP du même groupe (Figure 4),5 .
La fécondité a été évaluée de femelles individuelles à l’aide de l’essai biologique de Ponte décrit ici. Après 3 jours après injection, les moustiques ont été sang nourri, transféré dans des conteneurs individuels de la ponte et a permis d’établir à l’achèvement. Couvée moyenne pour le premier cycle gonadotrophique ont été significativement réduites pour les deux dsRPS6 traités Ae. aegypti (n = 102 femmes, 1,3 ± 0,8 (moyenne ± écart type) oeufs) et dsRPL26 traités (n = 86 femelles, 4,0 ± 1,1 œufs) par rapport à des injections de dsGFP (n = 79 femelles, 49,3 ± 3,5 œufs, Figure 5 a). Embrayage évaluation après un deuxième cycle gonadotrophique a également montré une réduction significative de ponte pour les deux groupes de dsRNA traitée, mais avec la réduction de l’effet. Taille des groupes de Ae. aegypti était variable et donc des moyens de séparation a été réalisée par Dunn essai5. Vingt-quatre heures mortalité était normalement de 3 % ou moins.
Un effet clair dose a été observé lors de l’injection dsRPS6 de 1 µg à 50 ng en femelle Ae. aegyptiet couvée variée de manière significative par rapport aux contrôles de 1 µg/femelle dsGFP injecté dans l’ensemble mais la dose de dsRPS6 de 25 ng/femelle (Figure 5 b).
Microinjection d’ARNdb dans la maison d’oiseau
Colonie Musca domestica (ORL normal) ont été injectés avec 5 µg de constructions de dsRNA conçu contre la mouche domestique de transcriptions de RPS6 et RPL269. Comme a été observée chez Ae. aegypti, une réduction significative de l’expression de transcription spécifique (RPS6 et RPL26) et la réduction de la taille de l’embrayage a été observées (Figure 4 et Figure 5 a). Une réduction significative dans l’arrêt RE a été déterminée par le test t de Student entre le contrôle de dsGFP du même groupe (P < 0,05) et le test de Holm-Sidak a été utilisé pour déterminer l’importance entre la taille des pontes pour différents M. domestica groupes de traitement. Dissections de l’ovaires a montré l’ovogenèse réduite dans les traitements dsRPS6 et dsRPL26, tandis que dsGFP nourri de mouches avait dépôt normal de vitellogénine recommandés sur l’Echelle de Tyndale Biscoe9.
Figure 1 : installation de Microinjection de prestation microvolumes à moustiques adultes et mouches domestiques. Les injections sont effectuées sur insectes anesthésiés froid mis en scène sur lames de microscope sur la table de refroidissement éolien. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Les sites de Microinjection pour Ae. aegypti et M. domestica. (A) adulte Ae. aegypti sont injectées dans le tiers moyen de la mesokatepisternum. (B) adulte M. domestica sont injectées dans la mesopleuron. Les flèches indiquent les points d’injection. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : installation de biodosage Ponte. (A) dosage de Ponte Ae. aegypti tasses avec papier de germination des semences comme un substrat de Ponte, recouvert de tulle et 10 % coton imbibé de saccharose. (B) femelles adultes M. domestica dans un conteneur de test de ponte avec alimentation (A), eau (B) et les médias larvaire (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Expression Relative de RPS6 Ae. aegypti et M. domestica reçu une injection d’ARNdb spécifiques à l’espèce. Aedes aegypti et M. domestica ont été injectés avec µg 1 et 5, respectivement de l’ARNdb de contrôle (dsGFP) ou de dsRNA conçu contre RPS6 ou RPL26, relevés de notes de chaque insecte. Réduction significative (P < 0,05) de RPS6, expression a été observée chez les moustiques et les mouches injectées avec dsRPS6 et par les mouches injectés avec dsRPL26 (indiquée par des astérisques). Barres d’erreur représentent la moyenne ± écart type et le nombre à base de colonne indique le nombre d’individus examinés. Ce chiffre a été modifié par Estep et al. 5 et Sanscrainte et al. 9. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Couvée moyenne de Ae. aegypti et M. domestica reçu une injection d’ARNdb spécifiques à l’espèce. (A) Ponte a été significativement réduite (P < 0,05) en Ae. aegypti et M. domestica après l’injection de 1 à 5 µg respectivement d’un contrôle dsRNA (dsGFP) ou dsRNA conçus contre les transcriptions RPS6 ou RPL26 de chaque insecte. Les astérisques indiquent des différences significatives du contrôle dsGFP du même groupe. Barres d’erreur représentent la moyenne ± écart type et le nombre à base de colonne indique le nombre d’individus examinés. Ce chiffre a été modifié par Estep et al. 5 et Sanscrainte et al. 9. courbe Dose (B) de l' Ae. aegypti injecté avec dsRPS6 de 50 ng/femme à 1000 ng/femelle montre une réduction significative dans la fécondité par rapport aux cohortes dsGFP injecté (50, 100 et 1000 ng/femelle). Barres d’erreur représentent la moyenne ± 95 % CI de 36-81 organismes individuels par dose. Points avec lettres représentent une différence significative entre les groupes (P < 0,05) identifiés par analyse de la variance. Ce chiffre a été modifié par Estep et al. 5. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Microinjection est une technique de laboratoire précieux pour assurer la livraison de dsRNA ou autres biorationals (c.-à-d., pesticides, virus, microsporidies). Alors que de nombreux laboratoires effectuent la microinjection, le montant exact injecté est souvent incertaine en raison des limitations techniques du système où le volume livré n’est pas mesurée directement11. Concentration et volume livré sont des paramètres essentiels qui permettent de calculer des mesures toxicologiques standard tels que CE50 ou CI50 ou pour définir un minimum efficace doses5,16. Ceci est particulièrement important dans les études fonctionnelles à l’aide d’Arni chez les insectes adultes, où livraison en se nourrissant n’entraîne pas toujours une exposition systémique aux particules souhaitées et la dose réelle traversant l’intestin moyen est peu claire5.
Tandis que la procédure de microinjection peut être difficile au départ, améliorations rapides en précision de vitesse et de la livraison sont obtenues avec la pratique et de la patience. Maîtriser la procédure d’injection elle-même est un investissement de temps, mais, une fois accomplies, la procédure produit des résultats reproductibles et la mortalité de la blessure de < 3 %. Le ratio d’injections réussies augmentera à mesure que la compétence augmente ce qui permet l’injection de 300 moustiques ou vole par jour.
Bon nombre des défis de microinjection résultent de l’aiguille utilisée. Déterminer la bonne aiguille capillaire point de rupture et l’angle de pointe est un aspect difficile de la procédure et nécessite quelques essais et erreurs pour déterminer la taille d’ouverture plus efficace pour une espèce donnée. La fine aiguille plus utile pour le microinjection de moustique (~ 150 µm) est trop petit pour livrer rapidement le plus grand volume injecté alors que l’inverse, l’aiguille plus grande ouverture que fonctionne sur les mouches (~ 250 µm) provoque des dommages aux petits moustiques, les mouches et la mortalité inacceptable d’injection. Une aiguille cassée avec une pointe émoussée est souvent difficile d’obtenir à travers la cuticule sans lésions tissulaires et une mortalité accrue. Échelles insectes ou des morceaux de tissus peut obstruer les aiguilles au cours d’une expérience, il est souvent utile d’avoir plusieurs aiguilles tirés si le remplacement est nécessaire. Nous avons trouvé qu’il est plus facile de remplacer une aiguille difficile plutôt que de passer du temps à essayer de dégager une aiguille coincée ou encrassée.
Observant la solution injectable entrer l’insecte est essentiel pour que les injections infructueuses peuvent être retirées (voir étapes 2.14-2,15). Ajout de la rhodamine B aux solutions d’injection fournit un visuel clair afin que la mise en scène froide insectes reçoivent le bon dosage et est particulièrement utiles en pratiquant (voir étape 2.7).
Les méthodes d’essai biologique injection et Ponte présentées ici ont induit avec succès gène coup de masse et mesurables des effets phénotypiques adultes Ae. aegypti et M. domestica qu’à ARN doubles brins conçus contre chaque espèce ribosomique transcription (Figure 4 et Figure 5 a). De plus, la capacité de cette méthode pour fournir avec précision microvolumes d’individus permet des courbes de réponse de dose à générer pour de petites quantités de matière (aussi bas que 50 ng ; Figure 5 b). Ceci est particulièrement utile pour les méthodes comme le dépistage des siARN ou ARN doubles brins, comme produisant de grandes quantités de ces molécules peut être prohibitif.
Cette méthode peut être modifiée pour injecter des agents biologiques (virus, bactéries, microsporidies) ou des pesticides chimiques, après s’être assuré que les mémoires tampons de livraison sont inoffensifs par injection. Volume de livraison est limitée par la taille de l’insecte, produisant des concentrés solutions de test sont important.
Pour évaluer correctement l’efficacité de l’ARNdb, il faut suivre également Ponte phénotypes mortelles peuvent se manifester seulement dans la descendance. Tel que présenté ici, tenant femelle Ae. aegypti séparément après la saignée permet de détermination de la taille individuelle embrayage et des tests complémentaires sur les mêmes personnes peuvent se faire en aval de la ponte (c.-à-d., des études d’expression génique, gonadotropes supplémentaires cycles, knockdown spécifiques de tissus) à la capacité reproductrice en corrélation avec d’autres mesures telles que l’expression des gènes. Comme M. domestica pondent généralement dans une réponse de groupe, incitation isolés mouches gravides à poser est travail très intensif et pas pratique pour un grand nombre d’individus17. Par conséquent, une méthode pour déterminer la taille de la ponte moyenne est présentée.
La méthode de microinjection présentée ici fournit délivrance systémique cohérente aux moustiques et mouches domestiques. Associée à la mortalité et de la ponte, suivi des essais biologiques, ces outils polyvalents peuvent servir à évaluer les effets phénotypiques et transcriptionnelles de petites molécules d’ARN, des agents biologiques et les pesticides traditionnels où l’administration par voie orale n’est pas viable.
Disclosures
Tous les auteurs sont employés ou fournisseurs de l’United States Department of Agriculture ou le ministère de la défense. Ce manuscrit a été produit au cours de ses fonctions officielles et où la loi dans le domaine public. Les opinions exprimées représentent l’opinion des auteurs et ne représentent pas une position officielle ou une approbation par le gouvernement américain. Mention d’un produit commercial n’est pas une recommandation d’utilisation.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Hanayo Arimoto (US Navy), Dana Johnson, Lucy Li et Roxie White (USDA-ARS) pour aident avec l’acquisition de données et d’analyse. Nous remercions également les Drs Pia Olafson (USDA-ARS) et Ke Wu (Université de la Floride) examen critique du manuscrit et Niklaus Hostettler (Université de la Floride) pour filmer les images de microscope. Financé par l’USDA, le projet WII - 141C de la marine et Marine Corps Public Health Center et le programme de Protection des combattants déployés guerre. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception ou de la direction de l’étude ou de développement du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| needle pulling | |||
| vertical pipette puller | Kopf | 720 | settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps |
| glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | capillaries for pulling glass needles |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microinjector station | |||
| Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | microinjector |
| manual micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-L | left hand KITE manipulator |
| magnetic stand | World Precision Instruments | M9 | holds micromanipulator |
| precision stereo zoom binocular microscope on boom stand | World Precision Instruments | PZMIII-BS | dissecting scope for microinjections |
| 1.5X objective | World Precision Instruments | 501377 | objective for microscope |
| light LED ring | World Precision Instruments | 504134 | light ring for injection microscope |
| laboratory chill table | BioQuip Products | 1431 | chill table for microinjections |
| microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | for staging insects while injections |
| Rhodamine B, 98+% | Acros Organics | AC296571000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mosquito oviposition bioassays | |||
| large Petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | for holding staging slides |
| plastic cup - 3 1/2 oz. | Dart Container Corporation | TK35 | mosquito oviposition bioassay cups |
| matte tulle fabric | Joanne Fabrics | 1103068 | caps for oviposition bioassays |
| blood source | locally acquired | typically bovine or live chickens | |
| 1 x 30mm clear edible collagen casing | Butcher and Packer | 30D02-05 | |
| heavy weight seed germination paper | Anchor Paper Co | SD7615L | |
| oral aspirator with HEPA filter | John W. Hock Company | 612 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| house fly oviposition bioassays | |||
| 4 L plastic food storage canister | Walmart | 555115143 | |
| 10-inch stockinette sleeve | Medonthego.com | FS15001H | |
| wheat bran | locally acquired | typically found at feed stores | |
| Calf Manna performance supplement | ValleyVetSupply.com | 16731 | pelleted livestock feed |
| dried egg yolk | BulkFoods.com | 40506 | |
| black cotton cloth | locally acquired | typically in craft supplies section | |
| 60 mL cup | Dart Container Corporation | P200-N |
References
- Whyard, S., et al. Silencing the buzz: a new approach to population suppression of mosquitoes by feeding larvae double-stranded RNAs. Parasites & Vectors. 8 (96), (2015).
- Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, carbon quantum dot, and silica nanoparticle mediated dsRNA delivery for gene silencing in Aedes aegypti: a comparative analysis. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
- Tang, T., et al. Stress-induced HSP70 from Musca domestica plays a functionally significant role in the immune system. Journal of Insect Physiology. 58 (9), 1226-1234 (2012).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. Journal of Applied Entomology. 136 (10), 741-748 (2012).
- Estep, A. S., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J. DsRNA-mediated targeting of ribosomal transcripts RPS6 and RPL26 induces long-lasting and significant reductions in fecundity of the vector Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 90, 17-26 (2016).
- Wen, D., et al. N-glycosylation of Viral E Protein Is the Determinant for Vector Midgut Invasion by Flaviviruses. mBio. 9 (1), (2018).
- Liu, Y., Cheng, G. Techniques for Experimental Infection of Mosquitoes with West Nile Virus. Methods in Molecular Biology. Colpitts, T. 1435, Humana Press. 151-163 (2016).
- Puglise, J. M., Estep, A. S., Becnel, J. J. Expression profiles and RNAi silencing of Inhibitor of Apoptosis transcripts in Aedes, Anopheles, and Culex mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 53 (2), 304-314 (2015).
- Sanscrainte, N. D., et al. Reduction in Musca domestica fecundity by dsRNA-mediated gene knockdown. PloS one. 13 (1), e0187353 (2018).
- Isoe, J., Collins, J., Badgandi, H., Day, W. A., Miesfeld, R. L. Defects in coatomer protein I (COPI) transport cause blood feeding-induced mortality in Yellow Fever mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), E211-E217 (2011).
- Drake, L. L., Price, D. P., Aguirre, S. E., Hansen, I. A. RNAi-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), (2012).
- Kurscheid, S., et al. Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila. BMC Molecular Biology. 10 (1), 20 (2009).
- Kim, M., Sim, C., Denlinger, D. L. RNA interference directed against ribosomal protein S3a suggests a link between this gene and arrested ovarian development during adult diapause in Culex pipiens. Insect molecular biology. 19 (1), 27-33 (2010).
- Atyame, C. M., et al. Comparison of irradiation and Wolbachia based approaches for sterile-male strategies targeting Aedes albopictus. PLoS one. 11 (1), e0146834 (2016).
- Becnel, J. J., Floore, T. G. Introduction to"Biorational Control of Mosquitoes.". Journal of the American Mosquito Control Association. 23, 1-2 (2007).
- Bolognesi, R., et al. Characterizing the mechanism of action of double-stranded RNA activity against western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). PloS one. 7 (10), e47534 (2012).
- Jiang, Y., et al. Semiochemicals from ovaries of gravid females attract ovipositing female houseflies, Musca domestica. Journal of Insect Physiology. 48 (10), 945-950 (2002).
